ШТАММ STREPTOMYCES RIMOSUS SOBIN, FINLAY AND KANE - ПРОДУЦЕНТ ОКСИТЕТРАЦИКЛИНА Российский патент 1996 года по МПК C12P29/00 C12P29/00 C12R1/04 

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к производству окситетрациклина.

Окситетрациклин получают в РФ и за рубежом путем культивирования продуцентов на органических средах различного состава. При этом используют различные штаммы. Так, аналогичные заявленному решения описаны в авторских свидетельствах СССР N 256943, 340284, 462499, 780534. Аналоги дают возможность получить культуральную жидкость с довольно низким содержанием окситетрациклина.

В качестве прототипа выбран штамм ЛТС 416 Str.rimosus (авт. св. СССР N 256943). Штамм ЛТС-416 Str.rimosus имеет следующие признаки:
на среде с кукурузным экстрактом N 71 на девятый день роста образует плоские колонии, слабоскладчатые с небольшим кратером, слабо спорулирующие, диаметром 7,5 мм;
на гороховой среде колонии сильноскладчатые, почти аспорогенные с темным субстратным мицелием, диаметр 7,5 мм;
на среде Ваксмана колонии мелкие, слабоспорулирующие со светло-коричневым субстратным мицелием, диаметр 3 мм;
на среде СР -1 с глюкозой колонии бесцветные, пленчатые аспорогенные с коричневым субстратным мицелием в центре колонии, диаметр 8 мм.

Физиолого-биохимические признаки: полностью пептонизирует молоко на седьмые сутки; интенсивно разжижает желатину на пятые-седьмые сутки; слабо коагулирует молоко на девятые сутки; накапливает до 10000 мкг/мл на среде с 7,5% крахмала.

Недостатком этого штамма является низкая способность к накоплению окситетрациклина.

Целью изобретения является повышение способности продуцента окситетрациклина к антибиотикообразованию.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для получения штамма С-2 Streptomyces rimosus был использован штамм ЛТС-416 (авт. св. СССР N 256943). Отбор проводили в несколько ступеней (штаммы ЛТС-464, 1-43 и промежуточные варианты). В процессе отбора использовали обработку мутагенами, в качестве которых служили ультрафиолетовые лучи, акридин-иприт, нитрозометилбиурет, нитрозодиметилбиурет, нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, хлоргидрат-О-(4-метоксибензил) гидроксиламин.

Отбор вели на средах с кукурузным экстрактом и мицелием продуцента пенициллина, который является отходом производства.

Полученный штамм С-2 Streptomyces rimosus имеет следующие отличительные признаки.

Морфолого-культуральные признаки.

1. Характеристика колоний на плотных средах.

Выращивание проводили при температуре 27 ± 1^оС в течение 10-12 сут на поверхности агаризованных сред в ч. Петри.

Среды для вида Streptomyces rimosus (Каталог культур 2 изд. 1989, ВНИИА).

На среде с кукурузным экстрактом N 71 колонии имеют размер 6 мм, выпуклые с ровным краем, кожистые, слабоскладчатые с кратером, воздушный мицелий светло-серого цвета, обратная сторона колонии коричневая. В среду выделяют бурый пигмент. Отличается от колоний штамма-прототипа.

На соевой среде колонии имеют размер 5 мм, выпуклые с неровным краем, кожистые, по краям радиально-складчатые, центр колонии спорулирующий, края аспорогенные, воздушный мицелий коричневый, цвет споровой массы сероватый. В среду выделяют бурый пигмент.

На овсяной среде колонии имеют размер 4 мм, плоские, край ровный, воздушный мицелий в центе серого цвета, по краям коричневого.

На гороховой среде размер колоний 6 мм, колонии выпуклые, радиально-складчатые с кратером, с ободком, лишенным спор. Воздушный мицелий темно-коричневый, край колоний неровный.

На среде Гаузе-2 колонии имеют размер 6 мм, выпуклые с кратером, край колоний неровный, воздушный мицелий светло-серого цвета, в центре колонии темно-серый.

На среде Ваксмана диаметр колонии 4 мм, колонии плоские с ровным краем, воздушный мицелий темно-серый. Отличаются от колоний штамма-прототипа.

На среде Гаузе 1 с глюкозой колонии плоские, диаметром 4 мм, с ровным краем. Воздушный мицелий коричневый, по краям колонии светло-коричневый, центр колонии спорулирующий, край аспорогенный. В среду выделяют коричневый пигмент.

На среде Гаузе 1 с крахмалом колонии плоские, диаметром 2 мм с ровным краем, воздушный мицелий темно-серого цвета. В среду выделяют коричневый пигмент.

На среде Чапека колонии пленчатые, диаметром 4,5 мм с ровным краем, воздушный мицелий темно-коричневый, по краям колонии светло-коричневый. Пигмент в среду не выделяет.

Среды для желтой группы Flavus (Красильников Н.А. Лучистые грибки, М. Наука, 1970).

