СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ, МАТРИЦА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C12N9/18 C12Q1/44 G01N31/22 

Группа изобретений связана единым изобретательским замыслом и относится к биохимии и аналитической химии.

Группа изобретений направлена на получение и применение карбоксилэстеразы – фермента - аналитического реагента для высокочувствительного определения микроколичеств фосфорорганических соединений (ФОС), в том и числе пестицидов, в различных объектах окружающей среды карбоксилэстеразы с помощью матриц.

Известен способ получения карбоксилэстеразы из листьев пшеницы путем экстракции буфером при рН 7,5 и отделения осадка (Физиология и биохимия культурных растений 1983, 15, N 1, с.28-32). Указанный способ является весьма трудоемким, требует дополнительной очистки от хлорофилла и не может быть использован в промышленных целях. Конечный препарат представляет собой водный экстракт, содержащий сложную белковую смесь с низким уровнем эстеразной активности.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу является известный способ получения карбоксилэстеразы (КЭРС), предусматривающий измельчение исходного растительного сырья злаковых культур, экстракцию, отделение осадка и очистку. Фермент экстрагируют из измельченных зерен злаковых культур при рН 7,6; очистку ведут хроматографией на ДЭАЕ-сорбенте с последующим высаливанием сульфатом аммония при степени насыщения 0,7, и диализуют. (Патент РФ № 2057807C1 на изобретение «СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ, МАТРИЦА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ», опубл. 10. 041.1996, МПК C12N 9/18). Известный способ характеризуется высокой трудоемкостью недостаточно высокой активностью фермента карбоксилэстеразы (КЭРС).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является разработка эффективного способа получения карбоксилэстеразы.

Технический результат, достигаемый в результате решения поставленной задачи, заключается в повышении активности конечного продукта – карбоксилэстеразы.

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения карбоксилэстеразы включает: измельчение исходного растительного сырья злаковых культур, экстракцию, отделение осадка и очистку на ДЭАЕ-сорбенте с последующим высаливанием. Экстракцию и очистку на ДЭАЕ-сорбенте осуществляют фосфатным буферным раствором, высаливание осуществляют хлористым натрием, а полученный раствор концентрированного фермента центрифугируют.

Предпочтительно, чтобы экстракцию производили с рН=7,5 в течение одного часа при t=28÷30°С, после чего суспензию выдерживали в течение 18÷20 часов, затем надосадочную жидкость сливали, отжимали осадок, отфильтровывали, измеряли ph полученного раствора и доводили его до рН = 7,6±0,05 путем добавления раствора гидроокиси натрия при перемешивании и t=24÷26°С.

Предпочтительно также, чтобы ДЭАЕ-сорбент добавляли порциями по 0,5÷1,0 г при интенсивном перемешивании, после чего суспензию перемешивали в течение одного часа, затем сорбент осаждали в течение одного часа, декантировали, осадок трижды промывали 0,05М фосфатным буферным раствором, отфильтровывали, промывали водным раствором хлористого натрия, добавляли навеску хлористого натрия, растирали, выдерживали в течение 40÷50 минут, отфильтровывали, полученный раствор центрифугировали и определяли активность полученного фермента.

Предпочтительно также, чтобы в качестве ДЭАЕ-сорбента использовали сорбент Sephadex DEAE-A-50.

Предпочтительно также, чтобы фильтрацию осадка и полученного раствора фермента осуществляли на воронке Бюхнера с бязевым и/или бумажным фильтром.

Сопоставительный анализ заявляемого изобретения с прототипом показал, что во всех случаях исполнения, оно отличается от известного, наиболее близкого технического решения:

- осуществлением экстракции и очистки на ДЭАЕ-сорбенте фосфатным буферным раствором;

- осуществлением высаливания хлористым натрием;

- центрифугированием полученного раствора концентрированного фермента.

