ШТАММ STREPTOMYCES NODOSUS 472 ВНИИСХМ Д-666-ПРОДУЦЕНТ АМФОТЕРИЦИНА В Российский патент 2003 года по МПК C12P19/62 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/465 

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается производства антибиотиков.

Задачей данного технического решения являлось получения нового штамма с более высокой производительностью для получения амфотерицина В, который является эффективным противогрибковым препаратом, применяемым в медицинской практике для лечения глубоких и системных микозов. Антибиотик оказывает также противовирусное, противоопухолевое действие и подавляет жизнедеятельность простейших, а также эффективен против различных фитопатогенных грибов у растений. В результате работ был отобран штамм, обладающий высокой способностью синтезировать амфотерицин В.

Известен также штамм 510 продуцента амфотерицина (материалы научной конференции Ленинградского научно-исследовательского института антибиотиков, Ленинград, 1967 г). Однако антибиотическая активность Actinomyces nodosus 510 составляет 1750-2400 ед/мл. Недостатком данного технического решения является невысокая антибиотическая активность.

Предлагаемый штамм Streptomyces nodosus 472 получен селекцией из штамма Actinomyces nodosus 143 с использованием в качестве мутагенов N-нитрозометилмочевины и N-нитрозо-N-метилбиурета.

Штамм продуцирует до 8000 мкг/мл культуральной жидкости. Штамм по изобретению хранится во Всеросийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии под регистрационным номером Д-666 ВНИИСХМ в группе культур, используемых для борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений.

Существенные признаки заявляемого штамма Streptomyces nodosus 472.

Штамм хорошо растет в присутствии глюкозы, фруктозы, ксилозы, рамнозы. Слабо растет в присутствии арабинозы, не растет с сахарозой. Штамм разжижает желатин, не пептонизирует молоко, гидролизует крахмал, на клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты в нитриты.

Формирует хорошо развитый воздушный и субстратный мицелий. На поверхности колоний образует споры цилиндрические с обрезанными краями, оболочка спор гладкая. Размер спор 1,2х2 мк.

Отличительные признаки предлагаемого штамма от известного.

Культурально-морфологические признаки.

Образует спиральные спороносцы с 1-3 завитками.

На среде с кукурузным экстрактом и крахмалом воздушный мицелий темно-серый, по краям светлосерый, среда темно-песочная.

На глицерин-аспарагиновом агаре колонии диаметром от 1 до 5 мм, воздушный мицелий темно-серый, по краю колонии серый. Субстратный мицелий темно-каштановый.

На картофельном агаре колонии серые с ободком светло-серого цвета, выпуклые с радиальными складками.

На овсяном агаре край колонии ровный или расплывчатый.

На органической среде Гаузе колонии мелкие, диаметром от 1 до 3 мм гладкие. Складчатость отсутствует.

Не растет на среде с инозитом. Заявляемый штамм превосходит по уровню биосинтеза амфотерицина В на 15-25% прототип.

Морфолого-культуральные признаки.

Штамм 472 формирует хорошо развитый воздушный и субстратный мицелий. На поверхности колоний образует спиральные спороносцы (1-3 завитка), споры цилиндрические, с обрезанными краями, оболочка спор гладкая. Размер спор 1,2х2,0 мк.

На среде с кукурузным экстрактом и крахмалом ( 21/12) на 21 сутки роста при 28±1^oС формирует колонии диаметром 10-12 мм, выпуклые в центре, с концетрической складкой в центре, от которой отходят 3-4 радиальные складки. Край колонии плоский, неровный. Воздушный мицелий хорошо развит, бархатистый, темно-серый (а-2), по краям светлосерый (а-6). Субстратный мицелий темно-каштановый (о-7), среда темно-песочная (з-6).

На крахмально-аммиачном агаре колонии размером от 2 до 10 мм, слегка выпуклые, с радиальными, иногда концентрическими складками. Воздушный мицелий темно-серый (а-2) или серый (а-5), по краям колонии бледно-сероватый (а-6) или беловатый (д-1), покрывает колонию иногда не полностью, край колонии неровный. Субстратный мицелий шиферный (и-6). Среда бледно-бурая (б-4).