Крахмально-аммиачный агар. Колонии плоские, диаметром 3 мм. Воздушный мицелий белый. Край колонии неровный. Выделяет коричневый пигмент.

Картофельный агар. Колонии складчатые с неровным краем, диаметром 5 мм. Воздушный мицелий развит слабо, кремового цвета.

СР-1 с глюкозой. Колонии плоские, с ровным краем, диаметром 3 мм, неспорулирующие, воздушный мицелий светло-коричневый. Выделяют желто-коричневый пигмент. Отличаются от колонии штамма-прототипа.

СР-1 с сахарозой. Колонии пленчатые, с ровным краем, диаметром 3 мм, воздушный мицелий серый, развит слабо. На среде Хоттингера с глюкозой меланоиды не выделяет.

2. Клетки.

При температурах 27 ± 1^оС на плотной среде в возрасте 10-12 сут колонии не имеют ярко выраженного деления на отдельные клетки. В глубинных условиях гифы мицелия разделены на клетки разной длины, диаметр нитей до 1 мкм. Клетки грамположительные. Степень окрашиваемости зависит от возраста и по мере старения снижается. Клеточная стенка имеет слабо выраженный слизистый слой на поверхности. Имеет в своем составе глицин и диаминопимелиновую кислоту. Растворяется лизоцимом, кислото- и спиртоустойчивость для клеток штамма не характерна.

3. Субстратный мицелий на средах с кукурузным экстрактом N 71, соевой, Гаузе 1 с глюкозой, крахмало-аммиачном агаре коричневый; на среде Гаузе 1 развит слабо.

На средах овсяной, Гаузе 2, Ваксмана субстратный мицелий темно-коричневый.

На среде Чапека светло-коричневый.

4. Воздушный мицелий слабо развит на картофельном агаре, среде СР-1 с сахарозой, на овсяной среде, средах Гаузе 1 с глюкозой, Чапека; хорошо развит на средах с кукурузным экстрактом N 71, соевой, гороховой, среде Гаузе 2, Ваксмана, Гаузе 1 с крахмалом. Ветвление гиф моноподиальное.

5. Спорообразование.

При температуре 27 ± 1^оС на 10-12 сут роста образует споры на воздушном мицелии на средах N 71 с кукурузным экстрактом, соевой, овсяной, гороховой средах, среде Гаузе 1 с глюкозой, крахмалом, крахмально-аммиачном агаре, картофельном агаре, СР-1 с сахарозой.

В условиях глубинного культивирования образует глубинные споры.

Спороносцы Str. rimosus С-2 прямые, моноподиально ветвящиеся, споры на спороносце овальные, расположены парами или цепочками. Подвижные клетки отсутствуют.

Физиолого-биохимические признаки.

Для Str. rimosus С-2 характерно аэробное дыхание, условием для которого является доступ кислорода в чашки Петри при культивировании на поверхности агаризованной среды и принудительная аэрация при культивировании в глубинных условиях. Культура является аэрофилом, однако степень аэрофильности ниже, чем у штамма-прототипа.

Штамм С-2 Str.rimosus растет при температуре от 5 до 40^оС, оптимум температуры 27 ± 1^оС. Пределы pH для роста культуры от 5,0 до 8,0, оптимальное значение рH 6,0.

Культура штамма С-2 вирулентного фага не содержит, устойчива к антибиотикам: окситетрациклину, канамицину, ампициллину в разных концентрациях.

Культура штамма С-2 усваивает глюкозу, лактозу, инозит, арабинозу, маннит, сорбит, мальтозу, фруктозу, не усваивает ксилозу, сахарозу, дульцит.

На средах с сернокислым и азотнокислым аммонием усваивает аммонийный азот, на средах с аминокислотами или кукурузным экстрактом усваивает аминный азот. Нитраты на среде Чапека с реактивом Грисса восстанавливает слабо.

Разжижает желатину на 5 сут, пептонизирует молоко на 7 сут, коагуляция молока не наблюдается.

Реакция на гидролиз крахмала интенсивно гидролизует, на 24 ч происходит полное обесцвечивание. Реакция на инверсию сахарозы отрицательная.

Утилизирует крахмал, не утилизирует парафин. Характерными продуктами катаболизма являются углекислый газ, уксусная кислота, пировиноградная кислота.

Биотехнологические признаки.

Штамм С-2 образует до 24,5 тыс. мкг/мл окситетрациклина, в среднем 21,5-22,5 тыс. мкг/мл на 192-216 ч ферментации при определении спектрофотометрическим методом. Сохраняет активность при хранении на твердой среде в течение 10 мес. Не снижает активности в семи генерациях. Способен утилизировать мицелий продуцента пенициллина (отход производства).

П р и м е р 1. Культурой штамма С-2 засевают посевную среду следующего состава, мука кукурузная 7,0; мука соевая 0,5; экстракт кукурузный 4,8 (по технической массе); аммоний сернокислый 0,6; рН 6,5; мел химически осажденный 1,0; вода остальное.