В предпочтительных случаях исполнения изобретение отличается от известного, наиболее близкого технического решения:

- осуществлением экстракции с рН=7,5 в течение одного часа при t=28÷30°С; последующими: выдерживанием в течение 18÷20 часов; сливанием надосадочной жидкости; отжиманием осадка, отфильтровыванием, измерением ph полученного раствора, доведением его до рН=7,6±0,05 путем добавления раствора гидроокиси натрия при перемешивании и t=24÷26°С;

- добавлением ДЭАЕ-сорбента порциями по 0,5÷1,0 г при интенсивном перемешивании с дальнейшими: перемешиванием суспензии в течение одного часа; осаждением сорбента в течение одного часа; декантированием; троекратным промыванием полученного осадка 0,05М фосфатным буферным раствором; отфильтровыванием; промыванием водным раствором хлористого натрия, добавлением навески хлористого натрия, растиранием, выдерживанием в течение 40÷50 минут, отфильтровыванием; центрифугированием полученного раствора и определением активности полученного фермента;

- использованием сорбента Sephadex DEAE-A-50 в качестве ДЭАЕ-сорбента,

- осуществлением фильтрации осадка и полученного раствора фермента на воронке Бюхнера с бязевым и/или бумажным фильтром.

Осуществление экстракции и очистки на ДЭАЕ-сорбенте фосфатным буферным раствором, высаливание хлористым натрием и центрифугирование полученного раствора концентрированного фермента обеспечивает повышение активности конечного продукта до 10-14Е/мл, что позволяет повысить чувствительность методов и средств при количественном и качественном определения ФОС. Повышение чувствительности при количественном определении ФОС выражается в снижении порога определения ФОС в пробах и на средствах индикации; повышение чувствительности при качественном определении ФОС выражается в усилении визуального эффекта на средствах индикации и в растворах.

Осуществление экстракции с рН=7,5 в течение одного часа при t=28÷30°С; последующее выдерживание в течение 18÷20 часов; сливание надосадочной жидкости; отжимание осадка, отфильтровывание, измерение рН полученного раствора, доведение его до рН=7,6±0,05 путем добавления раствора гидроокиси натрия при перемешивании и t=24÷26°С позволяет повысить степень экстрагирования фермента в раствор, что обеспечивает повышение активности конечного продукта до10-14 Е/мл.

Осуществление добавления сорбента небольшими порциями по 0,5÷1,0 г при интенсивном перемешивании с дальнейшими: перемешиванием суспензии в течение одного часа обеспечивает равномерное распределение гранул сорбента в растворе и предотвращает образование комочков сорбента и их налипание на перемешивающее устройство. Осаждение сорбента в течение одного часа; декантирование; троекратное промываниее полученного осадка 0,05М фосфатным буферным раствором; отфильтровывание; промывание водным раствором хлористого натрия, добавление навески хлористого натрия, растирание, выдерживание в течение 40-50 минут, отфильтровывание; центрифугирование полученного раствора и определение активности полученного фермента позволяет увеличить концентрацию фермента в растворе, что также влияет на повышение активности конечного продукта до10-14 Е/мл.

Использование в качестве ДЭАЕ-сорбента модифицированного сефадекса Sephadex DEAE-A-50, у которого размеры пор гораздо выше, чем у других сорбентов сефадексов, позволяет увеличить сорбцию фермента (КЭРС) из раствора и затем выделение его при помощи хлористого натрия.

Осуществление фильтрации осадка и полученного раствора фермента на воронке Бюхнера с бязевым и/или бумажным фильтром упрощает получение раствора фермента с высокой активностью.

Пример осуществления способа.

