КОМПОЗИЦИЯ СТИМУЛЯЦИИ СЕКРЕЦИИ И ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ ГОРМОНА РОСТА В КРОВИ ЖИВОТНОГО И СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ СЕКРЕЦИИ И ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ ГОРМОНА РОСТА Российский патент 1996 года по МПК A61K38/12 

Описание прототипа
Эта заявка является частичным продолжением находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявки S.N. 861968, поданной 12 мая 1986 г.

Учеными-специалистами было установлено, что повышение уровней гормона роста у млекопитающих при введении ГР-секретирующих соединений может приводить к повышению веса тела и молочной продуктивности, если при введении достигается достаточно высокий уровень гормона роста (c.f. P.K.Baker et al. J. Fnilnal Science 59 (supplement 1), 220 (1984); W.J.Croom et al. J.Dairy Sci. 67, (supplement 1), 109 (1984); S.N.McCutcheon et.al. J.Dairy Sci. 67 (2881 (1984)). Кроме того, известно, что повышение уровня гормона роста у млекопитающих может быть достигнуто путем применения известных веществ, способствующих освобождению гормона роста, таких как эндогенные гормоны, секретирующие гормон роста (CHPH's, N 144-N 149), которые включены в настоящем изобретении в качестве членов группы, обозначенной как "Соединения группы 1" (c. f. P.Brazeau et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 7909 (1982), and M.O.Thorner et al. Lancet 1,24 (1983)). Повышение уровней гормона роста у млекопитающих может также осуществляться при помощи ГР-секретирующих пептидов (ГРП), некоторые из которых были описаны ранее и в настоящем изобретении включены как члены группы, обозначенной как "Соединения группы 2" (c.f.C.Y. Bowers et al. Endocrinology 114, 1537 (1984), F.A.Momany et al. Endocrinology 114,1531 (1984) and C.Y.Bowers, 7th International Congress of Endocrinology Abstract. 464 (1984)). Для повышения ГР-уровней используются также антитела к ингибитору секреции эндогенного ГР-соматостатину. В этом случае уровни гормона роста повышаются путем удаления ингибитора ГР-секреции перед тем, как он достигнет гипофиза, где происходит ингибирование гормона роста (c.f. W.B. Wehrenberg et al. Endocrinology 115, 1218 (1984)). И наконец, было установлено что некоторые соединения, такие как морфин (c.f. C.Rivier et al. Endocrinology 100, 238 (1977)) и другие алкалоиды (c.f. C.Y.Bowers, Endocrinology 117, 1441 (1985)) и DAIa², DLeu⁵- -энкефалинамид (c.f. E.L.Lien et al. Febs Letters 88, 208 (1978)) также выделяют гормон роста путем воздействия на гипоталамус. Описываемые в настоящем изобретении соединения Группы 3 также воздействуют на гипоталамус.

Краткое изложение сущности изобретения
Целью настоящего изобретения является получение новых комбинаций из соединений, секретирующих гормон роста, которые прямо или косвенно способствуют повышению уровней гормона роста в крови млекопитающих. По сравнению с ГР-секретирующими соединениями, описанными ранее, комбинации соединений настоящего изобретения обладают повышенными стабильностью, растворимостью, физиохимическими свойствами и биологической активностью.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение путем введения комбинации активных ингредиентов, описанных подробно ниже, метода повышения ГР-уровней у животных для использования его в промышленном животноводстве.

Другой целью настоящего изобретения является получение каждого из трех различно действующих соединений, секретирующих гормон роста, любое из которых может быть комбинировано различным образом и являться частью различных композиций, чтобы тем самым иметь возможность оптимизировать состав лекарственного средства для различных целей, таких как усиление роста и увеличение производства молока и шерсти.

Каждая из указанных выше групп компонентов и их аналогов действует в качестве стимулятора секреции гормона роста у животных посредством различных механизмов, и поэтому синергическое действие комбинации соединений, рассматриваемых в настоящем изобретении, которое способствует повышению ГР-уровней in vivo, является необычным и неожиданным по сравнению с действием соединений внутри групп, как описано ниже. Более того, величина синергического ГР-ответа на эффективную дозу комбинации соединений между группами не была получена ни для одного соединения в группе при такой же дозе.

Механизм действия соединений, описанных в настоящем изобретении, приводящий к их исключительному синергическому эффекту, еще не вполне ясен на молекулярном уровне. Очевидно, здесь имеет место аддитивное действие комбинации этих соединений. Однако наиболее важные результаты синергического действия этих соединений и их применения будут ясны при дальнейшем рассмотрении этих соединений. Заявителями обнаружено, что описанные в настоящем изобретении соединения Группы 1, действуя синергически с соединениями Группы 2, стимулируют секрецию гораздо большего количества гормона роста, чем отдельные соединения в группах, взятые изолированно в тех же количествах. Кроме того, было обнаружено, что описанные в настоящем изобретении соединения Группы 1, действуя синергически с соединениями Группы 3, стимулируют секрецию гораздо большего количества гормона роста, чем отдельные соединения в группах, взятые изолированно в тех же количествах. Было также обнаружено, что описанные в настоящем изобретении соединения Группы 2, действуя синергически с соединениями Группы 3, стимулируют секрецию гораздо большего количества гормона роста, чем отдельные соединения в группах, взятые изолированно в тех же количествах. Далее, было показано, что определенные соединения Группы 3, как, например, встречающиеся в природе дерморфины, обозначенные ниже как соединения N 8801 и N 8802, также действуют синергично с соединениями Групп 1 и 2, таким образом, комбинационная смесь соединений всех трех групп является сильнодействующей ГР-секретирующей смесью.

Настоящее изобретение позволяет получить комбинации, имеющие синергичное действие, способствующее выделению ГР. Комбинации, описанные в настоящем изобретении, могут быть использованы для повышения ГР-уровней в крови животных, увеличения молочной продуктивности коров, усиления роста млекопитающих, как, например, человека, овец, коров и свиней, а также рыб, домашней птицы и ракообразных, и увеличения производства шерсти и/или меха. Рост тела животного зависит от его пола и возраста, а также от качестве и чистоты вводимого ГР-секретирующего соединения и способа этого введения.

Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новым комбинациям полипептидов, действующих синергически, для стимуляции секреции гормонов роста и повышения его уровня в крови животных. Это изобретение относится также к методам использования этих новых композиций.

В наиболее широком объеме настоящее изобретение направлено на получение эффективной комбинации соединений, способствующей выделению и повышению уровня гормона роста в крови животных и содержащей эффективное количество полипептидов, отобранных по меньшей мере из двух различных групп: полипептидов Группы 1, полипептидов Группы 2 или полипептидов Группы 3, описанных подробно ниже.

В самом широком объеме изобретения понятие "полипептиды Группы 1" включает встречающиеся в природе ГР-секретирующие гормоны, как, например, человеческие, коровьи, свиные, овечьи и крысиные гормоны; такие, как приведенные ниже соединения N 144 N 148 и их функциональные аналоги. Эти пептиды действуют в качестве рецепторов гормонов, способствующих секреции гормонов роста у млекопитающих и других позвоночных, ракообразных и т.п. Характерными пептидами, соответствующими этому определению, являются пептиды, отобранные из любых полипептидов:
(а) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1-44 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
(N 144) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL X,
(N 145) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQERGARVRL X,
(N 146) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQERGARVRL X,
(N 148) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQERGARVRL X,
(N 149) HADAIFTSSYRRILGQLYARKLLHEIMNRQQGERNQEQRSRFM X,
где С-концевая аминокислота имеет следующую усеченную основную формулу:

где каждый R' независимо является заместителем отдельных аминокислотных остатков, например, заместителями водорода, алкила, арила, амино или кислот; X обозначает С-концевую группу и выбирается из -CONH₂, -СОOH, -СOOR, -СОNRR -СН₂ОН и -CH₂OR, где R является алкильной группой, имеющей 1-6 атомов углерода, или ароматическим кольцом, имеющим до 12 атомов углерода. Приведенные выше аббревиатуры аминокислотных остатков используются в соответствии со стандартной номенклатурой пептидов:
G Glу (Глицин)
У Туr (Тирозин)
I1 Ilе (L-Изолейцин)
Е Glu (L-Глутаминовая кислота)
Т Тhr (L-Треонин)
F Phe (L-Фенилаланин)
A Ala (L-Аланин)
К Lys (L-Лизни)
D Asp (L-Аспарагиновая кислота)
С Сys (L-Цистеин)
R Arg (L-Аргинин)
Q GIn (L-Глутамин)
Р Рrо (L-Пролин)
I Leu (L-Лейцин)
М Met (L-Метионин)
S Ser (L-Серин)
N Аsn (L-Аспарагин)
Н Нis (L-Гистидин)
W Тrp (L-Триптофан)
V Val (L-Валик),
в которой буква "D", предшествующая трем основным буквам аббревиатуры означает D конфигурацию аминокислотного остатка.

