ШТАММ STREPTOMYCES FRADIAE - ПРОДУЦЕНТ ТИЛОЗИНА Российский патент 1996 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/54 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности производству макролидного антибиотика тилозина, используемого в животноводстве и ветеринарии для лечения сельскохозяйственных животных, а также в качестве стимулятора роста молодняка птицы и крупного рогатого скота.

Известен целый ряд штаммов-продуцентов тилозина, в том числе, штаммы, предназначенные для промышленного производства антибиотика.

Описан, например, штамм STREPTOMYCES FRADIAE Б-45, продуцирующий порядка 1,33 г/л (1330 ед/мл) антибиотика тилозина /1/.

Известен отечественный штамм STREPTOMYCES FRADIAE 3830, синтезирующий на 216 ч ферментации в среднем 3820 ед/мл тилозина /2/.

Недостатком этих штаммов является их относительно низкая продуктивность и биосинтез довольно значительных количеств побочных макролидных продуктов, в частности, дезмиказина.

Цель изобретения получение высокопродуктивного штамма культуры STR. FRADIAE, биосинтезирующего пониженное количество побочных макролидных продуктов.

Новый штамм STR.FRADIAE ВНИИгенетика 25 получен методом мутагенеза.

Штамм депонирован в Коллекции промышленных микроорганизмов Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под регистрационном номером ВКПМ-S-1340.

Полученный штамм образует более благоприятный спектр макролидов, обладая при этом повышенной удельной продуктивностью тилозина, сравнимой с такой штамма прототипа.

В табл. 1 и 2 приведены сравнительные данные по продуктивности штаммов-продуцентов антибиотика тилозина.

Как видно из табл. 1 и 2 предложенный штамм STR.FRADIAE ВНИИгенетика 25 образует несколько больше нативного раствора при значительно более высокой активности и несколько меньше мицелия, чем штамм-прототип, что более благоприятно для реализации способов получения кристаллического тилозина.

Анализ фракционного состава фильтрата культуральных жидкостей, полученных при использовании некоторых штаммов-продуцентов антибиотика тилозина приведен в табл. 3.

Как видно из табл. 3, содержание фракции тилозина в фильтрате культуральной жидкости, полученной при использовании предлагаемого штамма STR. FRADIAE ВНИИгенетика 25, выше на 18 40, чем у известных штаммов, а фракционный состав макролидов более благоприятен.

Новый штамм STR.FRADIAE ВНИИгенетика 25 отличается от прототипа также по скорости синтеза антибиотика тилозина и по генетической стабильности.

Так, новый штамм синтезирует оптимум антибиотика тилозина на 155 160 ч ферментации, тогда, как штамм прототип на 216 ч.

Коэффициент изменчивости (CV) у предлагаемого штамма равен 14 (CV 14), в то время, как у штамма прототипа 32 (CV 32).

Приведенные данные свидетельствуют о преимуществах штамма STR.FRADIAE ВНИИгенетика 25 перед другими продуцентами тилозина.

Предложенный штамм STR.FRADIAE ВНИИгенетика 25, равно, как и известный штамм-прототип, обладает типичными признаками микрооганизмов вида STR. FRADLAE и характеризуется следующей их совокупностью.

Морфологические и культуральные признаки
Клетки мицелия нитевидной формы, спороносцы прямые и крючкообразные, споры гладкие и овальные.

Рост на агаризованных средах Ваксмана и СР-15 на 14 сутки при температуре 29 градусов.

На среде Гаузе образует выпуклые колонии диаметром 6 10 мм, округлые. Воздушный мицелий обильный, белого или светло-серого цвета. Обратная сторона колоний темно-серая.

На среде Ваксмана слаборазвитый белый воздушный мицелий, субстратный мицелий светло-кремовый. Колонии округлые, слегка выпуклые в центре, с диаметром 6 8 мм. Диффундирующий пигмент отсутствует на всех средах.

На жидкой ферментационной среде штамм образует крупные сцепления мицелия с хорошо выраженной базофилией.