Измельчают 500 г. пшеницы, полученную муку экстрагируют фосфатным буферным раствором (0,05 М с pH=7,5) в течение одного часа при t=28÷30°C. Получают буферный раствор в объеме 5 л. Выдерживают суспензию в течение 12÷18 часов при 5°С. Супернатант (надосадочную жидкость) сливают, отжимают осадок, жидкости соединяют, отфильтровывают на воронке Бюхнера через двойной бязевый и бумажный фильтр. Выход составляет порядка 4,5 л. Измеряют pH полученного раствора (ph=6,6±0,02), доводят до pH=7,6±0,05 добавлением 0,2М раствора гидроокиси натрия при перемешивании и t=24÷26°C. При интенсивном перемешивании небольшими порциями добавляют 6 г. сорбента Sephadex DEAE-A-50. Суспензию перемешивают в течение 1 часа. Сорбент оседает в течение 1 часа. После этого надосадочную жидкость декантируют (сливают при помощи шланга), а осадок трижды промывают 0,05 М фосфатным буферным раствором. Общий объем буфера для промывки 10 л ( 4 л+4 л+2 л). Осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера с бумажным фильтром. Полученный осадок промывают в 100 мл 0,5% раствора хлористого натрия в воде. Отфильтровывают на воронке Бюхнера с бумажным фильтром. После выключения насоса к осадку на фильтре добавляют навеску 10 г. хлористого натрия, аккуратно растирают и оставляют на 40÷50 минут. По истечении заданного времени жидкообразную массу отфильтровывают на этой же воронке Бюхнера в небольшую колбу Бунзена. Получают примерно 40÷45 мл темно-коричневого концентрированного раствора фермента карбоксилэстеразы (КЭРС). Полученный раствор фермента центрифугируют. Активность полученного концентрата фермента, определенная разработанной заявителем методике, составляет 10÷14 Е/мл.

Полученный заявляемым способом препарат карбоксилэстеразы может быть использован в составе индикаторных рецептур для создания матриц, применяемых для экспресс-анализа ФОС.

Известны различные портативные системы для экспресс-анализа большого числа различных по химической природе загрязняющих веществ. Например, индикаторные трубки, индикаторная бумага, комплекты и матрицы для качественного и/или количественного определения содержания нефтепродуктов, ФОС, окиси и двуокиси углерода, масла, топлив и других примесей в газовой и жидких средах (патент РФ № 2364863 на изобретение «ИНДИКАТОРНЫЙ ПЛОСКИЙ ЭЛЕМЕНТ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ, НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ ИНДИКАТОРНЫЙ ПЛОСКИЙ ЭЛЕМЕНТ, КОМПЛЕКТ И СПОСОБ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА ВОЗДУХ», МПК G01N 31/00, опубл. 20.08.2009).

Известна матрица, используемая для определения фосфорорганических ингибиторов в воде, выполненная в виде подложки (хроматографической бумаги) с нанесенными на нее субстратом (бутирилхолинйодидом), индикатором (бромтимоловым синим), а в качестве основного аналитического реагента используется эстераза-бутирилхолинэстераза сыворотки крови лошади в виде раствора. Процедура анализа следующая: исследуемую пробу ингибитора, например, диизопропилфторфосфата смешивают с раствором эстеразы, инкубируют в течение определенного времени и на инкубируемую смесь накладывают кусочки хроматографической бумаги, пропитанной субстрат-индикаторной смесью. В контроле вместо ингибитора используется дистиллированная вода. Присутствие ингибитора регистрируется визуально по разнице окраски пробы и контроля в течение наблюдаемого времени (патент РФ № 2057807 на изобретение «СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ, МАТРИЦА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ», МПК C12N 9/18, опубл. 10.04.1996 г). Существенным недостатком описанной матрицы является необходимость приготовления раствора эстеразы перед каждой серией анализов, что повышает трудоемкость и снижает производительность анализа, а также характеризуется низкой воспроизводимостью результатов анализа.

Известна наиболее близкая по совокупности существенных признаков и выбранная в качестве прототипа матрица для обнаружения фосфорорганических соединений, выполненная в виде подложки с компонентами субстрат-индикаторной системы с использованием эстеразы для обнаружения ФОС общей формулы в различных средах. В качестве подложки используют бумагу, хлопчатобумажную или синтетическую ленту. В качестве экстеразы используют карбоксилэстеразу из зерен злаковых культур, а в качестве субстрата используют сложные эфиры общей формулы ROC(O)R₁ и ROC(S)R₁, где R фенил, нафтил 1 и 2, R₁ метил или этил (патент РФ №2057807 на изобретение «СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ, МАТРИЦА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ», МПК C12N 9/18, опубл. 10.04.1996 г.). Известная матрица характеризуется недостаточно высокой степенью чистоты подложки, на которой могут оставаться различные примеси, влияющие на биохимические процессы, а также относительно небольшой площадью сорбционной поверхности подложки, что отрицательно сказывается на точности определения содержания ФОС и активности фермента.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является разработка эффективной матрицы для экспресс-анализа ФОС.