Хотя на протяжении всего описания изобретения речь идет, главным образом, о стереохимически чистых D и L аминокислотах, следует иметь в виду, что смесь стереоизомеров D/L является также операбельной, однако некоторое снижение уровня биологической активности в зависимости от относительного количества точно не установленной конфигурации все же имеет место. В настоящем описании изобретения встречаются также следующие аббревиатуры дополнительных аминокислот и пептидов:
Аbu альфа-Аминомасляная кислота
Аib альфа-Аминоизомасляная кислота
Аrg (NO₂) 1-Нитро-L-Аргинин
(beta ) Аlа бэта-Аланин (т.е. 3-Аминопропионовая кислота)
Dab 2,4-Диаминомасляная кислота
DOPA 3,4-Дигидроксифенилаланин
GIy-O1 2-Аминоэтанол
Hyp транс-4-Гидрокси-L-Пролин
Met (О) Метионинсульфоксид
Met (0)-01 Спирт метионинсульфоксида
Nle L-Норлейцин
Pal 3-Пиридил Аланин
Pgl Фенилглицин
Sar Саркозин
Sar-01 Саркозиновый спирт
Thz L-Тиазолидин-4-карбоновая кислота либо
Дермофины Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂ (N 8801) либо Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂ (N 8802)
(b) любой один из приведенных выше (а) полипептидов, имеющих следующие заместители аминокислот:
положение 1 (N 144- N 148) занимает DТуr или His
положение 1 (N 149) занимает Tyr или DHis
положение 2 (N 144 N 149) занимает (NМе) DAla или Аib или DAla,
положение 3 (N 144 N 149) занимает DASp,
положение 4 (N 144 N 149) занимает DAla и
положение 1 + 2 (N 144 N 149) занимает
DTyr¹+DAla², DTyr¹+(NMe)DAla²
или DTyr¹+Aib²;
(с) любой из вышеприведенных (а) или (b) полипептидов, имеющих заместитель Nle для Met в положении 27;
(d) любой из вышеприведенных (а), (b) или (с) полипептидов, в котором N-конец NH₂ замещается -NHCOR и в котором R является алкильной группой, имеющей 1-6 атомов углерода или ароматическим кольцом, имеющим до 12 атомов углерода;
(е) фрагменты любого из вышеприведенных (а), (b), (с) или ( d ) полипептидов, которые содержат, по меньшей мере, аминокислотные остатки в положениях 1 29;
(f) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1-29 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
YADAIFTNSYRKVLQQLAARKLLQDIMSR X,
YADAIFTNSYRKVLQQLLARKLLQDIMSR X,
YSDAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR X,
YADAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR X,
YADAIFSSAYRRLLAQLASSRLLQELLAR X,
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR X
(линейный дитиол), и
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR X (циклический дисульфид),
где С концевая аминокислота и X определены выше, и модификация любого из соединений этих групп (f) соответствует модификациям, предложенным в (b), (с) и (d), и
(с) органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеприведенных в (а), (b), (с), (d), (е) или (f) полипептидов Группы 1.

Полипептидами Группы 2, рассматриваемыми в широком объеме изобретения являются пептиды, отобранные из любых полипептидов, имеющих структуру:
Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Cly-Tyr-NH₂;
Ala-His-(формил)DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
(DTrp формилируется у индолазота)
Ala-His-DTrp-Ser-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Cys-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Cys-NH₂ (циклический дисульфид)
Cys-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Cys-NH₂ (свободный дитиол)
DoPA-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Cys-NH₂;
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Ala-Tyr-NH₂;
Lis-Ala-His-Trp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Lis-His-DTrp-Ala-Trp-Asp-NH₂;
Phe-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-Ala-Gly-Thr-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-DAla-Gly-Phe-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Ala-His-XTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂
(^*XTrp выбирается из группы, состоящей из всех N-монометилированных Тrр-изомеров, т.е. (N^αMe)Trp, (N^αMe)DTrp (индол NMe)Trр и (индол NМе)DТrр); Z-His-DTrр-Al а-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
где Z выбирается из группы, состоящей из всех встречающихся в природе L-аминокислот, Met (0), DОРА и Аbu; и органические и неорганические аддитивные соли любого из вышеуказанных полипептидов группы 2.

Полипептиды Группы 3, рассматриваемые в широком объеме изобретения, отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
Tyr-DArg-Phe-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-NH₂;
Tyr-DArg(NO₂)-Phe-NH₂;
Tyr-DMet(0)-Phe-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DThr-Phe-Gly-NH₂;
Phe-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar;
Tyr-DAla-Gly-Phe-NH₂;
Tyr-DArg-Gly-Trp-NH₂;
Tyr-DArg(NO₂)-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DMet(0)-Phe-Gly-NH₂;
(NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH₂;
Try-DArg-Phe-Sar-ol;
Tyr-DAla-Phe-Saf-ol;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH₂;
Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH₂;
Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-GJy-ol;
Tyr-DAla-Gly-(HMe)Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar;
Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH₂;
Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (циклический дисульфид);
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (свободный дитиол)
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (циклический дисульфид);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (свободный дитиол);
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DArq-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂
и органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеприведенных полипептидов Группы 3.

Для лучшего осуществления настоящего изобретения ниже предлагается эффективная комбинация, выделяющая и повышающая гормон роста в крови млекопитающих и содержащая эффективное количество полипептидов, отобранных по меньшей мере из двух различных групп: полипептидов Группы 1, Группы 2 или Группы 3.

Согласно настоящему изобретению понятие "полипептиды Группы 1" включает встречающиеся в природе ГР-секретирующие гормоны, как, например, человеческие, свиные, коровьи, овечьи и крысиные гормоны; такие, как приведенные ниже соединения N 144 N 148 и их функциональные аналоги, которые действуют в качестве рецепторов гормонов, способствующих секреции гормонов роста у млекопитающих и других позвоночных. Соединения, соответствующие этому определению, могут быть любыми из следующих полипептидов:
(а) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1-44 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
(N 144) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL - CONH₂(hGHRH),
(N 145) YADAIFNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGARVRL CONH₂(pGHRH),
(N 146) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL - CONH₂(bGHRH),
(N 148) YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL CONH₂(oGHRH) и
(N 149) YADAIFTSSYRRILGQLYARKLLHEIMNRQQCERNQEQRSRFN (rGHRH);
где значения букв аббревиатуры и определение С-концевых остатков аминокислот приведены выше:
(b) любой из приведенных выше (а), имеющий следующие заместители аминокислот:
положение 1 (N 144 N 148) занимает DTуr или His,
положение 1 (N 149) занимает Туr,
положение 2 (N 144 N 149) занимает (NMe) DAla или Аib или Dalа,
положение 3 (N 144 N 149) занимает DAsp,
положение 4 (N 144 N 149) занимает DAla,
положение 1 + 2 (N 144 N 149) занимает DTyr¹ + DAla²;
(с) любой из вышеприведенных (а) или ( b) полипептидов,
имевших заместитель Nle для Met в положении 27;
(d) любой из вышеприведенных (а), (b) или (с) полипептидов, в которых N-конец -NH₂ замещается -NHCOCH₃;
(е) фрагменты любого из вышеприведенных (а), (b), (с) или (d) полипептидов, которые содержат, по меньшей мере, аминокислотные остатки в положениях 1 29;
(f) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1 - 29 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
YADAIFTNSYRKVLQQLAARKLLQDIMSR-X,
YADAIFTNSYRKVLQQLLARKLLQDIMSR-X,
YSDAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR-X,
YADAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR-X,
YADAIFSSAYRRLLAQLASRRLLQELLAR-X,
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR-X (линейный дитиол) и
YADAIFTMCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR-X (циклический дисульфид),
где С-концевая аминокислота и X определены выше, и модификация любого из соединений этой группы (f) соответствует модификациям, предложенным в (b), (с) и (d), и
(q) органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеприведенных в (a), (b), (c), (d) или (f) полипептидов Группы 1.

