СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТРАВЛЕНИЙ МАЛЫМИ ДОЗАМИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, касается установления факта воздействия на биологический объект фосфорорганических соединений (ФОС), в частности фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ), и может быть использовано на объектах по производству, хранению и уничтожению боевых отравляющих веществ, а также в непредвиденных чрезвычайных ситуациях (ликвидация последствий техногенных аварий, террористические акты).

В настоящее время ФОС находят широкое применение в медицине, сельском хозяйстве и других областях народного хозяйства. Некоторые из них обладают выраженным токсическим действием и могут использоваться в качестве боевых отравляющих веществ нервно-паралитического типа действия, например, зарин, зоман, V_x. Всегда сохраняется определенная вероятность отравления веществами данной группы при их промышленном синтезе, транспортировке, хранении и утилизации, так как большая часть отравляющих веществ нервно-паралитического действия остается в корпусах боеприпасов. Не исключается также возможность террористических атак с применением рассматриваемых высокотоксичных веществ. В связи с этим диагностике отравлений фосфорорганическими отравляющими веществами в последнее время уделяется пристальное внимание.

Диагностика поражений ФОВ в дозах, близких к смертельным, детально разработана как в эксперименте на лабораторных животных, так и на материалах анализов случаев отравлений людей, имевших место при уничтожении и хранении этих высокотоксичных веществ. Лабораторные методы диагностики в этих случаях носят дополнительный характер и, в основном, сводятся к определению каталитической активности холинэстераз (ХЭ) плазмы крови и эритроцитов [1].

Адекватные лабораторные методы диагностики воздействий ФОВ в дозах, не вызывающих отчетливых клинических проявлений, до настоящего времени не разработаны, несмотря на то что ретроспективный анализ происшествий на объектах по хранению и уничтожению рассматриваемых высокотоксичных веществ показывает, что в реальных условиях в подавляющем большинстве случаев имеет место воздействие именно малых доз отравляющих веществ.

По мнению американских специалистов, малые дозы подразделяются на три уровня [2]. Воздействие доз первого и второго уровней характеризуются полным отсутствием каких-либо клинических симптомов и уменьшением каталитической активности холинэстераз не более чем на 20% при первом уровне и более 20% при втором уровне. Третий уровень, кроме уменьшения каталитической активности холинэстераз более чем на 20%, уже допускает наличие некоторых клинических симптомов, например саливации, тахикардии, миоза и т.п. Большой интерес с практической точки зрения представляет воздействие ФОВ, сопровождающееся снижением каталитической активности холинэстераз на 20-30%.

Единственным специфическим биохимическим показателем отравлений ФОВ является каталитическая активность холинэстераз крови, в частности, ацетилхолин-эстеразы эритроцитов крови (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови (БуХЭ). Уменьшение каталитической активности холинэстераз крови может свидетельствовать о поражениях под действием рассматриваемых высокотоксичных веществ. Других биохимических показателей воздействия ФОВ, которые нашли бы столь широкое практическое применение как каталитическая активность холинэстераз, до настоящего времени не выявлено.

Однако очень часто в клинической практике наряду со снижением каталитической активности данного фермента наблюдаются иные проявления отравления даже при воздействии малых доз нервно-паралитических ядов, не говоря уже о тяжелых поражениях. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что наблюдаемое при отравлениях ФОВ снижение каталитической активности ХЭ в ряде случаев не находится в определенной связи с тяжестью клинических симптомов отравления. В таких ситуациях для установления истинного уровня снижения каталитической активности ХЭ необходимо проводить измерение каталитической активности холинэстераз до начала и после окончания контакта с ФОВ.