Технический результат, достигаемый в результате решения поставленной задачи, заключается в повышении результативности матрицы путем повышения точности определения содержания ФОС и активности фермента за счет повышения степени чистоты подложки и увеличения площади ее сорбционной поверхности .

Указанный технический результат достигается тем, что матрица для обнаружения фосфорорганических соединений выполнена в виде подложки с компонентами субстрат-индикаторной системы с использованием карбоксилэстеразы (КЭРС) для обнаружения фосфорорганических соединений общей формулы в различных средах. В качестве субстрата используют сложные эфиры общей формулы ROC(O)R 1 и ROC(S)R 1, где R фенил, нафтил 1 и 2, R 1 метил или этил, а в качестве подложки используют обработанное хромовой смесью, промытое дистиллированной водой и высушенное дробленое нейтральное стекло с размером фракций 0,40÷ 0,63 мм.

Предпочтительно, чтобы в качестве нейтрального стекла было использовано стекло марки НС-1 с содержанием химического состава в массовых долях, %:

- SiO- SiO2 73,00 ± 0,50 - Al- Al2О3 4,50 ± 0,20 - B- B2 O3 4,00 ± 0,25^; - Сумма СаО, МgО - Сумма СаО, МgО 8,00 ± 0,30; - Na- Na2O 8,50 ± 0,25; - K- K2О 2,00 ± 0,20.

Предпочтительно, чтобы в качестве карбоксилэстеразы использовали карбоксилэстеразу из растительного сырья злаковых культур.

Предпочтительно, чтобы матрица содержала герметичную упаковку в виде стеклянного флакона.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМИНОВ.

ХРОМОВАЯ СМЕСЬ - раствор бихромата калия или натрия (К2Cr2О7, Na2Cr2О7) в концентрированной серной кислоте. Большой энциклопедический словарь https://dic.academic.ru/contents.nsf/enc3p/.

СТЕКЛО МАРКИ НС -1 – нейтральное стекло, химический состав которого содержит в массовых долях, %: SiO2 - 73,00 ± 0,50; Al2О3- 4,50 ± 0,20; B2O3 - 4,00 ± 0,25; Сумма СаО + МgО - 8,00 ± 0,30; Na2O- 8,50 ± 0,25; K2О -2,00 ± 0,20 (ГОСТ 19808-86 «СТЕКЛО МЕДИЦИНСКОЕ» , п.1, 2, табл. 1).

Сопоставительный анализ заявляемого изобретения с прототипом показал, что во всех случаях исполнения оно отличается от известного, наиболее близкого технического решения:

- использованием дробленного нейтрального стекла в качестве подложки;

- размером фракций дробленного нейтрального стекла, составляющим диапазон 0,40÷ 0,63 мм;

- выполнением дроблённого стекла обработанным хромовой смесью, промытым дистиллированной водой и высушенным.

В предпочтительных случаях исполнения изобретение отличается от известного, наиболее близкого технического решения:

- использованием в качестве нейтрального стекла стекло марки НС-1 с содержанием химического состава в массовых долях, %:

SiO2 73,00 ± 0,50 Al2О3; 4,50 ± 0,20 B2 O3 4,00 ± 0,25; Сумма СаО, МgО 8,00 ± 0,30; Na2O 8,50 ± 0,25; K2О 2,00 ± 0,20.

Использование дробленного стекла (стеклянной крошки) позволяет существенно повысить сорбционную площадь подложки для нанесения фермента, и, как следствие, повысить концентрацию фермента на матрице.