Полипептиды Группы 2, рассматриваемые в предпочтительном объеме, отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
DOPA-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Phe-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Ala-Tyr-NH₂;
Lys-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-Ala-His-DTrp-Ala-TrP-DPhe-Lys-NH₂;
Ala-His-(fofmyl)DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂
(DTrp формилируется у индолазота)
Ala-His-DTrp-Ser-Trp-DPhe-Lys-NH₂:
Lys-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Asp-NH₂ and
Z-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂,
где Z выбирается из группы, состоящей из всех встречающихся в природе L-аминокислот, Met(0), DОРА и Аbu; и
органические и неорганические аддитивные соли любого из вышеуказанных полипептидов Группы 2, и
Полипептиды Группы 3 для предпочтительного объема изобретения отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
Tyr-DArg-Phe-NH₂;
Tyr-DArg(NO₂)-Phe-NH₂;
Tyr-DMet(0)-Phe-NH₂;
Tyr-Dala-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar;
Tyr-Dala-Gly-Phe-NH₂;
Tyr-Dala-Cly-(NMe)Phe-Gly-ol;
Tyr-Dala-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-Dala-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-Darg(NO₂)-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DMet(O)-Phe-Gly-NH₂;
(NМе)Туr-DArg-Рhe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-ol;
Tyr-Dala-Phe-Gly-Tyr-NH₂;
Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂
(циклический дисульфид);
Туr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂
(свободный дитиол);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂
(циклический дисульфид);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂
(свободный дитиол);
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-Dala-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂
и органические или неорганические аддитивные соли любого их вышеприведенных полипептидов Группы 3.

Для наилучшего осуществления настоящего изобретения ниже предлагается эффективная комбинация, выделяющая и повышающая гормон роста в крови млекопитающих и содержащая эффективное количество полипептидов, отобранных по меньшей мере из двух различных групп: полипептидов Группы 1, Группы 2 и Группы 3.

Согласно наилучшему осуществлению изобретения "полипептиды Группы 1" означают встречающиеся в природе ГР-секретирующие гормоны, как, например, человеческие, свиные, коровьи, овечьи и крысиные гормоны; такие как приведенные ниже соединения N 144- N 148 и их функциональные аналоги, которые действуют в качестве рецепторов, способствующих секреции гормонов роста у млекопитающих. Соединения, соответствующие этому определению, могут быть любыми из следующих полипептидов:
(а) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1 - 44 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
(N 144) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGE-SMQERGARARL-CONH₂ (hGHRH),
(N 145) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGE-RNQEQGARVRL-CONH₂ (pGHRH),
(N 146) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGE-RNQEQGAKVRL-CONH₂ (bGHRH),
(N 148) YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGE-RNQEQGAKVRL-CONH₂ (oGHRH), и
(N 149) HADAIFTSSYRRILGQLYARKLLHEIMNRQQGE-RNQEQRSRFN-COOH (rGHRH);
где значения букв аббревиатуры и определение С-концевых остатков аминокислот приведены выше;
(b) любой из вышеприведенных (а) полипептидов, имеющих заместители Nle для Met в положении 27,
(с) любой из вышеприведенных (а) или ( b) полипептидов, в которых N-конец NH₂ замещается NHCOCH₃,
(d) фрагменты любого из вышеприведенных (а), (b) и (с) полипептидов, которые содержат, по меньшей мере, аминокислотные остатки в положениях 1 29,
(е) имеющих следующие аминокислотные поcледовательности в положениях 1 - 29 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
YADAIFTNSYRKVLQQLAARKLLQDIMSR X,
YADAIFTNSYRKVLQQLLARKLLQDIMSR X,
YSDAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMOR X,
YADAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMOR X,
YADAIFSSAYRRLLAQLASRRLLQELLAR X
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR X (линейный дитиол)
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR X (циклический дисульфид),
где С концевая аминокислота и X определены выше, и модификация любого из соединений группы (е) соответствует модификациям, предложенным в (b), (с) и (d), и
(f) органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеприведенных в (а), (b), (с), (d) или (е) полипептидов Группы 1, рассматриваемые в наиболее предпочтительном осуществлении настоящего изобретения, отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
DOPA-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Ala-Tyr-NH₂;
Lys-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Phe-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH₂;
Z-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂
где Z выбирается из группы, содержащей Ala, Val, Dopa, Trp, Met, Lys, Asp, Met (O), Lee, Abu, и Arg, и органические и неорганические аддитивные соли любого из вышеуказанных полипептидов Группы 2, и
Полипептиды Группы 3, рассматриваемые в наиболее предпочтительном осуществлении настоящего изобретения, отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
Tyr-DArg-Phe-NH₂,
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂,
Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂,
Tyr-DArg-Phe-Sar,
Tyr-DAla-Gly-Phe-NH₂,
Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-oI,
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂,
Tyr-DAla-Phe-Sar-NH₂,
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂,
Tyr-DArg-(NO₂)-Phe-Gly-NH₂,
Tyr-DMet-(O)-Phe-Gly-NH₂,
(NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂,
Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂,
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂,
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂,
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂,
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂,
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Plo-Ser-NH₂,
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyr-Ser-NH₂
и органические и неорганические аддитивные соли любого из этих полипептидов Группы 3.

Данное изобретение также относится к методу, способствующему секреции и повышению уровня гормона роста в крови животных и заключающемуся в введении эффективной дозы композиции, содержащей полипептиды, выбранные по меньшей мере из двух различных групп: полипептидов Группы 1, Группы 2 или Группы 3.

При осуществлении настоящего изобретения в его широком объеме понятие "полипептиды Группы 1" включает встречающиеся в природе ГР-секретирующие гормоны, как, например, человеческие, свиные, коровьи, овечьи и крысиные гормоны, такие как приведенные ниже соединения и их функциональные аналоги. Такие соединения действуют в качестве рецепторов гормона, способствующего секреции гормонов роста у млекопитающих и других позвоночных и ракообразных. Пептиды, соответствующие этому определению, могут быть любыми из следующих полипептидов:
(а) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1-44 (пронумерованных от N-конца до C-конца):
(N 144) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL X,
(N 145) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGARVRL X,
(N 146) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL X,
(N 148) YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL X,
(N 149) HADAIFTSSYRRILGQLYARKLLHEIMNRQQGERNQEQRSRFN X,
где С-концевая аминокислота имеет следующую усеченную основную формулу:

где каждый R' независимо является заместителем аминокислотных остатков, например заместителем водорода, алкила, арила, амино или кислот; X обозначает С-концевую группу и выбирается из -CONH₂, -ОСОH, -COOR, CONRR -CH₂OH и -CH₂OR, где R является алкильной группой, имеющей 1-6 атомов углерода или ароматическим кольцом, имеющим до 12 атомов углерода;
(b ) любой из приведенных выше (а) полипептидов, имеющих следующие заместители аминокислот:
положение 1 (N 144 N 148) занимает DTyr или Нis,
положение 1 (N 149) занимает Туr или DHis,
положение 2 (N 144 N 149) занимает (NMe DALа или Аib или DАla,
положение 3 (N 144 N 149) занимает DASp,
положение 4 (N 144 N 149) занимает Dala и
положение 1 + 2 (N 144 N 149) занимает
Tyr¹ + Аla², Тyr¹ + (NMe) Dalа² или DTyr¹ + Аib²;
(с) любой из вышеприведенных (а) или (b) полипептидов, имеющих заместитель Nle для Met в положении 27,
(d ) любой из вышеприведенных (а), (b) или (с) полипептидов, в котором N-конец NH₂ замещается NНСОR и в котором R является алкильной группой, имеющей 1-6 атомов углерода, или ароматическим кольцом, имеющим до 12 атомов углерода;
(е) фрагменты любого из вышеприведенных в (а), (b), (с) или (d) полипептидов, которые содержат, по меньшей мере, аминокислотные остатки в положениях 1-29,
(f) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1 - 29 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
YADAIFTNSYRKVLQQLAARKLLQDIMSR X, YADAIFTNSYRKVLQQLLARKLLQDIMSR X,
YSDAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR-X,
YADAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR-X,
YADAIFSSAYRRLLAQLASRRLLQELLAR-X,
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR-X
(линейный дитиол) и
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR-X
(циклический дисульфид),
где С-концевая аминокислота и X определены выше, и модификация любого из соединений этих групп (f) соответствует модификациям, предложенным в (b), (с) и (d), и
(g) органические и неорганические аддитивные соли любого из вышеприведенных в (a), (b), (c), (d), (c) или (f) полипептидов Группы 1.

