СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ, МАТРИЦА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/18 C12Q1/44 

Изобретение относится к биохимии и аналитической химии и касается получения и применения карбоксилэстеразы нового аналитического реагента для высокочувствительного определения микроколичеств фосфорорганических соединений (ФОС), в том числе пестицидов, в различных объектах окружающей среды с помощью матриц и методик.

Известен способ получения карбоксилэстеразы из листьев пшеницы путем экстракции буфером при рН 7,5 и отделения осадка [1]
Указанный способ является весьма трудоемким, требует дополнительной очистки от хлорофилла и не может быть использован в промышленных целях. Конечный препарат представляет собой водный экстракт, содержащий сложную белковую смесь с низким уровнем эстеразной активности.

Указанный способ является наиболее близким по технической сущности к заявляемому объекту и потому выбран авторами в качестве прототипа. Кроме того, указанный способ хотя и позволяет получать препарат, пригодный для использования в колориметрических методиках, однако не гарантирует получение препарата с эксплуатационными характеристиками, необходимыми при его использовании в матрицах для анализа ФОС, а именно из-за неудовлетворительной смачиваемости матрицы в воде снижается чувствительность анализа и воспроизводимость результатов.

Целью изобретения является разработка способа промышленного получения препарата фермента с улучшенными эксплуатационными характеристиками для использования в матрицах и методиках.

Сущность изобретения состоит в том, что в отличие от известного способа получения препарата, в котором измельченные листья пшеницы экстрагируют 0,05 М трис-буфером рН 7,5 в соотношении 1:5 (масса:объем) в течение 30 мин. Осадок отделяют фильтрацией через капрон и центрифугируют 45 мин при N 18000 об. /мин. Надосадочная жидкость без дальнейшей очистки использовали в качестве аналитического реагента. В заявляемом способе экстракцию проводят при рН 7,6; осадок отделяют, а после ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сорбенте проводят высаливание фермента сульфатом аммония при степени насыщения 0,7, активную фракцию диализуют и высушивают. Экстракцию фермента проводят водой при рН 7,6. Так как при последующем добавлении сухого ДЕАЕ-сорбента происходит закисление экстракта до оптимального значения рН, при котором происходит эффективная сорбция фермента. Дополнительная очистка препарата путем высаливания сульфатом аммония с последующим диализом раствора фермента позволяет избавиться от примесей, присутствие которых ухудшает смачиваемость матрицы.

Полученный заявляемым способом препарат используется при получении матриц, применяемых в различных уже существующих, а также вновь разрабатываемых индикаторных устройствах (индикаторных трубках, лентах, бумагах и т. д. ) для экспресс-обнаружения фосфорорганических соединений в различных средах: вода, воздух, экстракты органическими растворителями.

П р и м е р 1. Способ получения карбоксилэстеразы.

800 г зерен пшеницы (без примесей семян сорняков) непосредственно перед началом выделения размельчают на мельнице. Полученную муку экстрагируют 8 л дистиллированной воды с рН 7,6 в течение 1 ч при 18^оС. Полученную суспензию оставляют на несколько часов при 5-10^оС, а затем декантируют. К надосадочной жидкости добавляют сухой ДЕАЕ-сорбент, например сефадекс А-50, в количестве 6 г и перемешивают 30 мин. Суспензию декантируют. Осадок геля дважды промывают 20 мМ раствором трис-буфера рН 7,3, осадок переносят в колонку и элюируют 0,7 М раствором хлористого натрия в том же буфере. В элюате, содержащем фермент, проводят высаливание сульфатом аммония: осадок, образующийся при степени насыщения 0,35 отбрасывают, супернатант доводят до степени насыщения 0,7, осадок растворяют в минимальном объеме 20 мМ трис-буфера рН 7,3. Раствор фермента диализуют против того же буфера и лиофильно высушивают. Препарат карбоксилэстеразы представляет собой порошок белого или светло-серого цвета, без запаха, хорошо растворимый в воде. Выход препарата по активности составляет на менее 50% от исходной (в способе-прототипе 30%).