Использование нейтрального стекла для приготовления крошки позволяет избежать негативного воздействия окружающей среды, которое может отрицательно сказаться на результатах анализа.

Использование дробленного нейтрального стекла с размером фракций, составляющими диапазон 0,40÷0,63 мм позволяет обеспечить оптимальную поверхность для нанесения раствора фермента и последующего максимального смыва фермента. Оптимальный размер фракций дробленого стекла в диапазоне 0,40÷0,63 мм установлен опытным путем. При использовании более крупной фракции дробленого стекла 0,60÷ 0,80 мм уменьшается площадь смачивания ферментом, что понижает концентрацию и активность фермента в матрице, а использование более мелкой фракции дробленого стекла 0,16÷0,25 мм усложняет работу при анализах - при смывании с матрицы образуется мутный раствор (взвесь стеклянной пыли), мешающий дальнейшей работе с матрицей.

Выполнение дробленного нейтрального стекла, обработанным хромовой смесью, промытым дистиллированной водой и высушенным, обеспечивает необходимую степень чистоты, позволяя повысить результативность анализа и активность фермента .

Использование карбоксилэстеразы из растительного сырья злаковых культур позволяет снизить трудозатраты на изготовление матрицы и ее себестоимость.

Наличие герметичной упаковки позволяет сохранить заданные технические характеристики в течение не менее 2-х лет.

Предложенная матрица может применяться в различных индикаторных средствах (трубки, бумага) для экспресс-обнаружения фосфорорганических соединений в различных средах: вода, воздух, экстракты органическими растворителями. Матрица может быть использована, например, в индикаторных трубках для контроля содержания пестицидов (карбофос, хлорофос).

Матрицу изготавливают следующим образом. Дробленное нейтральное стекло с размером фракций 0,40÷0,63 мм обрабатывают хромовой смесью, дистиллированной водой и высушивают, после чего пропитывают ферментом КЭРС, предпочтительно из растительного сырья злаковых культур. Использование матрицы с подложкой из дробленого стекла позволяет увеличить концентрацию и, соответственно, активность фермента путем неоднократного нанесения на стекло раствора фермента и последующего высушивания. В зависимости от концентрации КЭРС, наносимой на стеклянную крошку, можно получить ряд матриц с различной активностью фермента КЭРС. Матрицу, представляющую собой стеклянную крошку, импрегнированную раствором КЭРС определенной концентрации, герметично упаковывают в стеклянный флакон (аналогично пенициллину). Матрица не требует особых условий хранения, сохраняет заданные технические характеристики не менее 2 лет, удобна в эксплуатации.

Известен выбранный в качестве прототипа способ изготовления матрицы для обнаружения фосфорорганических соединений, включающий обработку подложки ферментом карбоксилэстеразы и высушивание. В качестве подложки используют бумажную подложку, хлопчатобумажную или синтетическую ленту, которые пропитывают буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы. Сначала готовят раствор индикатора, например, дихлориндофенолята натрия 0,3 мг/мл в буфере, например, 0,3 М фосфатном рН 8,7, затем в полученный раствор добавляют заданное количество фермента. Пропитанную полученным раствором подложку сушат при температуре не выше 48^оС в течение 2,5 ч. Далее высушенную подложку пропитывают раствором субстрата, например, 1-тионафтилацетата (20 мг/мл) в неполярном органическом растворителе, например бензоле, и повторно высушивают при температуре не выше 30^оС (патент РФ № 2057807 на изобретение «СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ, МАТРИЦА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ», МПК C12N 9/18, опубл. 10.04.1996 г.). Недостатком известного способа является недостаточно высокая результативность получаемой матрицы по определению ФОС. Кроме того, известный способ не позволяет изготовить матрицу с заданными активностями фермента, что сужает его функциональные возможности.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является разработка эффективного способа изготовления матрицы для обнаружения фосфорорганических соединений.