Полипептиды Группы 2, рассматриваемые в широком объеме осуществления настоящего изобретения отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Gly-Tyr-NH₂;
Ala-His-DTrp-Ser-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Alа-His-(formyl)DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂
(DTrp формилируется у индолазота)
Cys-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Cys-NH₂
(циклический дисульфид)
Суs-Ala-Нis-DТrр-Ala-Тrр-DРhе-Lys-Суs-NH₂
(свободный дитиол)
DOPA-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Ala-Tyr-NH₂;
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Lys-Нis-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Asp-NH₂;
Lys-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Phe-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-Ala-Gly-Thr-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-DAla-Gly-Phe-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe- -Lys-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe- -Lys-NH₂;
Ala-His-XTrp^*-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ (^*XTrp отбирается из группы, состоящей из всех N-монометилированных Тrр изомеров, т.е. (N^αMe)Trp, (N^αMe)DTrp, (индол NМe)Тrр и (индол NМe)DТrр;
Z-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
где Z выбирается из группы, состоящей из всех встречающихся в природе L-аминокислот, Met(0), DOPA и Аbu;
и органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеуказанных полипептидов Группы 2; и
Полипептиды Группы 3, рассматриваемые в широком объеме осуществления настоящего изобретения, отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
Tyr-DArg-Phe-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-NH₂;
Tyr-DArg(NO₂)-Phe-NH₂;
Тyr-DMet(0)-Phe-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Туr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Туr-DThr-Phe-Gly-NH₂;
Рhe-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar;
Tyr-DAla-Gly-Phe-NH₂;
Tyr-DArg-Gly-Trp-NH₂;
Tyr-DArg(NO₂)-Phe-Gly-NH₂;
Туr-DMet(0)-Phe-Gly-NH₂;
(NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-ol;
Tyr-DAla-Phe-Sar-ol;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH₂;
Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH₂;
Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-ol;
Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar;
Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH₂;
Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (циклический дисульфид);
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (свободный дитиол);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (циклический дисульфид);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (свободный дитиол);
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DArq-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеприведенных полипептидов Группы 3.

В наиболее предпочтительном осуществлении настоящего изобретения метод, способствующий секреции и повышению уровня гормона роста в крови животных и заключающийся в введении эффективной дозы композиции, содержащей полипептиды, выбранные по меньшей мере из двух различных групп: полипептидов Группы 1, Группы 2 или Группы 3.

В самом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения применительно к методу, способствующему выделению и повышению ГР в крови млекопитающих, понятие "полипептиды Группы 1" включает встречающиеся в природе ГР-секретирующие гормоны, как, например, человеческие, свиные, коровьи, овечьи и крысиные гормоны, такие как приведенные ниже соединения N 144-148, и их функциональные аналоги. Эти полипептиды действуют как рецепторы гормона, способствующего секреции гормона роста у млекопитающих и других позвоночных. Соединения, соответствующие этому определению, могут быть любыми из следующих полипептидов:
(а) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1-44 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
(N 144) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGE-SNQEKGARARL-CONH₂ (hGHRH),
(N 145) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGE-RNQEQGARVRL-CONH₂ (pGHRH),
(N 146) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGE-RNQEQGAKVRL-CONH₂ (bGHRH),
(N 148) YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGE-RNQEQGAKVRL-CONH₂ (oGHRH) и
(N 149) HADAIFTSSYRRILGQLYARKLLHEIMNRQQGE-RNQEQRSRFN-COOH (rGHRH),
где значения букв аббревиатуры аминокислотных остатков, включая С-концевой аминокислотный остаток, приведены выше;
(b) Любой из вышеприведенных в (а) полипептидов, имеющих следующие заместители аминокислот:
положение 1 (N 144 N 149) занимает DTyr или His,
положение 1 (N 149) занимает Туr,
положение 2 (N 144 N 149) занимает (NMe) Dala или Aib или Dala,
положение 3 (N 144 N 149) занимает Dasp,
положение 4 (N 144 N 149) занимает Dalа,
положение 1 + 2 (N 144 N 149) занимает DTy¹ + Аlа²,
(c) любой из вышеприведенных в (а) или (b) полипептидов, имеющих заместитель Nle для Met в положении 27,
(d) любой из вышеприведенных (а), (b) или (с) полипептидов, в котором N-конец NH₂ замещается -NHCOCH₃, и
(е) фрагменты любого из вышеприведенных в (а), (b), (с) или (d) полипептидов, которые содержат, по меньшей мере, аминокислотные остатки в положениях 1 29,
(f) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1-29 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
VADAIFTNSYRKVLQQLAARKLLQDIMSR X, YADAIFTNSYRKVLQQLLARKLLQDIMSR X, YSDAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR X, YADAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR X,
YADAIFSSAYRRLLAQLASRRLLQELLAR X, (линейный дитиол), и
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR X (циклический дисульфид),
где С-концевая аминокислота и X определены выше, и модификация любого из соединений этих групп (f) соответствует модификациям, предложенным в (b), (с) и (d), и
(g) органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеприведенных в (а), (b), (с), (d), (е) или (f) полипептидов Группы 1.

Полипептиды Группы 2, рассматриваемые в настоящем изобретении при его предпочтительном осуществлении, отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂,
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Ala-Tyr-NH₂,
Lys-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂,
Tyr-Ala-His-DTrp-ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂,
DOPA-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂,
Phe-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂,
Ala-His- (формил) DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂,
(DTrp формилируется у индолазота)
Ala-His-DTrp-Ser-Trp-DPhe-Lys-NH₂,
Lys-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Asp-NH₂,
Z-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂
где Z выбирается из группы, состоящей из всех встречающихся в природе L-аминокислот, Met (O), DOPa и Abu,
и органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеуказанных полипептидов Группы 2; и
Полипептиды Группы 3, рассматриваемые при предпочтительном осуществлении настоящего изобретения, относящегося к методу, отбирается из любых полипептидом, имеющих структуру:
Tyr-DArg-Phe-NH₂;
Tyr-DArg(NO₂)-Phe-NH₂;
Туr-DMet(O)-Phe-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar;
Tyr-DAla-Gly-Phe-NH₂;
Туr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol;
Туr-DAla-Phe-Sar-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Sar-NH₂;
Туr-DArg(NO₂)-Phe-Gly-NH₂;
Туr-DMet(O)-Phe-Gly-NH₂;
(NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Gly-ol;
Туr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH₂;
Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (циклический дисульфид);
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (свободный дитиол);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (циклический дисульфид);
Туr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (свободный дитиол);
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Sef-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂,
и органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеуказанных полипептидов Группы 3.

В наиболее предпочтительном своем осуществлении данное изобретение дает метод, способствующий секреции и повышению уровня гормона роста в крови млекопитающих и включающий введение эффективной дозы композиции, содержащей полипептиды, выбранные по меньшей мере из двух различных Групп: полипептидов Группы 1, Группы 2 или Группы 3, предлагающихся ниже.

Согласно наиболее предпочтительному осуществлению настоящего изобретения применительно к методу, способствующему выделению и повышению ГР в крови млекопитающих, понятие "полипептиды Группы 1" включает встречающиеся в природе ГР-секретирующие гормоны, как, например, человеческие, свиные, коровьи, овечьи и крысиные гормоны, такие как приведенные ниже соединения N 144 148 и их функциональные аналоги, которые действуют как рецепторы гормона, способствующего секреции гормона роста у млекопитающих. Соединения, соответствующие этому определению, могут быть любыми из следующих полипептидов:
(а) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1 - 44 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
(N 144) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESMQERGARARL-CONH₂ (hGHRH),
(N 145) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGARVRL-CONH₂ (pGHRH),
(N 146) YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLDIMNRQQGERNQEQGAKVRL-CONH₂ (bGHRH),
(N 148) YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLDIMNRQQGERNQEQGAKVRL-CONH₂ (oGHRH), и
(N 149) HADAIFTSSYRRILGQLYARKLLHEIMSRQQGERNQEQRSRFN-COOH (rGHRH),
где значения букв аббревиатуры аминокислотных остатков, включая С-концевой аминокислотный остаток, определены выше;
(b) любой из вышеприведенных в (а) полипептидов, имеющих заместитель Nle для Met в положении 27;
(с) любой из вышеприведенных в (а) или (b) полипептидов, в которых N-конец NH₂ замещается на -NHCOCH₃;
(d) фрагменты любого из вышеприведенных в (а), (b) или (с) полипептидов, которые содержат, по меньшей мере, аминокислотные остатки в положениях 1-29,
(е) имеющих следующие аминокислотные последовательности в положениях 1-29 (пронумерованных от N-конца до С-конца):
YADAIFTNSYRKVLQQLAARKLLQDIMSR X, YADAIFTNSYRKVLQQLLARKLLQDIMSR X, YSDAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR X, YADAIFSNAYRKILQQLLARKLLQDIMQR X, YADAIFSSSAYRRLLAQLASSRLLQELLAR X,
YADAIFTNCYRKVLCQLSARKLLQDIMSR X (линейный дитиол) и
YADAIFTNCYRKVLGQLSARKLLQDIMSR X (циклический дисульфид),
где С-концевая аминокислота и X определены выше и модификация любого из соединений этих групп (е) соответствует модификациям, предложенным в (b ), (с) и (d) выше;
(f) органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеприведенных в (а), (b), (с), (d) или (е) полипептидов Группы 1.