Показатели каталитической активности АХЭ и БуХЭ в клинической практике не имеют особой диагностической ценности, поскольку абсолютные значения каталитической активности холинэстераз крови могут уменьшаться или увеличиваться не только при отравлении ФОВ, но и при развитии различной патологии. То есть они не представляют собой достаточно специфических показателей, так как являются вторичными в проявлениях патологических процессов. Изменения активности отдельных ферментных систем и, в частности, холинэстераз, как правило, носят однообразный, монотонный характер, что свидетельствует о наличии неспецифических реакций, которыми организм отвечает на разнообразные патологические влияния внешней и внутренней среды. Например, при определении каталитической активности БуХЭ в качестве оценочного теста состояния печени установлено, что ее значения колеблются в очень широких пределах и снижение каталитической активности БуХЭ при заболеваниях печени, скорее всего, связано с нарушениями процесса синтеза [3, 4].

Что касается использования показателей каталитической активности холинэстераз в ранней диагностике отравлений фосфорорганическими ядами, то наибольшую ценность в качестве такого теста может представлять каталитическая активность АХЭ эритроцитов, но не БуХЭ плазмы [5]. При отравлениях малыми дозами ФОВ изменение каталитической активности АХЭ эритроцитов наблюдается уже тогда, когда еще отсутствуют какие-либо иные признаки поражения. Однако даже в этом случае угнетение холинэстеразы может быть не самым ярким проявлением отравления. Например, при случайном отравлении парами зарина уровень каталитической активности АХЭ эритроцитов и БуХЭ плазмы снижался, соответственно, на 16% и 4% и при полном отсутствии каких-либо иных симптомов наблюдался ярко выраженный миоз [6]. Вероятно, при поражении парами летучих ФОВ миоз является более специфическим индикатором поражений, чем изменение уровня каталитической активности холинэстераз крови. Как и в других случаях отравлений, при поражении парами зарина снижение каталитической активности АХЭ эритроцитов более выражено, чем снижение каталитической активности БуХЭ плазмы. Тот же эффект наблюдался при накожной аппликации Vx в дозах, не превышающих 0,010 мг/кг: наибольшее угнетение фермента наблюдалось для АХЭ эритроцитов, а наименьшее - для БуХЭ плазмы [6].

Способ лабораторной диагностики отравлений фосфорорганическими отравляющими веществами, возникающих при осуществлении работ, связанных с их производством, хранением и уничтожением, предусматривающий определение каталитической активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов крови до и после контакта с указанными высокотоксичными веществами и установление уровня снижения каталитической активности данного фермента, принят в качестве прототипа.

Указанный способ не может найти применение при диагностике отравлений малыми дозами ФОВ, так как изменение каталитической активности АХЭ эритроцитов не является специфическим показателем, который позволил бы осуществить достоверную и надежную диагностику такого рода поражений.

Кроме того, существенным недостатком способа-прототипа является то, что при использовании каталитической активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов для диагностики отравлений необходимо иметь данные об исходных показателях каталитической активности фермента исследуемого субъекта до воздействия ФОВ (норму активности), чтобы определить, каково ее изменение после воздействия отравляющего агента. Дело в том, что колебания каталитической активности АХЭ очень значительны. Например, каталитическая активность АХЭ практически здоровых людей при выборке в 237 человек колебалась от 7,8 Е до 13,05 Е при среднем значении 10,47 Е [7]. Поэтому определение величины отклонения от нормы для каждого конкретного субъекта возможно только в том случае, если известна величина нормы этого субъекта, так как у каждого субъекта она индивидуальна.

Данное обстоятельство свидетельствует о том, что указанный способ не может найти применение при диагностике отравлений малыми дозами ФОВ в непредвиденных чрезвычайных ситуациях (ликвидации последствий техногенных аварий, террористических актах), так как в подобных случаях, естественно, отсутствуют данные о величине исходной каталитической активности фермента (до воздействия ФОВ), то есть норме каталитической активности фермента конкретного субъекта.

Учитывая изложенное, целью изобретения является повышение эффективности лабораторной диагностики отравлений малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ, произошедших как в случаях при их производстве, хранении и уничтожении, так и в непредвиденных чрезвычайных ситуациях (ликвидации последствий техногенных аварий, террористических актах), когда отсутствуют отчетливые клинические проявления.