Технический результат, достигаемый в результате решения поставленной задачи, заключается в повышении результативности изготовленной матрицы по определению ФОС и расширении функциональных возможностей способа в изготовлении матриц с заданными активностями фермента.

Указанный технический результат достигается тем, что способ изготовления матрицы для обнаружения фосфорорганических соединений включает: дробление и рассев нейтрального стекла с выделением фракций размером 0,40÷0,63 мм; обработку выделенных фракций хромовой смесью; отмывку дистиллированной водой; высушивание; пропитку ферментом карбоксилэстеразы; смыв фермента; определение активности полученной матрицы.

Предпочтительно, чтобы пропитку обработанного дробленого стекла ферментом карбоксилэстеразы (КЭРС) проводили в соотношении: 3 части фермента в миллилитрах и 10 частей дробленого стекла в граммах; высушивание обработанной ферментом массы осуществляли при периодическом перемешивании при t=45÷50°C в течение 2÷3 часов до полного высыхания при нормальных климатических условиях (НКУ).

Предпочтительно, чтобы пропитку обработанного дробленого стекла ферментом карбоксилэстеразы (КЭРС) производили неоднократно.

Предпочтительно, чтобы в качестве карбоксилэстеразы использовали карбоксилэстеразу из растительного сырья злаковых культур.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМИНОВ.

РАССЕВ ПЕРИОДИЧЕСКИЙ (РАЗОВЫЙ) — операция, при которой подрешетный и надрешетный продукты остаются на просеивающих поверхностях до завершения процесса рассева (п. 2.2. ГОСТ 27562—87 (СТ СЭВ 958—78) «Руды железные, концентраты, агломераты и окатыши определение гранулометрического состава методом ситового анализа»).

НОРМАЛЬНЫЕ КЛИМАТИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ (НКУ) - условия, определенные как: температура окружающего воздуха от 15 °С до 35 °С; относительная влажность от 45 % до 75 %; атмосферное давление от 650 до 800 мм рт. ст. (п. 3.46 РД 45.298-2002 «Оборудование аналоговых транкинговых систем подвижной радиосвязи. Общие технические требования» https://normative_reference_dictionary.academic.ru )

Сопоставительный анализ заявляемого изобретения с прототипом показал, что во всех случаях исполнения, оно отличается от известного, наиболее близкого технического решения:

- дроблением и рассевом нейтрального стекла (используемого в качестве подложки);

- выделением фракций дробленного стекла с размером 0,40÷0,63 мм;

- обработкой выделенных фракций хромовой смесью;

- отмывкой обработанных фракций дистиллированной водой;

- высушиванием после смыва фермента;

- определением активности фермента в полученной матрице.

В предпочтительных случаях исполнения изобретение отличается от известного, наиболее близкого технического решения:

- осуществлением пропитки обработанного дробленого стекла ферментом в соотношении: 3 части фермента в миллилитрах и 10 частей дробленого стекла в граммах;

- осуществлением высушивания обработанной ферментом массы при периодическом перемешивании при t=45÷50°C в течение 2÷3 часов до полного высыхания.

- неоднократной пропиткой обработанного дробленого стекла ферментом карбоксилэстеразы.

Дробление и рассев нейтрального стекла с выделением фракций дробленного стекла с размером 0,40÷0,63 мм позволяет изготовить подложку с увеличенной площадью поверхности для нанесения раствора фермента. Обработка выделенных фракций хромовой смесью позволяет обеспечить высокую степень очистки стеклянной крошки, используемой в качестве подложки. Неоднократная обработка стеклянной крошки раствором фермента позволяет получить матрицу с различной степенью активности, что расширяет функциональные возможности матрицы, расширяя диапазон применения матрицы. Пропитка обработанного дробленого стекла ферментом в соотношении: 3 части фермента в миллилитрах и 10 частей дробленого стекла в граммах, а также высушивание обработанной ферментом массы при периодическом перемешивании при t=45÷50°C в течение 2÷3 часов до полного высыхания позволяет исключить использование специального оборудования (типа лиофильной сушки). Использование в качестве карбоксилэстеразы карбоксилэстеразы из растительного сырья злаковых культур обеспечивает доступность и экономичность матрицы.