Полипептиды Группы 2, рассматриваемые в настоящем изобретении при наиболее предпочтительном его осуществлении, отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Ala-Tyr-NH₂;
Lys-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Tyr-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
DОPA-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Phe-Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
Z-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂;
где Z выбирается из группы, состоящей из Ala, Val, DOPA, Trp, Met, Lys, Asp, Met(O), Leu и Arg,
и органические или неорганические соли любого из вышеуказанных полипептидов группы 2; и
Полипептиды Группы 3, рассматриваемые в наиболее предпочтительном осуществлении настоящего изобретения, относящегося к методу, отбираются из любых полипептидов, имеющих структуру:
Tyr-DArg-Phe-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂;
Туr-DArg-Phe-Sar;
Туr-DAla-Gly-Phe-NH₂;
Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol;
Туr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Sar-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg(NO₂)-Phe-Gly-NH₂;
Tyr-DMet(O)-Phe-Gly-NH₂;
(HMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂;
Gly-Tyr-Arg-Phe-Gly-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pfo-Ser-NH₂;
Tyr-DAla-Phe-Cly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
Туr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂;
Tyr-DArg-Phe-Cly-Tyr-Pfo-Ser-NH₂;
Tyr-DAr9-Phe-Cly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂;
и органические или неорганические аддитивные соли любого из вышеуказанных полипептидов Группы 3.

Данное изобретение, кроме того, предусматривает специфические комбинации полипептидов и методы использования таких комбинаций.

Изготовление cоединений
Вещества, описанные в настоящем изобретении, могут быть синтезированы обычными методами растворения и твердофазного пептидного синтеза или обычными классическими методами, известными специалистам. Твердофазный синтез начинается с С-концевого аминокислотного остатка пептида. Соответствующее исходное вещество может быть получено, например, путем присоединения нужной защищенной α-аминокислоты к хлорометилированной смоле, гидроксиметиловой смоле, бензгидриламиновой смоле (BHA) или пара-метил-бензолгидриламиновой смоле (р-Ме-ВНA). Хлорметиловая смола продается Bio Rad Laboratories, Ричмонд Калифорния под товарным знаком BIOBEADS Х-1. Изготовление гидроксиметиловой смолы описано Bodansky et al. Chem.Ynd. (London) 38, 1597 (1966). Смола ВНA описана Pietta и Marshall, Chem.Commn. 650 (1970) и практически может быть получена от Penninsula Laboratories Jnc. Бальмонт, Калифорния или Beckman Ynstruments, Jnc. Palo Alto, Калифорния, в ее хлористоводородной форме (ВНA.НСl).

После начального присоединения альфа-амино защитная группа может быть удалена путем подкисляющих реагентов, содержащих растворы трифторуксусной кислоты (TFA) или соляной кислоты (НСl) в органических растворителях, при комнатной температуре. После удаления альфа-амино защитной группы оставшиеся защищенные аминокислоты могут быть присоединены поэтапно в любом желаемом порядке. Каждая защищенная аминокислота может реагировать свыше 3 раз при использовании в качестве активатора соответствующей карбоксильной группы, такой как дициклогексикарбодиимид (DCC) в растворе, например в метиленхлориде (CH₂Cl₂) или диметилформамиде (DМF) и их смесях.

После получения нужной аминокислотной последовательности пептид может быть очищен от смолы путем обработки реагентом, как, например, фтороводород (HF), который не только очищает пептид от смолы, но и также очищает обычно используемые боковые защитные группы. При использовании хлорметиловой или гидроксиметиловой смолы НF-обработка приводит к образованию свободной пептидной кислоты. При использовании ВНA или р-Ме-ВНA-смолы, НF-обработка приводит к образованию непосредственно свободных пептидных амидов. Описанный выше твердофазный синтез хорошо известен специалистам и описывается Stewart u Young, Solid Phase Peptide Synthesis: (Freeman u lo. San Francissco, (1969).

В настоящем изобретении может быть использован также хорошо известный метод синтеза частей пептида метод растворения, предложенный Bodansky et al. Peptide Synthesis, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York, N.Y. 1976.

Композиции
Настоящее изобретение включает в своем объеме соединения, содержащие в качестве активных ингредиентов по меньшей мере два соединения или их аналоги, описанные выше, или их аддитивные соли, или их фармацевтически приемлемые соли в сочетании с наполнителями, разбавителями, связующими веществами или покрытиями.

Органические или неорганические аддитивные соли ГР-секретирующих соединений и их комбинации, рассматриваемые в объеме настоящего изобретения, включают соли органических частей, такие как ацетат, трифторацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафталат и т.п. и соли неорганических частей Группы 1 (т.е. соли щелочных металлов) и Группы 2 (т. е. соли щелочно-земельных металлов), соли аммония и протомина, цинка, железа и т.п. наряду с такими солями как хлорид, бромид, сульфат, фосфат и т.п. а также с указанными выше органическими солями.

Фармацевтически приемлемые соли являются предпочтительными, если они вводятся в человеческий организм. Это соли нетоксичных щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и соли аммония, которые обычно используются в фармацевтической промышленности, например соли натрия, калия, лития, магния, бария, аммония и протамина, которые получаются хорошо известными специалистам методами. Это понятие включает также нетоксичные кислые аддитивные соли, которые в основном получаются путем взаимодействия соединений настоящего изобретения с соответствующими органическими или неорганическими кислотами. Характерными представителями таких солей являются гидрохлорид, гидробромид, сульфат, бисульфат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, нитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, напсилат и т.п.

Настоящее изобретение будет описано более подробно благодаря приводящимся ниже примерам, которые при этом не ограничивают применение этого изобретения.

Пример 1. In vivo Гр-секреция у крыс
Незрелые самки крыс Sprague-Dawtey были получены из Charles River Laboratories (Vilmington, МА). После рождения они были в помещении с температурой 25^oС и с режимом: 14:10 час день:ночь. По желанию можно взять водяных крыс и крыс Purina. Крысята были при матери до возраста 21 д.

Наполнителем для подкожного (S.c) и внутривенного (i.v.) введения пептидов являлся нормальный физиологический раствор с 0,1% желатина. В некоторых экспериментах, в которых брались хорошо растворимые пептиды, для растворения соединений используется диметилсульфоксид (DMSO) с последующим разбавлением физиологическим раствором с 0,1% желатином до определенной концентрации (соединения, для которых необходим МО, указаны в таблицах). ГР-секретирующие соединения, приведенные в таблицах 1-4, вводятся путем инъекций i.v. неанестезированным крысам весом 55-65 г. Инъекция была введена в хвостовую вену в виде раствора в количестве 0,2 мл. Через 10 мин после последней инъекции всем крысам отрубались головы (если не оговорено особо). После этого собиралась кровь туловища для определения уровней гормона роста. После того как кровь свертывалась, ее центрифугировали и приготавливали сыворотку. Сыворотку замораживают до взятия проб для определения уровней гормона роста методом радиоиммуноанализа (РИА) посредством следующих процедур, предложенных Национальным институтом по исследованию артрита, диабета, желудочно-кишечных заболеваний и заболеваний почек (NIADDК).

Реагенты обычно добавляются в одноразовые пипетки для РИМ, охлаждены при температуре около 4^oС в следующей последовательности:
(а) буфер,
(b) "холодный" (т.е. нерадиоактивный) стандарт или проба исследуемой сыворотки для анализа,
(с) радио-иодинированный антиген гормона роста и
(d) антисыворотка гормона роста.

Добавление реагента обычно проводится таким образом, чтобы добиться конечного состава пробирки около 1:30000 (антисыворотки к общему объему).

Смешанные реагенты затем инкубируются при комнатной температуре (около 25^oС) в течение 24 ч с предварительным добавлением вторичного антитела (например, козьей или кроличьей антисыворотки к обезьяньему гамма-глобулину), которое связывается и вызывает преципитацию ГР-антисыворотки. Затем преципитат, образовавшийся в РИМ-пробирках, просчитывали на g-счетчике. Стандартная кривая строилась путем нанесения на график просчитанного радиоактивного уровня гормона роста. Неизвестные уровни детектируемых образцов определялись путем сравнения со стандартной кривой.

ГР сыворотки измерялся при помощи реагентов, предоставленных Национальной программой гормонов и гипофиза.

