Способ определения бензилатов в растворе Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к ферментным методам анализа и к фотоколориметрическому определению бензилатов в растворе.

Специфичностью по отношению к бен- зилат-иону обладает бензилатный ионсе- лективный электрод. Электрод имеет линейную электродную функцию в пределах концентрации бе,нзилата - 10 4 моль/л. Способ определения бензилата ионселек- тивным электродом выбран в качестве прототипа 1.

Метод достаточно простой, заключается в измерении потенциала электрода в присутствии исследуемого бензилата при рН 6-10 с последующим нахождением концентрации по грздуировочному графику.

Известный метод имеет следующие недостатки: недостаточно высокая избирательность-электрод обладает чувствительностью к ионам других оксикислот

(салициловой, молочной); низкий предел обнаружения -- моль/л; определению мешают СГ, NOa, S042, , Н2Р04 и др,

Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа.

Поставленная цель достигается тем, что исследуемый образец растворяют в воде и определяют скорость гидролиза -10 М раствора индофенилацета- та (ИФА) быстрой карбоксилэстеразой из печени северного оленя при рН 8,0-8,5 в присутствии и в отсутствие исследуемого раствора и концентрацию бензилата в растворе находят по градуировочному графику.

Таким образом, предел обнаружения повышается до 2-10 моль/л Метод является специфичным по отношению к бензила- там. Определению не мешают присутствие других ионов: СГ, МОз , , , НРОд. а также эфиров бензиловой кислоты или других производных бензиловой кислоты.

ЮП&

Оказалось, что бензмлат-ион является сильным, специфическим ингибитором по отношению к ферменту карбоксилзстераза. Даже присутствие микрочоличеслв беияи- лата в растворе заметно снижает актив ность карбоксилэстеразы, следовательно и скорость ферментативного гидролиза индофснилацетатз - субстрата карбоксилэстеразы этим ферментом. Снижение скорости ферментативной реакции аз висит ст присутствующего количеств бензилата, Соотношение скоростей ферментативного гидролиза ИФА карбоксилэ- стеразой в присутствии и отсутствии бензила та можно использовать для определения сог ржаннг бсмзилатч в растворе.

На черте/ко приведен градуировочмый

ГрЕфИ ч,

Пример 1. Определяют скорость гидролиза ИФЛ быстрой карбоксп/пстэ ргзой в воде (значение v):

Приготавливают реакциочиую смесь в общем объеме 5 пл из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 540° моль/л, 1,9 мл фос- фа-.. -по буфера с р I 8,0, 2 мл I laO. Добзо- лг.Ю1 0 1 мл растпора быстрой карбоксилэстеразы г концентрацией, например 5 F/мл

Проводит ферментативную реакцию гидролиза ссылаемо известной методике, Определяют ЗКТИРНО..Л ь карбокгипэстеразы по 1эрас анию оптической ппотногги раствора пр« 62й, им за счел образовали 1 про дуч1а т/Фил 1за И ФА.

Маймэнпую активность порсс- ишва:о1 на единицу времени (мим ) и относят к I мг белка, чт является скоростью ферменга- тивпой реакции. Iслушают значение v 1,1

Определяют скорость гидролиза ИФЛ быстрой карбокгилзсгеразой в анализируемом растворе, содержащем бензилат (значение ViV

При СтаслиБгюг реакционную CMCOL из 1 мл раствора ЛФА с концентрацией могю/л, 1,0 wn фосфатного буфера с рН 8,0 и 2 ил анагизируемсго рагтво ра бочз11лзта кп,пж. с концентрацией 1-Ю 3 мель//:. ДоСавпиют 0,1 мл раствора быстрой ксрбакс и/ згтерг и с такой же концентрацией кчк R реакции определения значения v, т.о. 5 Е/мг,

Опредеяяютсхсрость гидролиза согласно методике,

Находят значение м - 0,88.

Получают соотношение v/vi равное 1,25.