Указанная цель достигается за счет применения способа, который для диагностики поражений малыми дозами ФОВ предусматривает определение каталитической активности арилэстеразы плазмы крови (АрЭ). Фосфорорганические отравляющие вещества не влияют на каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови. Поэтому динамика изменения каталитической активности данного фермента ранее никогда не использовалась в качестве показателя отравления рассматриваемыми высокотоксичными веществами.

Заявляемый способ отличается от способа-прототипа тем, что в процессе диагностики определяют каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови. Причем определяют каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови однократно после контакта с ФОВ и затем устанавливают степень влияния на активность указанного фермента прогревания при температуре 55°С в течение 5 мин. В том случае, если под влиянием прогревания значение каталитической активности арилэстеразы плазмы крови увеличивается более чем на 20% по отношению к контролю (до прогревания), делают вывод об отравлении малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ.

Возможность достижения цели изобретения доказывается следующими примерами.

Пример 1. Сущность способа-прототипа и заявляемого способа лабораторной диагностики отравлений малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ.

Способ-прототип лабораторной диагностики отравлений фосфорорганическими отравляющими веществами предусматривает определение каталитической активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов до и после контакта с ФОВ и установление уровня снижения каталитической активности данного фермента.

Сущность заявляемого способа состоит в определении уровня каталитической активности АрЭ плазмы крови и установлении воздействия на него прогревания при температуре 55°С в течение 5 мин с использованием в качестве субстрата индофенил-ацетата (ИФА). Определение при этом осуществляют однократно после контакта с ФОВ, а эффект воздействия температуры на каталитическую активность АрЭ плазмы крови выражают в %, принимая за 100% каталитическую активность указанного фермента в контроле (до прогревания). Арилэстераза - фермент плазмы крови, в значительной степени связанный с липопротеинами высокой плотности (ЛВП), стабилизирующими его конформационное состояние [8]. При стрессе или при отравлении антихолинэстеразными ядами уровень ЛВП в плазме крови возрастает [8], что сопровождается взаимодействием ЛВП со свободной фракцией арилэстеразы плазмы крови и, как следствие, увеличением термической стабильности фермента. При прогревании раствора плазмы отравленной особи каталитическая активность АрЭ, содержащейся в этой плазме, увеличивается по отношению к непрогретому контролю.

Для осуществления анализа по способу-прототипу в пробирку помещают 2,4 мл воды, вносят 0,1 мл эритроцитов крови, добавляют 1,5 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,5) и 0,5 мл ацетилтиохолина йодистого в концентрации 0,018 М. Подготовленную таким образом пробу выдерживают в течение 5 мин в термостате при температуре 37°С. По окончании инкубации реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 10% хлорной кислоты, перемешивают, охлаждают и фильтруют. В пробирку отбирают 0,2 мл фильтрата, добавляют 4,3 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,5) и 0,5 мл раствора реактива Эллмана (0,792 мг/мл в 1 М растворе хлористого калия в фосфатном буфере, pH 7,0).

Расчет каталитической активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов (Е) проводят по формуле:

$$E=\frac{D\cdot 1000\cdot N\cdot V_{пробы}}{\epsilon \cdot t\cdot V_{кр}}мкмоль/мл\cdot мин,(1)$$

где D - оптическая плотность исследуемой пробы;

N - разбавление фильтрата в фотометрируемом растворе;

V_пробы - объем фотометрируемой пробы, мл;

ε - коэффициент молярного погашения;

t - время инкубации, мин;

V_кр - объем анализируемой плазмы, мл.

Для проведения расчета измеряют оптическую плотность исследуемой пробы, для чего используют спектрофотометр типа СФ-46 при длине волны 412 нм. Оптическую плотность определяют не ранее чем через 1 мин и не позднее чем через 5 мин против фона в кювете с толщиной слоя окрашенного раствора 10 мм. Кювета фона содержит раствор, получаемый в результате проведения тех же операций, что и исследуемый раствор, за исключением того, что вместо эритроцитов используют воду.