Уровни сыворотки в таблицах 1-4 были рассчитаны в нг/мл на основании ГР-стандарта для крыс 0,61 Международных единиц/мл (IU/мg). Приведенные данные регистрировались со средним стандартным разбросом (±) ошибки (ЕМ). Статистический анализ проводился при помощи t критерия Стьюдента.

Результаты для комбинаций соединений полипептидов, взятых из Групп 2 и 3, представлены в таблицах 1-3. Результаты для комбинаций соединений полипептидов, взятых из Групп 1 и 3, представлены в таблице 4. Результаты для комбинаций соединений полипептидов, взятых из Групп 1 и 2 представлены в таблице 4. В каждой из четырех таблиц приводятся средние данные испытаний с шестью крысами.

В таблице 1 соединения Группы 2 показали синергическое действие совместно с двумя различными соединениями Группы 3. Представлены несколько различных испытаний соединения N 8114 совместно с соединениями N 8801 и/или N 9218, в которых синергизм ярко выражен. Было также исследовано много дополнительных комбинаций соединений Группы 2, которые вводились в сочетании с соединениями N 8801 и/или N 9218. Было отмечено, что во всех случаях для соединений Группы 2, когда любое соединение, взятое для ГР-секреции, добавлялось к другому отдельному соединению, взятому для ГР-секреции, количество секретируемого ГР было значительно меньше, чем при одновременном введении их крысам подкожно или другими методами. Таким образом, синергизм действия этих соединений очевиден. Очевидно также, что наблюдаемый синергизм не является функцией премикса соединений, а является результатом механизма их совместного действия, вызываемого присутствием обоих компонентов.

В таблице 1 представлены также несколько соединений, сходных по структуре с соединениями Группы 2, определение которых приводится в тексте описания. Первые девять соединений таблицы 1, обозначенные ** и являющиеся структурно близкими к соединениям Группы 2, не показали синергичного ответа при введении их в сочетании с соединением N 8801 или N 9218. Таким образом, вполне очевидно, что неожиданный синергический эффект, наблюдаемый при осуществлении настоящего изобретения, не является обычным явлением, а лишь результатом совместного действия специфических соединений, таких как полипептиды Группы 1, Группы 2 и Группы 3, определение которых дается в тексте настоящего описания.

В таблицах 2 и 3 увеличение секреции ГР в крови, вызванной различными тетра-, пента- и гептапептидами Группы 3 в сочетании с соединением N 8114 (Группа 2). Даже при малой дозе этих соединений наблюдался синергический ответ. В таблице 3 представлены также соединения (обозначенные *), сходные по структуре с соединениями Группы 3, однако они не доказали синергичного ответа в комбинации с соединениями Группы 1 и/или Группы 2. Этот результат показывает, что необычный синергичный ответ наблюдается лишь при совместном действии специфических соединений настоящего изобретения, определение которых приводится в тексте описания.

В таблице 4 приводятся результаты комбинированного действия соединений Групп 1, 2 и 3. Так как ответ на введение трехкомпонентной комбинации соединений значительно выше, чем сумма ответов каждого из трех отдельных соединений, значительный ГР-ответ имеет место даже при малых дозах. Действительно, как показано в таблице 4, при равных дозах З mг (3 + 3 + 3) можно было бы ожидать ответной ГР-секреции лишь в несколько сотен нг/мл, если бы этот результат был бы следствием аддитивного действия. Однако в действительности эта трехкомпонентная смесь вызывает секрецию приблизительно 2000 нг/мл ГР при этих малых дозах.

Пример 2. Исследование роста крыс
В таблице 5 представлены результаты исследований, которые проводились с крысами, обработанными комбинацией His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ (соединение N 8938, Группа 2) + СНРН (гормон человека, секретирующий гормон роста: соединение N 144-NH₂, см. группу 1). Неанестезированным самкам крыс ежедневно вводились в хвостовую вену солевой раствор или 10 г каждого из соединений N 8938 + N 144-NH₂. Инъекции начинали вводить, когда крысы достигали возраста 21 день.

Наблюдаемое увеличение веса тела, которое составляло 11,7% относительно изменений в весе контрольных животных, убедительно свидетельствует об эффективности комбинированной терапии.

Пример 3
In vivo исследование высвобождения гормона роста у ягнят
Самки ягнят (17-22 кг) помещались в отдельные клетки при комнатной температуре 24^oС и с циклом день-ночь: 12 ч 12 ч. Ягнята получали поддерживающую диету, содержащую размолотое зерно (43,3), соевую муку (7,1), шелуху семян хлопчатника (38,1), мелассу (8,6) и минерально-витаминную смесь (2,9).

Различные дозы дерморфина (соединение N 8801) в комбинации с различными дозами соединения N 8114 смешивались и растворялись в 200 мкл 10 мм уксусной кислоты с добавленными 5 мл буферного солевого раствора фосфата (РВ). Ягнята были катеризированы через яремную вену. Внутривенное вливание осуществлялось при помощи многоканального инфузионного насоса (модель 600-900, Harvarel Appanat Co. IC, Dover Mass) с заранее установленной скоростью вливания 1,36 мл/мин. Образцы брались через каждые 20 мин, начиная за 1 ч до вливания и продолжая в течение 3-4 ч после вливания. Дополнительные пробы брались в 10 мин, + 5 мин и + 10 мин. Извлеченные пробы крови осаждались в обработанные этилендиаминтетрауксусной кислотой пробирки для приготовления плазмы. ЕDТA-обработанная плазма исследовалась на ГР при помощи стандартного РИА вторичного антитела.

Метод радиоиммуноанализа гормона роста ягнят
Реагенты
1. Фосфатно-солевой буфер (0,15 М NaCl 0,012 М фосфата) (PSВ): Добавляется 5,14 г NaH₂PO₄•H₂O (одноосновный) и 26,6 г хлорида натрия в 2,95 л дистиллированной воды.

Добавляется 2,0 М гидроокиси натрия по капле до получения рН, равного 7,5.

В качестве антикоагулянта добавляется 3 мл мертиолата.

Количество раствора доводится до общего объема 3,0 л.

Хранится при температуре 4^oС.

2. Фосфатно-солевой буфер с 1% альбумином бычьей сыворотки (PBSA):
Коммерчески доступный 30% раствор альбумина бычьей сыворотки тридцатикратно разбавляют фосфатно-солевым буфером (РSB). Хранится при 4^oС и используется без дальнейшего разбавления.

3. Антисыворотка овечьего гормона роста (кроличий):
Хранится в замороженном виде при разбавлении 1:10 (как получено). Рабочее разбавление составляет 1:20000. Раствор готовится в расчете на работу в течение одной недели. Хранится при 4^oС.

4. Овечий гормон роста:
Приготавливается и хранится в замороженном виде в пробирках (2,5 mг/0,5 мл РВSА на пробирку).

5. Овечий гормон роста, помеченный радиоактивным йодом (приблизительно 10000 отсчетов в мин/100 мкл).

6. Козий антикроличий гамма-глобулин
(предлагаемый источник: Antibodies, Jnc. Cambridge Medical Diagnostics, Jns.)
Хранится в охлажденном виде в 1 мл аликвотной пробы.

7. 6% полиэтиленгликоля (РЕG) в PSB:
Берется 6,0 г РЕG 6000.

Разбавляется до 100 мл в РSВ (см. п.1).

Хранится при 4^oС.

8. 0,05 М ЭДТА:
Берется 1,9 г тетранатриевая соль (Этилендинитрило)-тетрауксусной кислоты.

Разбавляется до 100 мл в PSB (см. п.1).

рН доводится до значения 7,5 при помощи NaОН.

Хранится при 4^oС.

9. Нормальная кроличья сыворотка (NRS)
Хранится в охлажденном виде в 1,0 мл.

10. Нормальная кроличья сыворотка: (1:400) (NRS:ЭДТА)
0,25 мл NRS разбавляется до 100 мл 0,05 М ЭДТА (см.8).

Хранится при 4^oС.

Метод анализа (для 250 пробирок)
День 1.

Стеклянные пробирки 12 х 75 размечают следующим образом:
Пробирки 1-2 (используются для измерения неспецифичного связывания NSB.

Пробирки 3-4 (используются для определения максимума связывания Вo).

Пробирки 5-6 (используются для измерения общего количества).

Пробирки 7-18 (используются для стандартов А-F).

Начиная с пробирки 19, две пробирки последовательно нумеруются для каждого контроля и исследуемой пробы.

2. 4,5 РВSА добавляется к 2,5 mг /0,5 мл массы с овечьим ГР. (Концентрация составляет теперь 500 нг/мл).