Выращивание проводят при температуре 27 ± 1^оС на качалке с числом оборотов 200 ± 20 в минуту в течение 48 ч.

Полученным посевным материалом в количестве 6% засевают ферментационную среду следующего состава, мука кукурузная 12,0; экстракт кукурузный 2,8 (по технической массе); аммоний сернокислый 1,4; мел химически осажденный 1,4; жир рыбий 3,6; кобальт хлористый 0,0003; лапрол 0,06, вода остальное.

Ферментацию проводят в течение 8 сут при температуре 27 ± 1^оС на качалке с числом оборотов 200 ± 20 в минуту. Содержание окситетрациклина определяют спектрофотометрическим методом. Оно составляет 22 тыс. мкг/мл.

П р и м е р 2. Посевной материал готовят, как указано в примере 1. Полученным посевным материалом засевают среду следующего состава, мука кукурузная 12,0; экстракт кукурузный 2,0 (по технической массе); мицелий продуцента пенициллина (отход производства) 4,0 (по технической массе); аммоний сернокислый 1,4; мел химически осажденный 1,6; жир рыбий 3,6; кобальт хлористый 0,0003; лапрол 0,06; вода остальное. Ферментацию проводят, как в примере 1. Содержание окситетрациклина в культуральной жидкости составляет к концу процесса 24 тыс.мкг/мл.

П р и м е р 3. Посевной материал выращивают на среде, указанной в примере 1, причем делают две генерации. Материалом второй генерации засевают посевную среду такого же состава в посевном аппарате вместимостью 750 л, коэффициент заполнения составляет 0,33. Температура выращивания 27 ± 1^оС, число оборотов мешалки 180 в минуту, избыточное давление 0,04-0,05 МПа. Для пеногашения в аппарат вносят 0,5% рыбьего жира, воздух подают в аппарат в количестве 1 объем загруженной питательной среды в минуту. Процесс выращивания посевного материала в посевном аппарате ведут в течение 25-35 ч, после чего передают в ферментатор, в который загружают предварительно среду следующего состава, мука кукурузная 12,0; экстракт кукурузный 2,8; аммоний сернокислый 1,0; мел химически осажденный 1,4; кобальт хлористый 0,0003; жир рыбий 2,0; амилосубтилин 0,005; вода остальное. Ферментатор вместимостью 3,2 м³ заполняют средой на 73% Режим культивирования штамма: температура 27 ±1^оС, избыточное давление 0,04-0,05 МПа, аэрация 1 объем на объем загруженной среды в минуту. Продолжительность ферментации составляет 193 ч. В процессе ферментации вносят сернокислый аммоний в виде 25%-ного раствора для поддержания содержания аммонийного азота в среде в пределах 20-40 мг% и раствор аммиака для поддержания уровня pН не ниже 5,6.

Для гашения образующейся в процессе ферментации пены используют вначале рыбий жир, потом смесь рыбьего жира с пропинолом в соотношении 10:1.

Содержание окситетрациклина в полученной культуральной жидкости, определенное спектрофотометрическим методом, составляет 21 тыс.мкг/мл.

П р и м е р 4. Подготовку и выращивание посевного материала, процесс ферментации проводят так же, как указано в примере 3, но используют ферментационную среду следующего состава, мука кукурузная 12,0; экстракт кукурузный 1,0; мицелий продуцента пенициллина (отход производства) 4,0 (по технической массе); мел химически осажденный 1,6; кобальт хлористый 0,0003; жир рыбий 2,0; амилосубтилин 0,005; вода остальное. Содержание окситетрациклина в полученной культуральной жидкости в этом случае составляет 24 тыс.мкг/мл.

Преимущество штамма С-2 по сравнению с прототипом подтверждено в процессе полупроизводственных испытаний.

Таким образом, штамм С-2 Streptomyces rimosus выгодно отличается от штамма ЛТС-416 повышенной способностью к образованию окситетрациклина, так как позволяет получить в среднем 22,5 тыс.мкг/мл этого антибиотика в культуральной жидкости на 192-216 ч ферментации, в отличие от штамма ЛТС-416, позволяющего получить 10 тыс.мкг/мл на 180 ч ферментации.

Предлагаемый штамм позволит использовать отpаботанный мицелий производства пенициллина в составе ферментационной среды, что приведет к частичному решению проблемы утилизации отходов производства и позволит получить дополнительный эффект по активности.

Использование: в медицинской промышленности, в производстве антибиотиков. Сущность изобретения: для повышения способности продуцента к накоплению окситетрациклина получен штамм Streptomyces rimosus sobin, Finlay and Kane RJA 2145 путем селекции. Штамм обладает антибиотической активностью, пониженной потребностью в кислороде, утилизирует отход производства - мицелий продуцента пенициллина. При выращивании на органических жидких средах образует до 24 мкг/мл окситетрациклина.

Штамм Streptomyces rimosus Sobin, Finlay and Kane RJA 2145 продуцент окситетрациклина.