По грацумровоч юму графику находят содержание бензилата, равное 1 -10 8мо1ь/л

Пример 2. Определяют скорость гидролиза ИФЛ быстрой карбоксилосте- в воде (значение v)

Приготавливают реакционную смесь в общем объеме 5 мп, сосюяи(уЮ из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 2- мопь/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,5; 2 мл НаО и 0,1 мл раствора карбоксилэстеразы. Определяют скорость гидролиза v равную 2,00. Определяют скорость гидролиза ИФА кзрбиксилэсгерязои в анализируемом рас шоре, содержащем бензилат.

Пр гогапливают реакционную смесь из 1 пл раствора ИФА с концентрацией 2 10 моль/л, 1,0 мл фосфатного буфера с р I 8,5; 7 ил анализируемого раствора б нзплата калия с концентрацией 3, моль/л. Добаелпю 0,1 мл раствора кзрбоксчлчстеразы Определяют скорость гидролиза ИФА, согласно методике Находят значение vi равное 0,47

Получают соотношение v/vi рапное Л,25. По градуирочочному графику находят содержание бепзилата, равное 3, гюпь/л.

Пример 3 Определяют скорость гидролиза ИФЛ быстрой карбоксилосте- разои з гюде

Приготавливают реакционную смесь, состоящую из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 8-10 мгпь/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,3;г мл Н20 и 0,1 мл раствора карбогсипэстсрази Находят скорость гидролиза ИФА, равную 1,95.

Опредепяют скорость гидролиза ИФА

карОокснл сгеразой в анализируемом рас- творя, содержащем бензилат.

Приготавливают реакционную смесь из 1 смл раствора ИФА с концентрацией

моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с pi 8,3, 2 мл анализируемою раствора бензилата с концентрацией 2, моль/л Добзрляют 0,1 мм раствора карбоксилэстеразы,

Определяют скорость гидролиза ИФА согласно методике. Находят скорость гидролиза vi - 0,62, Получают соотношение v/vi равное 3,15 и находят содержание бензилата, равное 2,5 -10 моль/л,

П р и м е р 4, Приготавливают реакционную смесь дня определения скорости гидролиза ИФА в воде: 1 мл раствора ИФА с концентрацией моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 7,5; 2 мл HzO и 0 1 мл

раствора каобоксилэстеразы Находит скорое ь г гидролиза ИФА, равную 1,01,

Определяют скорость гидролиза ИФА карбогсилэстеразы в анализируемом рас - творе, содержащем бензилат.

Приготавливают реакционную смесь из

1мл раствора ИФА с концентрацией 4-10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 7,5;

2мл анализируемого раствора бензилата с концентрацией 2, моль/л. Добавляют 0,1 мл раствора карбоксилэстеразы. Определяют скорость гидролиза ИФА согласно методике. Находят скорость гидролиза vi 0,981. Получают соотношение v/vi, равное 1,25.

Соответствующее содержание бензилата равное 1-10 моль/л. Видимо, концентрация субстрата в данных условиях реакции не достаточная. Ферментативная реакция проходит медленно, что вносит ошибку в определении содержания бензилата.

Пример 5 Приготавливают реакционную смесь для определения скорости гидролиза ИФА в воде,

1 мл рзствора ИФА с концентрацией 310 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,7; 2 мл H2U и 0,1 мл раствора кзрбок- силэстеразы Находят скорость v гидролиза ИФА, равную 2,1.

Определяют скорость гидролиза МФА карбоксилэстеразой в анализируемом растворе, содержащем бензилзт,

Приготавливают реакционную смесь из 1 мл раствора ИФА с концентрацией З Ю4 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,7; 2 мл анализируемого раствора бензилата с концентрацией ,5-10 моль/л. Добавляют 0,1 мл раствора карбоксилэстеразы. Определяют скорость vi гидролиза ИФА равную 0,6.,

Получают соотношение v/vi равное 3,5.