П р и м е р 2. Аналогичен примеру 1 за исключением того, что на стадии экстракции используют измельченные зерна ячменя. Выход препарата по активности составляет 48% от исходной. В табл.1 приведена характеристика карбоксилэстеразы, полученной по способу-прототипу и заявляемым способом.

Использование данного способа позволяет получить препарат с улучшенными характеристиками для использования в матрицах. Кроме того, данный способ может быть использован для промышленного получения фермента.

Полученный заявляемым способом препарат карбоксилэстеразы может быть использован в составе индикаторных рецептур для создания матриц, применяемых для экспресс-анализа ФОС.

Известна матрица, используемая для определения фосфорорганических ингибиторов в воде [2] Матрица выполнена в виде подложки (хроматографической бумаги) с нанесенными на нее субстратом (бутирилхолинйодидом), индикатором (бромтимоловым синим), а в качестве основного аналитического реагента используется эстераза-бутирилхолинэстераза сыворотки крови лошади в виде раствора. Процедура анализа следующая: исследуемую пробу ингибитора, например, диизопропилфторфосфата смешивают с раствором эстеразы, инкубируют в течение определенного времени и на инкубируемую смесь накладывают кусочки хроматографической бумаги, пропитанной субстрат-индикаторной смесью. В контроле вместо ингибитора используется дистиллированная вода. Присутствие ингибитора регистрируется визуально по разнице окраски пробы и контроля в течение наблюдаемого времени. Существенным недостатком описанной матрицы является необходимость приготовления раствора эстеразы перед каждой серией анализов, что повышает трудоемкость и снижает производительность анализа, а также характеризуется низкой воспроизводимостью результатов анализа по сравнению с заявляемой матрицей. Матрица для анализа ФОС может быть реализована в виде одно- или двухэлементного устройства, что поясняется следующими примерами.

П р и м е р 3. Матрица одноэлементная. Изготовление матрицы.

Бумажную подложку пропитывают буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы, а именно: сначала готовят раствор индикатора, например, дихлориндофенолята натрия 0,3 мг/мл в буфере, например, 0,3 М фосфатном рН 8,7, затем в полученный раствор добавляют заданное количество фермента. Пропитанную полученным раствором подложку сушат при температуре не выше 48^оС в течение 2,5 ч. Далее высушенную подложку пропитывают раствором субстрата, например, 1-тионафтилацетата (20 мг/мл) в неполярном органическом растворителе, например бензоле, и повторно высушивают при температуре не выше 30^оС.

П р и м е р 4 аналогичен примеру N 3 за исключением того, что вместо бумаги в качестве подложки используют хлопчатобумажную ленту.

П р и м е р 5 аналогичен примеру 3 за исключением того, что в качестве подложки используют синтетическую ленту.

П р и м е р 6. Матрица двухэлементная. Изготовление матрицы.

Бумажную подложку (подложка N1) пропитывают буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы, а именно: сначала готовят раствор индикатора, например, дихлориндофенолята натрия 0,3 мг/мл в буфере, например, 0,3 М фосфатном рН 8,7, затем в полученный раствор добавляют заданное количество фермента. Пропитанную полученным раствором подложку сушат при температуре не выше 48^оС в течение 2,5 ч. Бумажную подложку (подложка N2) пропитывают раствором субстрата, например, 1-тионафтилацетата (20 мг/мл) в неполярном органическом растворителе, например, бензоле и высушивают при температуре не выше 30^оС. Подложки 1 и 2 одинаковы по размеру.

П р и м е р 7 аналогичен примеру 6 за исключением того, что в качестве подложки используется хлопчатобумажная лента.

П р и м е р 8 аналогичен примеру 6 за исключением того, что в качестве подложки используется синтетическая лента.

П р и м е р 9. Аналогичен примеру 6 за исключением того, что раствора субстрата в органическом растворителе помещен в любое устройство, позволяющее его дозированное прикапывание на подложку N 1.