Пример изготовления матрицы

Нейтральное стекло марки НС-1 (ГОСТ 27562—87) подвергают дроблению и последующему рассеву, пропуская через сито из сетки проволочной ткани № 063 (размер отверстий = 0,630 мм) и сито №04 (размер отверстий = 0,400 мм). Частицы, прошедшие через сито с ячейками размера 0, 63 мм и осевшие на сите с ячейками размера 0,4 мм, обрабатывают хромовой смесью, отмывают дистиллированной водой. Полученную массу высушивают при периодическом перемешивании при t=45÷50°C в течение 2÷3 часов до полного высыхания при нормальных климатических условиях. После этого обработанную стеклянную крошку пропитывают ферментом карбоксилэстеразы, предпочтительно из растительного сырья злаковых культур. Пропитку проводят в соотношении: 3 части фермента в миллилитрах и 10 частей дробленого стекла в граммах, например, 3 мл. фермента + 10 г. дробленого нейтрального стекла. После чего производят смыв фермента с определенного количества матрицы (например, с 1 гр.) определенным объемом (3 мл.) дистиллированной воды или буфера, например фосфатного, и определяют активность полученной матрицы, для чего берут аликвоту этого раствора и по разработанной заявителем методике определяют активность фермента в данной партии матрицы.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения карбоксилэстеразы, включающий измельчение растительного сырья злаковых культур, экстракцию при рН=7,5 в течение 1 ч при 28-30°С, затем суспензию выдерживают 18-20 ч, надосадочную жидкость сливают, отжимают осадок, отфильтровывают, доводят рН раствора до 7,6±0,05 при 24-26°С и перемешивании; очистку осуществляют добавлением ДЭАЕ-сорбента порциями по 0,5-1,0 г при интенсивном перемешивании, после чего суспензию перемешивают в течение 1 ч, затем сорбент осаждают в течение 1 ч, декантируют, осадок трижды промывают 0,05М фосфатным буферным раствором, затем водным раствором хлористого натрия; высаливают хлористым натрием, центрифугируют; матрица для обнаружения фосфорорганических соединений общей формулы в субстратах, в качестве которых используют сложные эфиры общей формулы ROC(O)R₁ и ROC(S)R₁, где R - фенил, нафтил 1 и 2, R₁ - метил или этил, выполненная в виде подложки из обработанного хромовой смесью, промытого дистиллированной водой и высушенного дробленого нейтрального стекла марки НС-1 с размером фракций 0,40-0,63 мм определенного химического состава, с использованием полученной карбоксилэстеразы; способ изготовления матрицы, включающий дробление и рассев нейтрального стекла марки НС-1 с выделением фракций размером 0,40-0,63 мм, обработку выделенных фракций хромовой смесью, отмывку дистиллированной водой, высушивание, пропитку ферментом карбоксилэстеразы в соотношении: 3 части фермента в мл и 10 частей дробленого стекла в г и высушивание. Изобретения обеспечивают повышение активности карбоксилэстеразы, расширение функциональных возможностей матриц с заданными активностями фермента. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 пр.

1. Способ получения карбоксилэстеразы, включающий измельчение исходного растительного сырья злаковых культур, экстракцию, отделение осадка и очистку на ДЭАЕ-сорбенте с последующим высаливанием, отличающийся тем, что экстракцию проводят при рН=7,5 в течение 1 ч при температуре 28-30°С, после чего суспензию выдерживают в течение 18-20 ч, затем надосадочную жидкость сливают, отжимают осадок, отфильтровывают, доводят рН полученного раствора до 7,6±0,05 путем добавления раствора гидроокиси натрия при перемешивании и температуре 24-26°С; очистку осуществляют добавлением ДЭАЕ-сорбента порциями по 0,5-1,0 г при интенсивном перемешивании, после чего суспензию перемешивают в течение 1 ч, затем сорбент осаждают в течение 1 ч, декантируют, осадок трижды промывают 0,05М фосфатным буферным раствором, затем водным раствором хлористого натрия; высаливание осуществляют хлористым натрием, а полученный раствор концентрированного фермента центрифугируют.