На среде СР-15 образует колонии диаметром 6 12 мм, округлые, слегка выпуклые, воздушный мицелий светло-серый или белый с обильной споруляцией. Обратная сторона колонии темно-серая.

Физиологические и биохимические свойства.

Желатин не разжижает, крахмал гидролизует, хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, маннит, рамнозу, слабее арабинозу, ксилозу, лактозу.

Источники азота. Хорошо растет на синтетических питательных средах, содержащих минеральные источники азота (хлористый, азотнокислый и сернокислый аммоний, азотнокислый калий).

При культивировании штамма кроме минеральных источников азота могут быть использованы соевая, кукурузная и рыбная мука, соевый или мясной пептин, казеин.

В качестве источника углерода может быть использован крахмал, меласса, кукурузный экстракт, глюкоза. Источником ростовых факторов может служить дрожжевой экстракт и смесь аминокислот.

Оптимальная величина рН всех используемых сред составляет 7,5 7,7, оптимальный температурный режим лежит в пределах 29 30 градусов.

Штамм сохраняют на скошенном агаре при температуре +4 градуса, в лиофильновысушенном состоянии или при температуре -70 градусов.

Антагонистические свойства
Продуцируемый штаммом антибиотик тилозин подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, сарцин, активен против микоплазмы.

Штамм не патогенен.

Существо предложенного способа более подробно иллюстрируется следующим примером.

Пример. Колонии штамма STR.FRADIAE ВНИИгенетика 25 выращивают в течение 14 суток на агаризованной среде СР-15 следующего состава (мас.): соевая мука 0,5; кукурузный экстракт 0,05; меласса 0,5; крахмал 0,5; сульфат аммония 0,05; сернокислый магний 0,07; хлористый натрий 0,05; углекислый кальций 0,1; агар 2,0.

Затем культуру пересевают на косяки с этой же средой. Культуру на косяках выращивают при температуре 29 градусов в течение 14 суток.

Посевной материал, выращенный на косяках, засевают в колбы Эрленмейера объемом 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава (мас.): мука соевая 0,5; дрожжи БВК 0,3; кукурузный экстракт 0,3; мел 0,3; соевое масло 0,3 мл в каждую колбу.

Инокулят выращивают при температуре 37 градусов в течение 30 ч на качалке, имеющей 240 об/мин.

Затем инокулят в количестве 25% переносят в колбы с ферментационной средой следующего состава (мас.): пшеничная мука 2,0; меласса 2,5; глютен - 1,0; дрожжи БВК 0,25; однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,2; хлористый натрий 0,2; сернокислый магний 0,2; углекислый кальций 0,3; соевое масло по 1,8 мл в каждую колбу.

Ферментацию проводят в течение 150 ч на круговой качалке при 240 об/мин и температуре в первые 10 ч культивирования 37 градусов, а затем при температуре 29 градусов.

Накопление тилозина в фильтрате культуральной жидкости составило 12100 ед/мл. При этом содержание дезмиказина в культуральной жидкости не превышало 4%
Таким образом, достоинствами предлагаемого штамма являются высокая продуктивность, благоприятное соотношение продуцируемых им макролидов (повышенное содержание тилозина и пониженное содержание побочных макролидов), генетическая стабильность, умеренно укороченный цикл ферментации.

Источники информации:
1. Авт.св. НРБ N 20697, кл. С 12 D 9/16, 1978.

2. Авт.св. СССР N 755837, C 12 N 1/15, 1980 прототип. ТТТ1 ТТТ2

Использование: микробиология, получение кормового макролидного антибиотика тилозина. Сущность изобретения: полученный методом мутагенеза штамм Streptomyces fradiae ВНИИгенетика 25-С-продуцент антибиотика тилозина образует не более 4% основного побочного макролида-дезмиказина. Штамм депонирован в Коллекции промышленных микроорганизмов Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ-S-1340. 3 табл.

Штамм Streptomyces fradiae ВКПМ S 1340 продуцент тилозина.