П р и м е р 10. Матрица одно- или двухэлементная с дополнительной пропиткой, например раствором кремнезоля. Изготовление матрицы аналогично примерам 3-9 за исключением того, что перед пропиткой подложки N 1 буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы подложку пропитывают раствором кремнезоля заданной концентрации. Примечание. Количественное соотношение компонентов в пропиточной растворе для изготовления матриц, описанных в примерах 3-10, подбирают в соответствии с заданной чувствительностью анализа. Проведение анализа ФОС с помощью матриц в различных средах появляется следующими примерами:
П р и м е р 11. Проведение анализа по обнаружению ФОС в воде с помощью одноэлементной матрицы. Для анализа берут две матрицы, из которых одну смачивают в дистиллированной воде (контрольная матрица), вторую в водном растворе анализируемой пробы (опытная матрица), через определенное время наблюдают индикационный эффект. Индикационный эффект заключается в обесцвечивании контрольной матрицы и сохранении исходной окраски опытной матрицы в случае наличия ФОС в исследуемой пробе. При отсутствии ФОС опытная матрица обесцвечивается одновременно с контрольной.

П р и м е р 12. Проведение анализа по обнаружению ФОС в воде с помощью двухэлементной матрицы. Аналогичен примеру 11, за исключением того, что в дистиллированной воде и анализируемой пробе смачивается подложка, пропитанная буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы и после инкубации в течение 1-5 мин, эти подложки совмещают с подложками, содержащими субстрат. Через определенное время наблюдают индикационный эффект.

П р и м е р 13. Проведение анализа по обнаружению ФОС в органических экстрактах с помощью одноэлементной матрицы. Аналогично примеру 11 за исключением того, что контрольную матрицу смачивают в чистом органическом растворителе, а опытную в органическом экстракте анализируемой пробы. Обе матрицы высушивают на воздухе и смачивают в дистиллированной воде. Через определенное время наблюдают индикационный эффект.

П р и м е р 14. Проведение анализа по обнаружению ФОС в органических экстрактах с помощью двухэлементной матрицы. Аналогично примеру 12 за исключением того, что подложку, пропитанную индикаторно-буферным раствором карбоксилэстеразы (подложка N 1), предварительно смачивают: контрольную в чистом растворителе, опытную в органическом экстракте анализируемой пробы. Обе подложки высушивают на воздухе и после этого смачивают в дистиллированной воде и далее аналогично анализу в воде (пример 12). Примечание. Использование контрольной матрицы в примерах 11-14 не является обязательным, поскольку в сертификатах к матрицам указывается время обесцвечивания в дистиллированной воде.

П р и м е р 15. Проведение анализа ФОС в воздухе с помощью одно- и двухэлементной матрицы. Поглощение ФОС из воздуха может быть осуществлено с помощью барботирования через растворитель (вода, органический растворитель). Далее анализ проводят: водных проб аналогично примерам 11-12; органических экстрактов аналогично примерам 13-14.

П р и м е р 16. Проведение анализа ФОС в воздухе с помощью одно- или двухэлементной матрицы, содержащей, например, кремнезоль.

Матрицу, приготовленную описанным в примере 10 способом, закрепляют в любом устройстве, обеспечивающим продувку воздуха требуемого объема, например-ручной насос. После продувки воздуха подложку извлекают из устройства и смачивают в дистиллированной воде. В случае одноэлементной матрицы индикационный эффект заключается в сохранении исходной окраски матрицы в зоне прососа воздуха, что свидетельствует о наличии ФОС в анализируемом воздухе (окрашенное пятно на белом фоне). В случае двухэлементной матрицы воздух продувают через подложку, содержащую фермент, после чего ее извлекают из устройства и смачивают в дистиллированной воде, инкубируют 1-5 мин и совмещают с подложкой, содержащей субстрат. Через определенное время наблюдают индикационный эффект. Примечение. При анализе воздуха могут быть использованы индикаторные трубки с помещенной внутрь матрицей, содержащей в индикаторной рецептуре карбоксилэстеразу злаковых культур.