Дальнейшее разбавление стандартов проводится следующим образом:
А 0,25 нг/100 мкл --> разбавляется DI/10 (100 мкл + 900 мкл РВSА)
В 0,5 нг/100 мкл --> разбавляется EI/10 (100 мкл + 900 мкл PBSA)
С 1 нг/100 мкл --> разбавляется FI/10 (100 мкл + 900 мкл PBSA)
D 2,5 нг/100 мкл --> разбавляется масса 1/20
(50 мкл + 950 мкл РВSА)
Е 5 нг/100 мкл --> разбавляется масса 1/10
(100 мкл + 900 мкл)
F 10 нг/100 мкл --> разбавляется масса 1/5
(200 мкл + 800 мкл РВSА)
3. Разбавляется антисыворотка овечьего гормона роста (раствор 1:10) в отношении 1:20000 (25 мкл антисыворотки + 49,98 мл 1:400 Р:ЭДТА).

4. Добавляется 200 мкл NRS ЭДТА + 500 мкл PBSA в пробирки 1 и 2 (для определения NSB).

5. В пробирки 3 и 4 добавляют 500 мкл РBSА (для определения Во).

6. Добавляют 100 мкм Стандартов А F, контрольных проб или испытываемых проб следующим образом (см. табл. 5а).

7. К стандартам А F и всем пробам добавляется 400 мкл РВSА.

8. Во все пробирки, за исключением NSB (1 и 2) и пробирок 5 и 6, добавляется 200 мкм разбавленной антисыворотки овечьего ГР.

9. Пробирки встряхивают, закрывают и инкубируют в течение 20 ч, при 40^oС.

День 2.

9. Во все пробирки добавляют 100 мкл меченного радиактивным йодом овечьего ГР (приблизительно 10000 отсчетов в мин/100 мкл). Пробирки встряхивают и инкубируют в течение 20 ч при 4^oС.

День 3.

10. Разбавляется козиный антикроличий гамма-глобулин в отношении 1:10 или так, как указано на сосуде с РBSА.

Во все пробирки (за исключением пробирок 5 и 6) добавляют 200 мкл козлиного антикроличьегo гамма-глобулина.

Пробирки встряхивают и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.

11. Во все пробирки (за исключением 5 и 6 ) добавляют 1 мл 6% PEG в РSВ. Пробирки встряхивают и центрифугируют при 1500-1600 г в течение 25 мин.

12. Отбирается преципитат для просчета радиактивного материала на гамма-сцинтиляционном счетчике (использовалась модель LКB 1275).

Имеющий степень иодинирования овечий ГР был получен из Национального центра по исследованию гипофиза и был использован для иодинирования (хлорамин-Т-метод). Антиовечья ГР сыворотка также была получена из Центра гипофиза. Результаты исследований представлены в таблицах 6 и 7.

В Таблицах 6 и 7 соединение (N 8114) Группы 2 показало синергическое действие совместно с соединением (N 8801) Группы 3. Каждый анализ дает среднее значение для двух исследуемых животных. Во всех случаях, когда эффективная доза этих соединений вводилась животным в сочетании друг с другом, количество высвобождаемого гормона роста было значительно выше, чем когда эти соединения вводились отдельно.

Пример 4.

In vivo исследование секреции гормона роста у коз
Молочные самки коз (46 60 кг) помещались в отдельные клетки с постоянной комнатной температурой 24^oС и циклом день-ночь: 12 ч 12 ч. Козы получали пищу, содержащую 16 неочищенных белков, 3,25 сырого жира и 8 сырого волокна и люцернового сена.

Смесь из 5,87 мкг/кг веса тела соединения N 8801 и идентичного количества соединения N 8114 растворялась в 10 мм уксусной кислоты и добавлялась в фосфатно-солевой буферный раствор (5 мл). Козы были катеризованы через яремную вену. Внутривенное вливание 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора осуществлялось при помощи многоканального насоса (модель 600-900, Harvard Apparatus Co. Jns. Dover, Mass) с заранее установленной скоростью вливания 1,36 мл/мин. Уровни ГР в крови определялись методом, описанным в предыдущем примере. Результаты представлены в таблице 8.

Повышение уровней гормона роста в сыворотке, замеренных в период от +5 до +40 мин, по сравнению с уровнями ГР, замеренными в период от -10 до 0 (контрольные значения), наглядно свидетельствует о прекрасном ГР-высвобождающем эффекте, вызываемом введением комбинации соединений (N 8114 и N 8801) молочным детенышам жвачных животных.

Пример 5
Исследование секреции гормона роста In vivo Приматы
Синергическую секрецию гормона роста, вызванную соединениями Группы 1, Группы 2 и Группы 3, исследуют у человекообразных приматов мужского и женского пола. Вес тела макак резус женского пола составляет 5,5 ± 0,2 кг и мужского пола 7,8 ± 0,5 кг. Возраст самок составляет 8,0 ± 1,2 года и самцов 8,7 ± 0,9 года. Приматы содержатся на диете Purina Hi Pro Monkey Chow.

После ночной голодной выдержки животных анестезируют между 9:00 и 11:30 ч с использованием для этого кетаминхлоргидрата с дозировкой 10 мг/кг веса тела. В равных дозировках 15, 40, 120 или 360 мг каждое соединение N 144-NH₂ (Группа 1), n 8938 (Группа 2) и N 8801 (Группа 3) вводят группам, содержащим 6-18 взрослых самцов и 6-21 самок макак резус.

Кровь извлекают во время О и испытуемые пептиды вводят внутривенно через стерильную дроссельную заслонку, вставленную в подкожную вену ноги. Испытуемые пептиды растворяют в 0,1%-ном стерильном желатиновом физиологическом растворе и инъецируют в объеме 0,5 мл. Затем кровь собирают через 10 и 20 мин после инъецирования через ту же самую вену. Всех животных обследуют в течение одного часа после инъекции.

Сыворотке позволяют свернуться и замораживают до начала анализа на гормон роста. Пробы исследуют на гормон роста с использованием комплекта IСN (иммуно Нуклеар) человеческого гормона роста (чГР), полученного из Иммуно Нуклеар Корпорейшн, Стиллуота, Миннесота. Результаты считывают против стандарта комплекта чГР (1,0-30 кг/мл) и соответствующие разбавления осуществляют при необходимости с использованием буферного раствора для анализа.

Результаты представлены в Таблицах 9 и 10.

В Таблицах 9 и 10 показано, что различные бинарные и тройные комбинации соединения из Группы 1 (N 144 NH₂), Группы 2 (N 8938) и Группы 3 (N 8801) действуют синергически с высвобождением гормона роста как у самок, так и самцов макак резус. Общее количество животных в каждой испытуемой группе указано в отдельной таблице.

Пример 6. Исследование секреции гормона роста In vivo Крысы
Вновь испытывают синергическое действие аналогичной комбинации соединений Группы 1, Группы 2 и Группы 2, как и в Примере 5, для того, чтобы вызвать секрецию гормона роста, на этот раз у крыс. Экспериментальный протокол, изложенный в Примере 1, используют для этих испытаний. Результаты представлены в таблицах 11 и 12.

В таблицах 11 и 12 показаны различные бинарные и тройные комбинации соединения из Группы 1 (N 144 NH₂) Группы 2 (N 8938) и Группы В (N 8801), которые действуют синергически с высвобождением гормона роста как у самок, так и самцов крыс. Каждый показанный анализ представляет собой средний результат исследований, проводимых на шести крысах.

Данные, приведенные в таблицах 9-12, ясно показывают, что синергический эффект комбинации соединения Группы 1 (N 144 NH₂), соединения Группы 2 (N 8968) и соединения Группы 3 (N 8801) не зависит от исследуемого отдельного вида и от пола исследуемого животного. Напротив, синергическая реакция относительно комбинаций в соответствии с настоящим изобретением, как видно, широко применима в отношении вида и пола.

Различные сочетания дозировок любых двух или всех трех вышеупомянутых пептидов (то есть N 144 -NH₂, N 8988 и N 8801) показывают сильную синергическую реакцию как у человекообразных обезьян (и самок, и самцов), так и у крыс (и самок, и самцов).