Способ-прототип предусматривает определение каталитической активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов дважды: до и после контакта с ФОВ. Делается это с целью установления эффекта снижения каталитической активности фермента данного субъекта для диагностики отравления его ФОВ.

При диагностике отравлений заявляемым способом после контакта с ФОВ определяют каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови и устанавливают эффект воздействия прогревания на указанный показатель.

При осуществлении заявляемого способа готовят две пробы. Пробу №1 готовят следующим образом: в пробирку, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, вносят 0,2 мл плазмы крови, добавляют 2 мл 0,05 М боратного буфера (рН 8,0), 0,5 мл воды и 0,5 мл водного раствора ИФА (0,1 мг/мл), затем смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С. Оптическую плотность пробы замеряют через 3 мин и 30 мин после добавления ИФА. Пробу №2, предназначенную для определения эффекта воздействия прогревания, готовят так: к 0,8 мл физиологического раствора добавляют 0,2 мл плазмы и выдерживают смесь в течение 5 мин в термостате при температуре 55°С. Затем пробу быстро охлаждают, добавляют в нее 1,5 мл воды, 2 мл боратного буфера, 0,5 мл раствора ИФА и выдерживают в термостате при температуре 37°С. Оптическую плотность замеряют так же, как и в пробе №1, то есть через 3 мин и 30 мин после добавления ИФА.

Определение оптической плотности полученных окрашенных растворов проводят с использованием спектрофотометра типа СФ-46 при длине волны 620 нм. Толщина слоя пробы в кювете составляет 10 мм. Оптическую плотность определяют дважды (точно через 3 мин и 30 мин после начала реакции, то есть после добавления ИФА) в сравнении с пробой, содержащей все компоненты кроме плазмы крови.

Расчет каталитической активности арилэстеразы плазмы крови (ЕА) проводят по формуле:

$$EA=\frac{V_{пробы}\cdot \Delta D}{\epsilon \cdot 1000\cdot t\cdot V_{плазмы}}мкмоль/мл\cdot мин,(2)$$

где V_пробы - общий объем пробы, мл;

ΔD - изменение оптической плотности пробы за промежуток времени t;

V_плазмы - объем анализируемой плазмы, мл;

ε - коэффициент молярного погашения;

t - время контакта фермента с субстратом, мин.

Эффект воздействия прогревания выражают в %, принимая за 100% каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови при выдерживании ее в термостате при 37°С, то есть без прогревания в термостате при температуре 55°С. В том случае, если увеличение активности арилэстеразы плазмы крови после прогревания составляет более 20%, делают вывод об отравлении малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ.

Пример 2. Оценка влияния прогревания на каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови крыс в опытах in vitro после введения им ФОВ.

Сущность опытов in vitro заключалась в исследовании изменения значения арилэстеразы плазмы крови крыс после введения им ФОВ (зомана, зарина, ОВ типа V_x). Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. В эксперименте формировали 10 групп животных по 10 особей в каждой.

Животным первой группы внутримышечно вводили физиологический раствор и использовали их в качестве контроля.

Животным второй, третьей и четвертой групп внутримышечно вводили ОВ типа V_x в дозах, соответственно, 0,5 ЛД₅₀, 0,3 ЛД₅₀ и 0,1 ЛД₅₀.

Животным пятой, шестой и седьмой групп внутримышечно вводили зоман в дозах, соответственно, 0,5 ЛД₅₀, 0,3 ЛД₅₀ и 0,1 ЛД₅₀.

Животным восьмой, девятой и десятой групп внутримышечно вводили зарин в дозах, соответственно, 0,5 ЛД₅₀, 0,3 ЛД₅₀ и 0,1 ЛД₅₀.