На глицерин-аспарагиновом агаре колонии диаметром от 1 до 5 мм; выпуклые с концентрическими складками. Край колонии ровный или расплывчатый. Воздушный мицелий темно-серый (а-2), по краям колонии серый (а-5). Субстратный мицелий темно-каштановый (о-7). Растворимый пигмент отсутствует.

На овсяном агаре колонии диаметром от 4 до 8 мм, слегка выпуклые с кратером в центре, концентрически складчатые. Край колонии ровный или расплывчатый. Воздушный мицелий серый (а-3), более темный в центре (а-5). Покрывает колонию полностью. Растворимый пигмент отсутствует.

На картофельном агаре колонии мелкие, диаметром от 1 до 3 мм, выпуклые с радиальными складками. Воздушный мицелий серого (а-2) с ободком светло-серого цвета (а-6). Покрывает колонию полностью. Субстратный мицелий коричневый (в-7) или коричнево-бурый (в-2). Среда не окрашена.

На органической среде Гаузе 2 колонии диаметром от 1 до 3 мм, слегка выпуклые в центре, гладкие. Край колонии неровный. Воздушный мицелий часто отсутствует. Субстратный мицелий бледно-песочный (к-3). Растворимый пигмент отсутствует.

На мясопептонном агаре колонии круглые, слегка выпуклые в центре, гладкие. Воздушный мицелий часто отсутствует, реже покрывает колонию, бледно-песочного цвета (к-3). Растворимый пигмент отсутствует.

Физиологические признаки.

На среде Придхема-Готтлиба хорошо растет в присутствии глюкозы, фруктозы, ксилозы, рамнозы, маннита, мальтозы, лактозы. Слабо растет в присутствии арабинозы. Не растет с сахарозой и инозитом. Штамм разжижает желатин, не пептонизирует молоко, гидролизует крахмал. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты в нитриты. Хорошо растет на картофеле.

Условия хранения штамма.

Периодические пересевы через 4 месяца сохранения при 4-6^oС на среде 21/12.

Состав среды 21/12 (в %).

Кукурузный экстракт (по сухому весу) - 0,5; крахмал растворимый - 2,0; аммоний растворимый двузамещенный - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,2; магний сернокислый - 0,025; кальций углекислый - 0,1; агар - 2,0; РН - 6,9-7,0.

Антагонистические свойства.

Проявляет антагонистические свойства в отношении грамположительных бактерий, дрожжей, дрожжеподобных и мицелиальных грибов.

Условия образования амфотерицина В.

Для проведения процесса биосинтеза культуру Streptomyces nodosus штамм 472 используют для засева посевных колб вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды, имеющей следующий состав (в %): соевая мука - 3,0; глюкоза - 2,0; мел - 0,25; натрий хлористый - 0,1; рН после стерилизации - 6,9-7,1. Посевной материал выращивали 28 - 30 часов при (27±1)^oС на качалке с частотой вращения 220-240 об. /мин. Из посевных колб засевают ферментационные колбы вместимостью 750 мл, содержащие 50 мл среды следующего состава (в %): кукурузный экстракт (по техническому весу) - 1,0; глюкоза - 1-1,2; мука кукурузная -5,0-7,0; аммоний сернокислый - 0,5-0,65, мел - 0,5-0,8; рН после стерилизации - 6,9 - 7,1. Количество посевного 10%. Ферментацию проводят при (28±1)^oС в течение 72 часов на качалке с частотой вращения 220-240 об./мин.

Антибиотическая активность в 1 мл культуральной жидкости составляет 7500-8000 мкг/мл.

Штамм Streptomyces nodosus 472 ВНИИСХМ Д-666 получен селекционным путем под воздействием мутагенов N-нитрозометилмочевины и N-нитрозо-N-метилбиурета. Штамм обладает повышенной продуктивностью амфотерицина В - эффективного противогрибкового антибиотика, применяемого в медицинской практике для лечения глубоких и системных микозов.

Штамм Streptomyces nodosus 472 ВНИИСХМ Д-666 - продуцент амфотерицина В.