С помощью матриц, описанных в примерах 3-10 можно проводить биохимический анализ по обнаружению ФОС общей форму- лы P что поясняется следующими примерами.

П р и м е р 17. Биохимическое обнаружение ФОС, таких как ярмин, фосфакол, диизопропилфосфат, карбофос, фталофос, антис, фозалон, метафос, базудин и т.д. с использованием матриц. К 100 мл водно-ацетонового экстракта, содержащего анализируемое вещество, приливают 20 мл 1М раствора соли плавиковой кислоты, например, фторида калия, перемешивают и выдерживают 20-30 мин, после чего приливают 2-5 мл органического растворителя, например гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин. Гексановый слой подвергают анализу с использованием одно- или двухэлементной матрицы аналогично примерам 13-14. Чувствительность обнаружения ФОС с использованием матрицы приведена в табл.2.

Известно, что эстеразы используются также в биохимических колориметрических методиках определения ФОС [3] В качестве эстеразы используют ферменты животного происхождения: бутирилхолин-эстеразу сыворотки крови лошадей или ацетилхолинэстеразу эритроцитов. Анализ проводится путем смешения раствора пробы, исследуемой на содержание ФОС, с раствором эстеразы, инкубацией в течение определенного времени, добавлением субстрата и фотоколориметрирования пробы на спектрофотометре. Расчет концентрации ингибитора в пробе осуществляют по калибровочной кривой, представляющей собой функцию экстинции от концентрации. Указанный аналог выбран в качестве прототипа. Карбоксилэстераза, как аналитический реагент, может использоваться в колориметрическом анализе, в визуальных и инструментальных методиках, что поясняется следующими примерами.

П р и м е р 18. Биохимический способ количественного определения ФОС, например, армина, колориметрическим методом по реакции гидролиза субстрата, например, 1-тионафтилацетата карбоксил-эстеразой 1. Определение активности карбоксилэстеразы (Al). В спектрофотометрическую кювету, термостатируемую при 35^оС вносят 1 мл раствора карбоксилэстеразы в 0,3 М фосфатном буфере с рН 8,0, 0,1 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора 1-тионафтилацетата с концентрацией 3 ·10^-4 М. Прирост оптической плотности в единицу времени (ΔД1) наблюдают на длине волны 335 нм в течение, например, 5 мин. При добавлении реагента на SH-группы прирост оптической плотности наблюдают на длине волны поглощения индикатора.

2. Определение активности карбоксилэстеразы в присутствии анализируемой пробы (А2). В спектрофотометрическую кювету, термостатируемую при 35С вносят 1 мл раствора карбоксилэстеразы в 0,3 М фосфатном буфере с рН 8,0; 0,1 мл анализируемой пробы, например, раствор армина, инкубируют 10 мин. и добавляют 1 мл раствора субстрата. Прирост оптической плотности ( ΔД2) наблюдают как описано в п.1.

3. Обработка результатов. Рассчитывают активность препарата в отсутствие и в присутствии анализируемой пробы по формуле
A E/мг Е/мг, (1) где ΔD прирост оптической плотности за 1 мин при ферментативном гидролизе субстрата;
V1 объем реакционной смеси, мл;
V2 объем раствора фермента, мл;
К коэффициент молярной экстинкции субстрата;
С концентрация фермента, мг/мл.

По приведенной выше формуле рассчитывают A1 и А2. Далее рассчитывают степень угнетания активности карбоксилэстеразы (J,) анализируемой пробой по формуле
J • 100% (2) По калибровочному графику зависимости J, от С (концентрация определяемого вещества, мг/мл) находят искомую концентрацию анализируемого вещества, соответствующую рассчитанной по формуле (2) степени угнетания.

П р и м е р 19. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют 2-тионафтилацетат.

П р и м е р 20. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют тиофенилпропионат.