2. Матрица для обнаружения фосфорорганических соединений (ФОС), выполненная в виде подложки с компонентами субстрат-индикаторной системы с использованием карбоксилэстеразы для обнаружения ФОС общей формулы

в субстратах, в качестве которых используют сложные эфиры общей формулы ROC(O)R₁ и ROC(S)R₁, где R - фенил, нафтил 1 и 2, R₁ - метил или этил, отличающаяся тем, что в качестве подложки использовано обработанное хромовой смесью, промытое дистиллированной водой и высушенное дробленое нейтральное стекло марки НС-1 с размером фракций 0,40-0,63 мм с содержанием химического состава в массовых долях, %: SiO₂ - 73,00±0,50; Al₂О₃ - 4,50±0,20; B₂O₃ - 4,00±0,25; сумма СаО, МgО - 8,00±0,30; Na₂O - 8,50±0,25; K₂О - 2,00±0,20, а карбоксилэстеразу получают измельчением исходного растительного сырья злаковых культур, экстракцией при рН=7,5 в течение 1 ч при температуре 28-30°С, выдерживают суспензию в течение 18-20 ч, сливают надосадочную жидкость, отжимают осадок, отфильтровывают, доводят рН полученного раствора до 7,6±0,05 путем добавления раствора гидроокиси натрия при перемешивании и температуре 24-26°С; при этом очистку осуществляют добавлением ДЭАЕ-сорбента порциями по 0,5-1,0 г при интенсивном перемешивании, после чего суспензию перемешивают в течение 1 ч, затем сорбент осаждают в течение 1 ч, декантируют, осадок трижды промывают 0,05М фосфатным буферным раствором, затем водным раствором хлористого натрия; высаливание осуществляют хлористым натрием, а полученный раствор концентрированного фермента центрифугируют.

3. Матрица по п. 2, отличающаяся тем, что содержит герметичную упаковку в виде стеклянного флакона.

4. Способ изготовления матрицы для обнаружения фосфорорганических соединений, включающий дробление и рассев нейтрального стекла марки НС-1 с выделением фракций размером 0,40-0,63 мм с содержанием химического состава в массовых долях, %: SiO₂ - 73,00±0,50; Al₂О₃ - 4,50±0,20; B₂O₃ - 4,00±0,25; сумма СаО, МgО - 8,00±0,30; Na₂O - 8,50±0,25; K₂О - 2,00±0,20; обработку выделенных фракций хромовой смесью; отмывку дистиллированной водой; высушивание; пропитку ферментом карбоксилэстеразы в соотношении: 3 части фермента в мл и 10 частей дробленого стекла в г; высушивание обработанной ферментом массы осуществляют при периодическом перемешивании при температуре 45-50°C в течение 2-3 ч до полного высыхания при нормальных климатических условиях и определения активности полученной матрицы; при этом фермент карбоксилэстеразы получают измельчением исходного растительного сырья злаковых культур, экстракцией при рН=7,5 в течение 1 ч при температуре 28-30°С, выдерживают суспензию в течение 18-20 ч, сливают надосадочную жидкость, отжимают осадок, отфильтровывают, доводят рН полученного раствора до 7,6±0,05 путем добавления раствора гидроокиси натрия при перемешивании и температуре 24-26°С; при этом очистку осуществляют добавлением ДЭАЕ-сорбента порциями по 0,5-1,0 г при интенсивном перемешивании, после чего суспензию перемешивают в течение 1 ч, затем сорбент осаждают в течение 1 ч, декантируют, осадок трижды промывают 0,05М фосфатным буферным раствором, затем водным раствором хлористого натрия; высаливание осуществляют хлористым натрием, а полученный раствор концентрированного фермента центрифугируют.