Находят содержание бензилата в растворе равное 2, моль/л,

При данной концентрации субстрата и ,5 ферментативная реакция проходит спонтанно, что вносит ошибку в определении содержания бензилата.

Для подтверждения специфичности метода по отношению к бензилатам, приводим дополнительный пример:

Пример 6. Определяют скорость гидролиза ИФА быстрой карбоксилэстеразой в воде (значение v):

Приготавливают реакционную смесь в общем объеме 5 мл из 1 мл раствора ИФА с концентрацией моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,0, 2 мл . Добавляют 0,1 мл раствора быстрой карбоксилэстеразы с концентрацией, например, 5 Е/мл.

Проводят ферментативную реакцию гидролиза.

Определяют активность карбоксилэстеразы по нарастанию оптической плотности

раствора при 625 нм за счет образования продукта гидролиза ИФА.

Найденную активность пересчитывают на единицу времени (мин.) и относят к I мг белка, что является скоростью ферментативной реакции.

Получают значение v - 1,1, Определяют скорость гидролиза ИФА быстрой карбоксилзстеразой в анализируе- мом растворе, содержащем бензилат (значение vl):

Приготавливают реакционную смесь из 1 мл раствора ИФА с концентрацией моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,0 и 2 мт анализируемого раствора метилового эфира бензиловой кислоты с концентрацией 1 -10 8 моль/п. Добавляют 0,1 мл раствора быстрой карбоксилэстеразы с такой же концентрацией как в реакции определения значения v, т.е. 5 Е/мл.

Определяют скорость гидролиза согласно методике,

Находят значение vi 1,1. Получение одинаковых значений v и vi равных 1,1, означает что ингибирование фермента данным эфиром не произошло. Следовательно, существует высокая специфичность быстрой КЭС только к бензилату, хотя по химической структуре данное соединение аналогично бензилату.

Пример 7. Определение неизвестного количества остаточного бензилата в про- мышленно выпускаемом препарате метацине.

Анализ проводят аналогично примеру 2 Найденное значение v 2,0 Приготавливают реакционную смесь из 1 мл раствора ИФА с концентрацией моль/л. 1,9 мл фосфатного буфера с рН -В,5 и 2 мл водного раствора метацина, содержащего 0,1 мл препарата.

Далее добавляют ИФА согласно методике. Найденное значение v 0,47. Получа- ют соотношение v/vi, равное 4,25. Найденное по калибровочной кривой содержание бензилата в растворе метацина равно 3, моль/л,

Предлагаемый способ обеспечивает об- наружение 2 моль/л бензилатов, не вы ляемых классическими методами.

Использование предложенного способа обеспечивает более точный контроль и оценку содержания бензилатов, в том числе в биологически активных соединениях.

Формула изобретения

Способ определения бензилатов в растворе путем их исследования с последующим нахождением концентрации бензилата по калибровочному графику, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа, проводят ферментативную реакцию гидролиза - 2-10 М раствора индолфенилаце/гв а кврбоксилэстеразой из печени северного вяеня, взятой в конг

центрации 5 Е/мл, рН 8,0-8,3, гидролиз ведут в присутствии и в отсутствие исследуемого раствора бензилата, регистрируют его скорость в первой и второй пробах, рассчи- 5 тьшают соотношение полученных показателей с последующим нахождением концентрации бензилата по калибровочному графику,

Использование: способ может быть реализован в медицине, фармакологии и аналитической химии. Сущность изобретения заключается в определении скорости гидролиза 5- 2-Ю4 М раствора индофенила- цетата быстрой карбоксилзстеразой из печени северного оленя при рН 8,0-8,5, взятой в концентрации 5 Е/мл в присутствии и ° в отсутствие исследуемого раствора, регистрируют скорость гидролиза в первой и второй пробах, рассчитывают отношение этих показателей и концентрацию бензилата в растворе находят по калибровочному графику. Предел обнаружения бензилатов моль/л. Способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. 1 ил.

г/о.з .

---«--53Й5ь -Q

Л . 10 жзгь/л