П р и м е р 21. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют индофенилацетат.

П р и м е р 22. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют 1-нафтилацетат, а измерение проводят флуориметрическим методом.

П р и м е р 23. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют 2-нафтилацетат, измерение проводят флуориметрическим методом.

П р и м е р 24. Аналогичен примеру 18, за исключением того, что в качестве субстрата используют N-метилиндоксилацетат.

Как показано в примерах 18-24, в качестве субстратов карбоксилэстеразы могут использоваться сложные эфиры общей формулы ROC(O)R₁ и ROC(S)R₁, где R фенил, нафтил 1 или 2, R₁ метил или этил.

Приведенные примеры показывают, что карбоксилэстераза растительного происхождения может быть с успехом использована в качестве аналитического реагента для определения большого круга ФОС с высокой специфичностью как индивидуальной, так и групповой, в различных средах: в воде, воздухе, органических растворителях. Все изложенное выше показывает, что карбоксилэстераза может заменить эстеразы животного и микробного происхождения в средствах и методиках анализа ФОС.

Использование: биохимия и аналитическая химия и касается получения и применения карбоксилэстеразы из зерен злаков аналитического реагента, для высокочувствительного определения микроколичеств фосфорорганических соединений (ФОС) в различных объектах окружающей среды с помощью матриц и методик. Сущность изобретения: измельченные зерна злаков экстрагируют водой при рН 7,6, осадок отделяют, после ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - сорбенте проводят высаливание фермента сульфатом аммония при степени насыщения 0,7, диализуют и высушивают. Полученную карбоксилэстеразу используют для создания одно- и двухэлементных матриц, включающих подложку с нанесенными компонентами субстрат - индикаторной системы. Матрица является универсальным средством для обнаружения ФОС общей формулы:

в различных объектах окружающей среды: в воде, воздухе, экстрактах органическими растворителями. Кроме того, карбоксилэстераза из измельченных зерен злаковых культур использована для количественного определения ФОС, включающего измерение активности фермента, в отсутствии и в присутствии анализируемой пробы, в реакции гидролиза субстратов общей формулы ROC(O)R₁ и ROC(S)R₁, где R - фенил, нафтил 1 и 2, R₁-CH₃, C₂H₅. Методики с использованием карбоксилэстеразы отличаются высокой чувствительностью обнаружения ФОС и высокой устойчивостью к мешающим примесям. Карбоксилэстераза растительного происхождения может с успехом заменить в простейших средствах и методиках анализа ФОС эстеразы животного (БуХЭ, АХЭ, ПХЭ) и микробного происхождения. 3 с. п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения карбоксилэстеразы, предусматривающий измельчение исходного растительного сырья злаковых культур, экстракцию, отделение осадка и очистку, отличающийся тем, что экстрагируют фермент из измельченных зерен злаковых культур при рН 7,6, очистку ведут хроматографией на ДЭАЕ-сорбенте с последующим высаливанием сульфатом аммония при степени насыщения 0,7, и диализуют. 2. Матрица для обнаружения фосфорорганических соединений, выполненная в виде положки с компонентами субстрат-индикаторной системы с использованием эстеразы для обнаружения фосфорорганических соединений общей формулы

в различных средах, отличающаяся тем, что в качестве субстрата используют сложные эфиры общей формулы ROC(O)R₁ и ROC(S)R₁, где R фенил, нафтил 1 и 2, R₁ метил или этил, а в качестве экстеразы используют карбоксилэстеразу из зерен злаковых культур. 3. Биохимический способ количественного определения фосфорорганических соединений, включающий измерение активности эстеразы в реакции гидролиза субстрата в отсутствии и в присутствии анализируемой пробы и сравнение результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве эстеразы используют карбоксилэстеразу из зерен злаковых культур, а в качестве субстрата сложные эфиры общих формул ROC(O)R₁ и ROC(S)R₁, где R фенил, нафтил 1 и 2, R₁ метил или этил.