Через 2 ч после введения указанных ФОВ у подопытных животных путем декапитации отбирали кровь в пробирку, смоченную раствором гепарина, центрифугировали в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин и отделяли плазму от эритроцитов. Подготовку проб для анализа, определение каталитической активности арилэстеразы плазмы крови и оценку воздействия на ее уровень прогревания проводили согласно методике, приведенной в примере 1.

Кроме того, в процессе эксперимента после введения подопытным животным ФОВ наблюдали за их состоянием. Никаких клинических признаков отравления при этом обнаружено не было.

Из представленных в таблице данных видно, что после введения крысам физиологического раствора увеличение значения каталитической активности арилэстеразы после прогревания при температуре 55°С в течение 5 мин составляет 17,3%, что существенно меньше, чем после введения ОВ типа V_x в дозах 0,5 ЛД₅₀ (66,6%), 0,3 ЛД₅₀ (63,7%) или 0,1 ЛД₅₀ (42,3%). В случаях введения зомана в дозах 0,5 ЛД₅₀, 0,3 ЛД₅₀ или 0,1 ЛД₅₀ увеличение значения каталитической активности АрЭ после прогревания составляет, соответственно, 53,2%, 43,5% и 31,6%. При отравлении же подопытных животных зарином в указанных дозах значения каталитической активности АрЭ после прогревания увеличились, соответственно, на 50,2%, 38,4% и 20,9%.

Таким образом, заявляемый способ лабораторной диагностики отличается высокой эффективностью и позволяет при отсутствии каких-либо клинических признаков отравления достоверно установить факт отравления малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ нервно-паралитического действия (зарин, зоман, V_x). Кроме того, заявляемый способ не требует определения исходной величины каталитической активности арилэстеразы плазмы крови, которая была до контакта с высокотоксичным веществом, то есть нормы активности, и достаточно прост, что позволит широко использовать его в самых различных ситуациях, в том числе и непредвиденных чрезвычайных ситуациях (ликвидации последствий техногенных аварий, террористических актах).

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые при лабораторной диагностике отравлений малыми дозами ФОВ, не вызывающих отчетливых клинических проявлений, предложено определять каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови и оценивать влияние на ее уровень прогревания, а при установлении факта увеличения значения каталитической активности арилэстеразы плазмы крови под влиянием прогревания более чем на 20% по отношению к контролю (до прогревания) диагностировать отравление малыми дозами ФОВ.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», так как в известных и доступных источниках информации, содержащих описания способов лабораторной диагностики поражений ФОВ, нет сведений, указывающих на возможность достоверной диагностики отравлений малыми дозами ФОВ при использовании в качестве критерия оценки каталитической активности арилэстеразы плазмы крови и ее изменения при прогревании.

Соответствие критерию «пригодность для применения» подтверждается приведенными примерами, показавшими, что предлагаемый способ лабораторной диагностики прост в проведении, отличается высокой эффективностью и позволяет надежно установить факт отравления малыми дозами ФОВ при отсутствии каких-либо клинических признаков отравления.

Список литературы

1. Стройков Ю.Н. Клиника, диагностика и лечение пораженных отравляющими веществами. М.: Медицина. - 1978. - 178 с.

2. Moore D.H. Long term health effects of low dose exposure to nerve agent // The ASA NEWSLETTER. - 1998. - №2. - P.20-23.

3. Capt. Joseph Mann et al. Serum cholinesterase activity in liver disease // J. Lab. Clin. Med. - 1952. - Vol.39, N4. - P.543-549.

4. Ucte Tetsuo Comparison substrate for measurement serum cholinesterase activity in hepato-biliary-diseases // J. Clin. Chem. and Clin. Biochem. - 1985. - Vol.23, N10. - P.669-675.

5. Namba T. Cholinesterase inhibited by organophosphorus compounds and its clinical effect // Bull. of the World Health Org. - 1971. - ol.44. - P.289-307.