Пример 7
Исследование секреции гормона роста In vivo Коровы
Четырех нелактационных коров породы Holstein (средний вес тела 542 кг) содержат на пастбище и помещают в большую лабораторию для животных для экспериментальных исследований в традиционной жесткой привязи. Диета для коров представляет собой сено, траву и 1 х/день 5 фунтов (2,268 кг) Omolene (пшеница, овес, кукуруза, соя, меласса с витаминами и микроэлементами ) - Purina. Коров содержат в большой лаборатории для животных и выдерживают без травы в течение 1-1,5 ч перед началом экспериментов. Катетеры вставляют в яремную вену для вытягивания проб крови и для осуществления внутривенных вливаний пептидов. 15-20 мл физиологического раствора вливают через катетер после каждого извлечения крови, и медленное капельное внутривенное вливание физиологического раствора используют для предотвращения свертывания крови в катетере. 10 мл проб крови собирают между 9 часами утра и 2 часами дня при -40, -30, -10, 0, +5, +10, +15, +20, +25, +30, +40, +60, +90, +120, +150, +180. Нормальный физиологический раствор с 0,1% желатиной или пептидами, растворенными в 0,1% -ном желатиновом физиологическом растворе, инъецируют внутривенно через катетер во время 0 коровам, не подвергшимся наркозу. Физиологический раствор/пептид вливают в течение 3 минут в 5,0 объеме. Крови позволяют загустеть, центрифугируют и сыворотку отделяют от сгустка. Сыворотку сохраняют в замороженном состоянии до дня отбора на радиоиммуноанализ /РИА/ гормона роста. Сывороточный гормон роста измеряют путем РИА с использованием реагентов, поставляемых NIADDK. Уровни гормона роста приведены на языке нг/мл эталонного препарата из бычьего гормона роста, NIH-GH-B18, который эквивалентен 3,2 международных единиц/мг. Данные записывают как среднее + стандартное отклонение среднего /РЭМ/. Статистический анализ осуществляют с применением т-критерия Стьюдента.

Исследования осуществляют на 4 коровах (средний вес тела 543 кг).

Расчет D среднего значения
1) Среднее исходное данное гормона роста (4 пробы перед вливанием физиологического раствора или пептида) минус уровень гормона роста за каждый временной интервал после вливания физиологического раствора или пептида значения Δ¹ гормона роста.

2) Все значения Δ¹ гормона роста каждой группы животных (12 проб) усредняют Δ² средний ГР кг/мл сыворотки ± РЭМ.

Среднее из 6 ± РЭМ; значение p в сопоставлении с соответствующим контрольным.

Данные, представленные в таблице 13, показывают синергическую реакцию у нелактационной молочной коровы для комбинаций соединений Группы 1 плюс Группы 2; соединений Группы 2 плюс Группы 3; а также соединений Группы 1 плюс Группы 2 плюс Группы 3.

Изобретение описано подробно со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, однако следует понять, что варианты и модификации могут быть выполнены в пределах объема и сущности настоящего изобретения. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6 ТТТ7 ТТТ8 ТТТ9 ТТТ10 ТТТ11 ТТТ12 ТТТ13 ТТТ14 ТТТ15 ТТТ16 ТТТ17 ТТТ18 ТТТ19 ТТТ20 ТТТ21 ТТТ22 ТТТ23 ТТТ24 ТТТ25 ТТТ26

Использование: ветеринария. Сущность изобретения: способ основан на введении полипептидов, которые выбирают из двух различных групп полипептидов. Способствует стимуляции секреции и повышению уровня гормона роста. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 14 табл.

1. Композиция стимуляции секреции и повышения уровня гормона роста в крови животного, содержащая эффективное количество полипептидов, выбранных no крайней мере из двух различных групп, в свою очередь, выбираемых из группы 1, группы 2 или группы 3, отличающаяся тем, что полипептиды группы 1 выбирают из группы, состоящей из группы соединений, соответственно представленной в описании, a также тем, что соединения группы 2 выбирают из группы, соответственно представленной в описании, a также тем, что соединения группы 3 выбирают из группы, соответственно представленной в описании, при этом соединение группы 1 используют в количестве 1-100 мкг, соединение группы 2 используют в количестве 1-100 мкг и соединение группы 3 в количестве 30-100 мкг. 2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что соединение группы 2 используют в комбинации с композицией группы 3. 3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композицию 8114 группы 2 используют в комбинации с соединением группы 3. 4. Композиция по п. 1, где соединение группы 1 используют в комбинации по крайней мере с одной из следующих, в частности с соединением 8114 группы 2 или соединениями 8801, 9218 группы 3, отличающаяся тем, что соединения группы 1 используют в следующих количествах: 8686 1-10 мкг, 10363 3-30 мкг, 10286 10-100 мкг и 11120 3 мкг, соединение группы 2 используют в количестве 3-10 мкг, соединения группы 3 в следующих количествах: 8801 30-100 мкг, 9218
3-30 мкг. 5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что соединение 144-NH₂ используют в соединении 8938 группы 2 в равных количествах. 6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композицию 8686 группы 1 используют по крайней мере с одной из следующих, в частности с композицией 8114 группы 2 или композицией 8801 группы 3 в равных количествах. 7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что соединение 144-NH₂ группы 1 используют по крайней мере с одним из следующих, в частности с соединениями 8938 группы 2 или соединением 8801 группы 3 в равных количествах, взятых в диапазоне 1 120 мкг. 8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композицию 8686 группы 1 используют с одной из следующих, в частности с композицией 8114 группы 2 или композицией 9218 группы 3 в равных количествах. 9. Способ стимуляции секреции и повышения уровня гормона роста в крови животного, включающий введение полипептидов, отличающийся тем, что полипептиды выбирают из по крайней мере двух различных групп полипептидов группы 1, группы 2 и группы 3, причем полипептиды группы 1 выбирают из любого полипептида: а) имеющего следующие аминокислотные последовательности в положениях 1-44 (считая от N-конца до С-конца), представленные в описании, и их функциональных элементов, где С концевая аминокислота имеет следующую усеченную общую формулу

где каждый R₁ самостоятельно обозначает заместители определенного аминокислотного остатка, а его выбирают из заместителей водорода, алкила, арила, амино или кислоты, X С-концевая группа, и его выбирают из -СОNH₂, -СООН, -СOOR, -СОNRR, CH₂OH и -CH₂OR, где R - С₁-C₆-алкильная группа, или ароматическое кольцо, имеющее до 12 атомов углерода, и где сокращения аминокислотных остатков используются в соответствии со стандартной пептидной терминологией:
G Gly (Глицин)
Y Тy (1-Тирозин)
I Ile (1-Изолейцин)
E Glu (1-Глутаминовая кислота)
Т Тhr (1-Треонин)
F Рhe (1-Фенилаланин)
A Ala (1-Аланин)
К Lys (1-Лизин)
D Asp (1-Аспарагиновая кислота)
C Cys (1-Цистеин)
R Arg (1-Аргинин)
Q Gln (1-Глутамин)
P Pro (1-Пролин)
I Ile (1-Лейцин)
M Met (1-Метионин)
S Ser (1-Серин)
N Asn (1-Аспарагин)
H His (1-Гистидин)
W Trp (1-Триптофан)
V Val (1-Валин)
о) любого из указанных а) полипептидов, имеющих следующие аминокислотные замещения: положение 1 (N 144 N 148) представляет собой DTyr или His, положение 1 (<186<149) представляет собой Tyr или DHis, положение 2 (N 144 N 149) представляет собой (NMe) DAlа или Aib или DAla, положение 3 (N 144 N 149) представляет собой DAsp, положение 4 (N 144 N 149) представляет собой DAla, положение 1 2 (N 144 N 149) представляет собой DTyr¹ DAla², DTyr¹ - (NMe) DAla² или DTyr¹ Aib²;
с) любого из указанных а) и b) полипептидов, имеющих замещение Met на Nbe в положении 27;
о) любого из указанных а), b) или с) полипептидов, где N концевая - NH₂ замещена NHCOR, где R С₁ C₆-алкильная группа, или ароматическое кольцо, имеющее до 12 атомов углерода;
е) фрагментов любого из указанных а), b), с) или d) полипептидов, которые содержат по крайней мере аминокислотные остатки в положениях 1-29, имеющего следующие специфические аминокислотные последовательности в положениях 1-29, считая с N-конца до С-конца, представленные в описании, где С концевая аминокислота и Х имеют указанные значения, и модификацию любого из этих соединений группы (f) в соответствии с модификациями, приведенными в (b), (с) и (d) выше,
g) органических или неорганических аддитивных солей любого из указанных (а), (b), (с), (d), (е) или (f) полипептидов группы 1,
полипептиды группы 2 выбирают из любых полипептидов, имеющих структуру, представленную в описании,
и органических или неорганических аддитивных солей любого из указанных полипептидов группы 2, и полипептиды группы 3 выбирают из любого полипептида, имеющего структуру, представленную в описании, и органических и неорганических аддитивных солей любого из указанных полипептидов группы 3.

Приоритет по пунктам:
10.04.87 по пп. 1 9.