6. Rengstorf Roy H. Accidental exposure of sarin: Vision effect // Arch. Toxicol. - 1985. - Vol.56, - P.201-203.

7. Sabine J. The clinical significance of erythrocyte cholinesterase titrs. // Blood. - 1955. - Vol.10. - P.1132-1137.

8. Blatter-Garin M.C., Abbott C., Messmer S., Mackness M., Durrington P. Quantification of human serum paraoxonase by enzyme-linked immunoassay: population differences in protein concentrations. // Biochem. J. - 1994. - Vol.304, pt 2. - P.549-554.

Таблица Исследование влияния прогревания на каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови крыс в опытах in vitro после внутримышечного введения отравляющего вещества типа V_x, зомана или зарина в дозах 0,1 ЛД₅₀, 0,3 ЛД₅₀ и 0,5 ЛД₅₀ каждого Фосфорорганическое отравляющее вещество (ФОВ) Доза ФОВ Каталитическая активность арилэстеразы плазмы крови ЕА, нмоль/мл·мин (%) Эффект увеличения каталитической активности арилэстеразы плазмы крови после прогревания, (%) до прогревания после прогревания Физиологический раствор (контроль) - 29,44 (100) 34,55(117,3) 17,3   0,5 ЛД₅₀ 21,68 (100) 36,13 (166,6) 66,6 ОВ типа V_x 0,3 ЛД₅₀ 21,39 (100) 35,02 (163,7) 63,7   0,1 ЛД₅₀ 27,66 (100) 42,48 (142,3) 42,3 Зоман 0,5 ЛД₅₀ 28,36 (100) 43,45 (153,2) 53,2 0,3 ЛД₅₀ 27,48 (100) 39,43 (143,5) 43,5 0,1 ЛД₅₀ 24,45 (100) 32,19 (131,6) 31,6 Зарин 0,5 ЛД_5О 28,86 (100) 43,35 (150,2) 50,2 0,3 ЛД₅₀ 29,36 (100) 40,64 (138,4) 38,4 0,1 ЛД₅₀ 28,46 (100) 34,43 (120,9) 20,9

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, касается установления факта воздействия на биологический объект фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) и может быть использовано на объектах по их производству, хранению и уничтожению, а также в непредвиденных чрезвычайных ситуациях (ликвидации последствий техногенных аварий, террористических актах). Способ лабораторной диагностики отравлений малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ состоит в том, что определяют каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови и оценивают эффект повышения каталитической активности арилэстеразы плазмы крови после прогревания при температуре 55°С в течение 5 мин с использованием в качестве субстрата индофенилацетата. Определение каталитической активности указанного фермента и эффекта повышения его после прогревания осуществляют однократно после контакта с фосфорорганическим отравляющим веществом, эффект повышения каталитической активности арилэстеразы плазмы крови после прогревания выражают в %, принимая за 100% каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови до прогревания. В случае, если увеличение активности арилэстеразы плазмы крови после прогревания составляет более 20%, то диагностируют отравление малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ. Использование заявленного способа позволяет эффективно определить факт отравления малыми дозами ФОВ при отсутствии каких-либо клинических признаков отравления. 1 табл., 2 пр.

Способ лабораторной диагностики отравлений малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ, предусматривающий определение каталитической активности эстеразы крови, отличающийся тем, что определяют каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови и оценивают эффект повышения каталитической активности арилэстеразы плазмы крови после прогревания при температуре 55°C в течение 5 мин с использованием в качестве субстрата индофенилацетата, причем определение каталитической активности указанного фермента и эффекта повышения его после прогревания осуществляют однократно после контакта с фосфорорганическим отравляющим веществом, эффект повышения каталитической активности арилэстеразы плазмы крови после прогревания выражают в %, принимая за 100% каталитическую активность арилэстеразы плазмы крови до прогревания, и в том случае, если увеличение активности арилэстеразы плазмы крови после прогревания составляет более 20%, делают вывод об отравлении малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ.