ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕПТИДОВ - АНАЛОГИ GRF ИЛИ ИХ НЕТОКСИЧНЫЕ СОЛИ Российский патент 1997 года по МПК C07K14/60 A61K38/25 

Настоящее изобретение относится к пептидам, влияющим на функционирование гипофиза человекообразных и животных, в частности млекопитающих. Более конкретно, настоящее изобретение направлено на пептиды, промотирующие выделение гормона роста гипофизом. Пептиды настоящего изобретения активны in vivo, более стабильны в плазме, а отдельные пептиды более стабильны в водной среде при нейтральных значениях pH по сравнению с природными GRF последовательностями.

Физиологам давно известно, что гипоталамус регулирует секреторные функции аденогипофиза путем продуцирования гипоталамусом специфичных веществ, стимулирующих или ингибирующих секретирование каждого гормона гипофиза. В 1982 году из экстрактов опухоли поджелудочной железы человека выделены, очищены и охарактеризованы человеческие панкреатические (опухолевая) факторы выделения (hpGRF), которые были затем синтезированы, испытаны и при этом была обнаружена промотирующая способность по выделению гормона роста (GH) гипофизом [Guillemin R. et al. Science 218, 585-585 (1982)] С этого времени также были охарактеризованы и синтезированы соответствующие гипоталамические факторы выделения GH других видов, в том числе крыс, свиней, овец, коров и коз, а также человекообразных.

Было найдено, что человеческий гипоталамический GRF (hGRF) отвечает той же формуле, что и hpGFR, а именно: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂.

Найдено, что крысиный GRF (rGRF) имеет в положении 8 остаток Ser и отвечает формуле: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Glu-Gln-Gly-Gln-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH. (см. например, патент США 4595676).

Бычий GRF (bGRF) как было найдено, отвечает формуле: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH₂.

Свиной GRF, как было найдено, имеет в положении 28 остаток Ser. Сообщалось, что природные последовательности GRF подвергаются быстрой дезактивации ферментами плазмы крови. Быстрый распад включает расщепление 2-3 связи пептида под действием дипептидилпептидазы типа IV (DPP-IV), которая в прошлом также называлась дипептидиламинопептидазой-IV [Frohman L.A. et al. J. Clin. Invest. 78, 906-913 (1986)]
В связи с метаболической стабильностью GRF предложены различные способы защиты пептидов GRF от расщепления дипептидилпептидазой. К ним относится работа Felix et al. "Синтез и биологическая активность новых линейных и циклических аналогов GRF" в издании "Пептиды. Химия и биология, труды 10-го Ам. Симпозиума по пептидам. Под ред. G.R.Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Лейден, Голландия, с.465-467 (1988), в которой сообщается об аналогах GRF замещенных desNH₂-Tyr в положении 1 и/или D-Ala в положении 2, в результате чего повышается стабильность N-конца к ферментному распаду. Эта информация позднее была подтверждена Frohman et al. "Дипептидилпептидаза-IV и трипсиноподобное ферментативное разрушение человеческого фактора выделения гормона роста в плазме" J. Clin. Unvest. 83, 1533-1540 (1989). Кроме того, последняя группа исследователей показала, что N-ацетилирование и N-метилирование N-концевого тирозинового остатка или замещение D-Tyr-1 в GRF полностью ингибирует расщепление в 2-3 положении. С другой стороны, альфа-метилирование Tyr-1 только частично блокирует разрушение под действием DPP-IV.

Murphy W.A и Coy D.H. в работе "Активные долгодействующие алкилированные аналоги фактора выделения гормона роста", Peptide Research 1, 36-41 (1988) описывают аналоги GRF, показавшие повышенную устойчивость к ферментивному разрушению в результате N-алкилирования или N-аралкилирования N-концевой аминокислоты одновременно или без сопутствующего N-алкилирования боковых групп лизина в пределах пептидной цепи.

Природные последовательности GRF имеют в 15 положении остаток Gly. Известно, что аналоги с Ala или Leu в 15 положении обладают повышенной способностью по выделению GH. См. например, патенты США 4649131 и 4734399, а также Ling N. et al. Quo Vadis, Симпозиум, Sanofi Group, май 29-30 1985 г. Тулуз-Лабеж, Франция (с. 309-322). Замещение Gly-15 на Val или альфа-аминоизомасляную кислоту также приводит к повышению активности аналогов GRF [Felix et al. "Синтез и биологическая активность новых аналогов фактора выделения гормона роста", в издании "Пептиды 1986", Walter de Gruyter Co. Берлин-Нью-Йорк, с.481-484 (1987)]
A. M. Felix представил методику синтеза аналогов с повышенной и/или длительной биологической активностью, в том числе получение и испытание Ala¹⁵ h-GRF(1-29)NH₂ и desNH₂-Tyr¹, D-Ala², Ala¹⁵ hGRF(1-29)NH₂. См. например, патенты США 4649131 и 4734399, а также A.M.Felix. E.P.Heimer. T.F.Mowles, H. Bisenbeis, P.Leung, T.J.Lambros, M.Ahmad, C.-T.Wang и Paul Brazeau: "Синтез и биологическая активность новых аналогов фактора выделения гормона роста": в издании "Пептиды 1986", с. 481-484 (1987); Felix A.M. Wang C.T. Heimer E. Fournier A. Bolin D. Ahmad M. Lambros T. Mowles T. И Miller L. "Синтез и биологическая активность новых линейных и циклических аналогов GRF", в издании "Пептиды. Химия и биология", Труды 10-го симпозиума по пептидам в Америке, под ред. G. R.Marshall, Escom Science Publishers, Лейден, Голландия (1988), с.465-467; D.Peticlers, H.Lapierre, G.Pelletier, P.Dubreuil, P.Gaudreau, T. Mowles, F.Felix и P.Brazeau: "Действие активного аналога фактора выделения гормона роста человека hGRF на гормон роста GH и выделение молока молочных коров". Реферат доклада P223, 82-ая встреча американских ученых-специалистов в области молочного производства, Колумбия, шт.МО, июнь 21-24 (1987).

Аналог GRF модифицированный Ser², помимо восьми других модификаций в той же молекуле, описан в работе Tou et al. "Амфифилические аналоги фактора выделения гормона роста (GRF). Строение пептида и биологическая активность in vivo" Biochem. Biophys. Res. Commun. 139, 763-770 (1986). Этот аналог, как сообщается, составляет 165% от активности in vivo на овцах по сравнению с bGRF(1-44)NH₂.

В патенте США 4734399 раскрываются аналоги GRF, имеющие Ala, N-метил-D-Ala или D-Ala в положении 2 и Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Nval, β-Ala или a-Ala в положении 15. См. также патент США 4649131.

В заявке на Европейский патент на имя Coy и Murphy, публикация N 0188214, N заявки 86100127.9 раскрыты аналоги GRF с Leu или Phe в положении 2 и, кроме того, пептида GRF с различными аминокислотами L- или D-конфигурации искусственного происхождения в качестве заместителей в положении 2.

Аналоги GRF с очень низкой биоактивностью, имеющей Sar² или Pro² описаны в работе Coy et al. "Стратегия в создании искусственных агонистов и антагонистов фактора выделения гормона роста", Peptides, т.7, Suppl. 49-52 (1986).

Ling et al. в работе "Аналоги фактора выделения гормона роста с высокой антагонистической активностью", в издании "Пептиды. Химия и биология", Труды 10-го симпозиума по пептидам в Америке, ред. G.R.Marshall, Escom Science Publishers, Лейден, Голландия (1988), с.484-486, сообщают о ряде аналогов GRF, замещенных либо Arg, либо различными D-аминокислотами в положении 2. Все аналоги менее активны по сравнению с исходным гормоном, а некоторые из них проявляют антагонистическую активность.

Данному изобретению предшествовало изобретение, описывающее синтетические полипептиды GRF, имеющие остатки Ser вместо аминокислотных остатков, обычно имеющихся в положении 8 и 28 полипептида, как ингибиторов химического разрушения (дезаминирования) в водных средах. См. заявку на патент США серийный N 07/303,518, подана 27 января 1989 года и серийный номер 07/323,955, подана 15 марта 1989 года.

Описываются также синтетические GRF-полипептиды с остатками цистеиновой кислоты (Cya), замещающими аминокислотные остатки в положении R₅ и/или R₂₅. См. заявку на патент США серийный N 07/150,301, подана 29 января 1988 года и серийный N 89/00245, подана 27 января 1989 года.

Создан аналог hGRF из 29 аминокислот /(см. G.Velicelebi et al. Proc. Natl. Aca. Sci. USA, том 83, 5397-5399 (1986)/, в котором последовательность первых шести аминокислот с аминоокончаниями совпадает, а отличия от природного пептида заключаются в 13 аминокислотах в остальной последовательности, включая введение остатка Ser в положение 8. Амидная и свободнокислотные формы аналога отвечают следующей формуле: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-NH₂/OH. При испытании на способность стимулировать секрецию гормона роста (GH) в первичной культуре передних клеток гипофиза крыс амидный аналог оказался в 1,57 раза активнее hGRF (1-40)OH, в то время, как свободнокислотная форма в том же испытании, как сообщается, показывает только 1/6-ю активности.

Vale et al (заявка на патент США серийный N 053,233, подана 22 мая 1987 года) описывают аналоги hGRF с измененным 31-м остатком. Указанный остаток в 31 положении имеет в боковой цепи функциональную группу, которая может быть конъюгирована с отдельным белком. В аналогах hGRF по 31-му остатку могут также быть замещены и другие остатки, находящиеся в последовательности природного GRF, например, на Ala или Ser в 8 положении, Phe в 10 положении или Ala в 15 положении. В 28 положении могут присутствовать Asn или Ser.

Как сообщается, остаток Asn в полипептиде при определенных условиях подвергается в присутствии воды деамидированию. Однако, закономерность, обуславливающая деамидирование, неясна. К примеру, в таком полипептиде, как трипсин, только некоторые остатки Asn, находящиеся в частичной последовательности Asn-Ser, подвергаются деамидированию, в то время как другие не подвергаются. См. Kossiakoff A.A. Science 240, 191-194 (1988).

В заявке на Европейский патент N 86308337.4, имеющий N публикации 020958 раскрывается класс соединений, отвечающих формуле: H-X-Pro-пептид, в которой X представляет остаток пригодной аминокислоты. Pro относится к природной аминокислоте-пролину и пептид представляет последовательность аминокислотных остатков, соответствующую последовательности биологически активного пептида или белка. В качестве примера соединения формулы: H-X-Pro-пептид можно назвать Met-Pro-(фактор выделения гормона роста), который может быть химическим путем превращен в GRF.

N-терминальные аналоги, не являющиеся GRF-пептидами, получены для различных целей, в том числе, например:
M. A.Tallon et al. Biochem. 26: 7767-7774 (1987), синтезировали N-терминальных аналогов фактора альфа-скрещивания дрожжей, где N-терминальные остатки были представлены Ala, Glu-Ala, Ala-Glu-Ala или Glu-Ala-Glu-Ala. Указанные пептиды использованы для изучения зависимости между строением и активностью.

В работе D. Andreu et al. 20-ый Евр. Симпозиум по пептидам, Тюбинген, ФРГ, сентябрь 4-9, 1988 г. рефераты симпозиума с.33, сообщается о синтезе полной последовательности из 64 аминокислот предшественника цекропина A, наряду с образующимися в ходе обработки несколькими более короткими пептидами, потенциано являющимися промежуточными соединениями. Среди прочих синтезирована полная последовательность цекропина, с N-терминальным остатком Ala-Pro-Gly-Pro и использованная для того, чтобы показать, что N-терминальная часть и в самом деле расщепляется частично очищенным дипептидилпептидаза-подобным ферментным препаратом, полученным из куколок павлиноглазок Cecropia. См. также H.Boman et al. J. Biol. Chem. 264: 5852-5860 (1989).

G. Kreil et al. Eur. J. Biochem. 111:49-58 (1980) сообщают, что мелиттин основной компонент яда медоносной пчелы, происходит из промелиттина. Предпоследовательность промелиттина состоит из шести X-Pro и пяти X-Ala повторяющихся дипептидильных остатков. Представленные Kreil et al. результаты предполагают, что превращение продукта-предшественника может протекать путем ступенчатого отщепления дипептидных звеньев под действием фермента типа дипептидилпептидазы IV, присутствующего в экстрактах из выделяющих яд желез.

C.Mollay et al. Eur. J. Biochem. 160: 31-35 (1986). Каэрулайн и ксенопсин это два пептида, обнаруживаемые в кожном секрете Xenopus Laevis. Первому отвечает N-терминальная последовательность Phe-Ala-Asp-Gle, а второму Ser-Ala-Glu-Ala в соответствующих предшествующих формах. Дипептидилпептидаза типа IV, выделенная из секрета кожи лягушек, обладает специфичностью, необходимой для отщепления указанных N-терминальных концов с образованием в результате зрелых соединений.

D. Julius et al. Cell, 32: 839-852 (1983). Феромоновый альфа-фактор скрещивания является пептидом из 13 аминокислот, секретируемым альфа-клетками Saccharomyces cervisiae. Альфа-клеточные мутанты от нормального скрещивания, у которых отсутствует связанная с мембраной дипептидилпептидаза, не образуют нормального альфа-фактора, но выделяют смесь неполностью обработанных форм, отвечающих формулам: Glu-Ala-Glu-Ala-альфа-фактор или Asp-Ala-Glu-альфа-фактор и характеризующихся заметно сниженной биологической активностью. Показано, что для нормальной обработки предшественника альфа-фактора необходима связанная с мембраной дипептидилпептидаза, и данный процесс может ограничивать скорость вызревания альфа-фактора в нормальных альфа-клетках дрожжей.

C.L.Choy et al. Eur. J. Boichem. 160: 267-272 (1986). Предшественник белка со свойствами антифриза из Ньюфаундлендской зимней кабалы в N-концевой части содержит четыре X-Prо и семь X-Ala повторяющихся последовательностей. Хотя ход обработки этого предшественника и не исследовался, предполагается, что превращение могло бы происходить в сыворотке под действием дипептидилпептидаза-подобного фермента, который мог бы последовательно отщеплять дипептидильные звенья в удлиненной части с выделением зрелого белка-антифриза.

После даты приоритета первой заявки Suhr et al. сообщили о выделении и характеристике к ДНК клона полной длины, кодирующего GRF мышей. Предсказано, что зрелый GRF мышей является пептидом из 42 аминокислотных остатков со свободным карбоксильным концом. Указанный пептид имеет в положении 2 остаток валина, что делает его уникальным среди GRF других видов, каждый из которых имеет в положении 2 Ala. См. Mol. Endocrinology 3: 1693-1700, 1989.

Настоящим изобретением предлагаются нетоксичные высокоактивные синтетические полипептиды, которые промотируют высвобождение гормона роста гипофизом (GRF пептид).

Эти пептиды, в отличие от известных ранее GRF пептидов, содержат остатки Thr, Val или Ile вместо обычных аминокислотных остатков в положении 2 в сочетании с одной из следующих аминокислот: Ala, Val, Leu, Ile или Gly в положении 15. Они также (не обязательно) могут содержать остаток Ser в положениях 8 и 28, и N-концевые заместители, которыми могут быть встречающиеся в природе аминокислоты (Tyr или Asp; Thr, Ser, Ala), а также C₁-C₈-алкил.

Помимо целевой высокой активности, эти пептиды имеют еще дополнительное преимущество по сравнению с природными GRF аналогами они более устойчивы в плазме крови, а, если еще имеют в цепи Ser⁸ и Ser²⁸, то надежно защищены от деамидирования в водных средах и вообще, химически более стабильны.

Предлагаемые данным изобретением производные пептидов-аналогов GRF соответствуют общей формуле I:
R-R₁-R₂-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-R₁₅-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A-B-C-Y-X-Z
R H; H[Tyr-Thr]_n, n1,2; H[Tyr-Ser]
R₁ Tyr, His;
R₂ Thr, Val, Ile;
R₈ Ser, Asn;
R₁₅ Ala, Gly, Val, Leu, Ile;
A связь или группа; Lys-Leu-Leu-Glu-Asp
B связь или группа; Ile-Leu
C связь или группа; -Ser-Arg-;
группа: -Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Ser-Arg-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly
Y связь или Asn;
или -[Gln-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-]
X Hse, Arg;
Z NH₂, NHAlk(C₁-C₈);
или их нетоксичные соли.

Предпочтительны соединения, в которых аминокислота в положении 15 представлена Ala; в частности, это относится к пептиду, который отвечает формуле:
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-HseNH₂.

Как правило, преимущественным является биологически активный фрагмент, проходящий от R_y N-конца к остатку в любом из положений 27-44 у его C-конца, и где R₁₅ Ala, Val, Leu, Ile.

В частности, это относится к пептиду, где R₁₅ Ala, а R₁ H или Tyr, или, где R₁ Tyr, а R₈ и R₂₈ Ser.

В частности, можно назвать пептид, который отвечает формуле:
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Hse-NH₂
или его нетоксичную соль;
либо пептид, где R₂ Thr, в частности, отвечающий формуле:
H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Sеr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Glu-Gly-Hse-NH₂; H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Hse- NHC₂H₅; H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Hse- NH₂
или его нетоксичной соли;
либо пептид, где R₂ Ile, в частности отвечающий формуле:
H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Cln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Hse-NH₂
или его нетоксичной соли.

Преимущественными можно назвать также пептиды, выбранные из группы, включающей:
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(1-30)NH₂, Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(1-30)NH-C₂H₅, Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(1-30)NH₂, Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(1-30)NH-C₂H₅, Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(1-33)NH₂, Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(1-33)NH-C₂H₅, Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(1-33)NH₂, Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(1-33)NH-C₂H₅, Thr₂ Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF (1-30)NH₂, Thr² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(1-30)NH-C₂H₅, Thr² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(1-33)NH₂, Thr² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(1-33)NH-C₂H₅, Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(1-28)NH₂, Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(1-28)NH-C₂H₅, Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(1-28)NH₂, Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(1-28)NH-C₂H₅,
или его нетоксичной соли;
либо пептиды выбранные из группы, включающей:
Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, Val² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, Ile² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, N-a-(Tyr-Thr)-Tyr¹-Thr², Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, N-a-(Tyr-Thr)₂-Tyr¹-Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, N-a-(Tyr-Thr)-Tyr¹ Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, N-a-(Tyr-Thr)-Tyr¹-Ile² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, N-a-(Tyr-Ser)-Tyr¹-Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂), Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse⁴⁵ bGRF(1-45)NH₂, Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Hse²⁷ bGRF(1-27)NH₂, Thr² Val¹⁵ bGRF(1-29)NH², Thr² Leu¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, Thr² Ile¹⁵ bGRF(1-29)NH₂, Thr² Ser⁸ Val¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸-Hse³⁰ bGRF(1-30)NH₂, Thr² Ser⁸ Ala¹⁵ Ile²⁷ Ser²⁸ bGRF(1-29)NH₂, Thr² Ser⁸ Leu¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸-Hse³⁰ bGRF(1-30)OH, Thr² Ser⁸ Ile¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(1-40)OH, N-a-(Tyr-Thr)₂-Tyr¹-Thr² Bal¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, N-a-(Tyr-Ser)-Tyr¹-Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse³⁰ bGRF(1-30)NH₂, N-a-(Tyr-Thr)₂-Tyr¹-Thr² Ile¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, N-a-(Tyr-Thr)-Tyr¹-Thr² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(1-29)NH₂
или его нетоксичной соли.

Термин "GRF полипептид" в описании и формуле изобретения означает известный полипептид длиной в 20-44 аминокислотных остатка, предпочтительно в 27-44 остатка, промотирующий выделение гормона роста гипофизом. Иллюстрирующие примеры GRF пептидов включают природные или синтетические полипетиды, раскрытые в патентах США 4517181, 4518586, 4528190, 4529595, 4563352, 4585756, 4595676, 4605643, 4610976, 4626523, 4628043, 4689318 и заявке на патент США, имеющей серийный N 89/00245, подана 27 января 1989 года, которые указаны в качестве ссылок. В работах Felix A. Wang C.T. Heimer E. Fournier A. Bolin D. Ahmed M. Lambros T. Mowles T. Miller L. "Синтез и биологическая активность новых линейных и циклических аналогов GRF", в издании "Пептиды. Химия и биология". Труды 10-го Ам. Симпозиума по петидам, ред. G.R.Marshall. Escom Science Publishers, Лейден, Голландия, с.465-467 (1988); Tou J.S. Kaempde L. A. Veneyard B. D. Buonomo F.C. Della-Fera M.A. и Baile C.A. "Амфифилические аналоги фактора выделения гормона роста. Строение пептидов и биологическая активность in vivo. Boichem. Biophes. Res. Commun. 139, N 2, с. 763-770 (1986); Coy D.H. Murphy W.A. Sueires-Diaz J. Coy E.J. Lance V.A. "Исследование зависимости от строения N-терминального остатка фактора гормона роста", J.Med. Chem. 28, с.181-185 (1985); Felix A.M. Heimer E.P. Mowles T. F. Eisenbeis H. Leung P. Lambros T.J. Ahmed M. и Wang C.T. "Синтез и биологическая активность новых аналогов фактора выделения гормона роста", в издании "Пептиды 1986", Walter de Gruyter Co. Берлин-Нью-Йорк, с.481-484 (1987); Velicelebi G. Patthi S. Kaiser E.T. "Строение и биологическая активность аналогов фактора выделения гормона роста с потенциально амфифилическими геликондальными карбоксильными окончаниями", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, с.5397-5399 (1986); Ling N. Baird A. Wehrenberg W.B. Munegumi T. И Ueno N. "Синтез аналогов GRF в качестве конкурентных антагонистов GRF лечебных средств, получаемых биотехнологией". Quo Vadis Symposium, Sanofi Group, май 29-30, 1985 г. Тулуз-Лябеж, Франция, с.309-329; Murphy W.A. И Coy D.H. "Активные долгодействующие алкилированные аналоги фактора гормона роста", Peptide Research 1,36-41 (1988); J.C.Tou, L.A.Kaempfe, B.D.Veneyard, F.C.Buonomo, M.A.Della-Fera и C.A.Baile "Амфифилические аналоги фактора выделения гормона роста GRF: строение пептидов и биологическая активность in vivo", Biochem. Biophys. Res. Commun. 139, 763-770 (1986). Термин "GRF пептид" включает и нетоксичные соли пептида.

Используемая для определения пептида номенклатура, та, что предложена Schroder и Lubke в издании "Пептиды", Academic Press (1965), согласно которой аминогруппа у N-конца обычно показана слева, в карбоксильная группа у C-конца справа. Если аминокислотный остаток имеет изомерные формы, в этом случае обычно бывает представлена L-форма аминокислоты, помимо указанных особых случаев.

Данные, доказывающие метаболическую активность соединений настоящего изобретения (по сравнению с природным GRF), приведены в табл.1 в виде данных по стабильности in vitro. Примечательно, что в бычьей плазме in vitro аналоги, имеющие Thr² Val² Ile² или Leu², не расщеплялись в положении 2-3 DPP-IV плазмы в экспериментальных условиях, используемых в исследованиях (инкубирование плазмы в течение часа). Однако, при более длительном инкубировании плазмы Thr², Ala¹⁵, Ile²⁷ bGRF(1-29)NH₂ претерпевает небольшое расщепление под действием DPP-IV.

Кроме того, данными табл.1 показана повышенная активность in vivo соединений настоящего изобретения. К примеру, для специалиста из сравнительных данных по активности in vivo (в дозировке 0,01 нмоля/кг) очевидно, что трифторацетатная соль Ile² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂ по своей активности будет в 10-20 раз превышать активность его изомерной трифторацетатной соли Leu² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂ при определении и сравнении значений ЭД₅₀ для каждого соединения.

Для промышленного производства рекомендуется, чтобы концевой карбоксильный остаток являлся остатком гомосерина или был представлен в виде лактона гомосерина, амида гомосерина или C₁-C₈ алкилового эфира (предпочтительно C₁-C₄ алкилового эфира), вторичного или третичного амида гомосерина.

Синтетические аналоги GRF-пептида синтезируют известными приемлемыми способами, в том числе, например, способами, раскрытыми в патенте США 4529595 (столбец 2, строка 35 по столбец 5, строка 64) и патенте США 4689318 (столбец 2, строка 23 по столбец 9, строка 13), каждый из которых приводится здесь в качестве ссылки.

В нижеприведенной методике А излагается способ синтеза аналогов GRF-пептида настоящего изобретения.

Методика А
Пептиды синтезируют твердофазным методом с помощью пептидного синтезатора фирмы Applied Biosystems модели 430А (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния) с использованием синтетических циклов, предлагаемых Applied Biosystems. Вос-аминокислоты и прочие реактивы поставлены фирмой Applied Biosystems и другими производителями. Для получения С-концевых карбоксамидов применена химия последовательностей Вос-групп с использованием метода двойного присоединения к исходной п-метилбензгидриламинной смоле. Для получения С-концевых кислот используют соответствующую РАМ смолу. Аспарагин, глутамин и аргинин присоединяют в виде предварительно приготовленных гидроксибензтриазольных сложных эфиров. Все другие аминокислоты присоединяют в виде предварительно полученных симметричных ангидридов Вос-аминокислот.

Для защиты использованы следующие боковые группы:
Arg, тозил
Asp, бензил
Cys, 4-метилбензил
Glu, бензил
Ser, бензил
Thr, бензил
Tyr, 4-бромкарбобензоксигруппа
Lys, 2-хлоркарбобензоксигруппа.

Удаление защитной Вос-группы осуществляют обработкой трифторуксусной кислотой (ТФК) в хлористом метилене. Если хотят получить Hse-содержащие аналоги, в этом случае твердофазным методом необходимо ввести Met с последующей модификацией бромцианом после расщепления HF по хорошо известным методикам. Подобное расщепление в присутствии бромциана превращает Met в пептид с С-концевой Hse-лактонной группой. Последний может быть превращен в пептид с Hse-амидогруппой обработкой соответствующим амином в таком растворителе как метанол или диметилформамид. Для завершения синтеза в пептидах удаляют защитные группы и отщепляют от смолы действием безводного фтористого водорода, содержащего 10% п-крезола. Отщепление боковой защитной группы (групп) и пептида от смолы проводят при 0^oC или ниже, предпочтительно при -20^oC в течение 30 мин с последующим выдерживанием 30 мин при 0^oC. После удаления HF смесь пептид-смола промывают эфиром, пептид экстрагируют ледяной уксусной кислотой и лиофилизируют. Перед очисткой сырые содержащие цистеин пептиды окисляют в соответствующие содержащие цистеиновую кислоту производные при температуре от -10^oC до +10^oC, предпочтительно при 0^oC с использованием надмуравьиной кислоты по методике Stewart et al. "Твердофазный синтез пептидов", с. 113, Pierce Chemical Company, Рокфорд, Иллинойс, 1984. Превращение в С-концевые Hse-лактоны или Hse-амиды осуществляют вышеприведенным способом.

Очистку осуществляют ионообменной хроматографией на Synchroprep S-300 (SynChrom Inc. Линден, Индиана) катионообменной колонке. Пептид наносят с помощью буфера из 20 миллимолярного ТРИС (pH 6,8) в 20%-ном ацетонитриле и элюируют градиентом 0-0,3 молярного хлорида натрия в том же растворителе. Соединения подвергают дополнительной очистке с удалением соли жидкостной хроматографией с обращением фаз на колонке Vydac C-18 (Separations Group. Гесперия, Калифорния) с использованием градиентов вода-ацетонитрил, причем каждая фаза содержит 0,1% ТФК. Целевые фракции объединяют и после лиофилизации получают целевой GRF пептид в виде его трифторацетатной соли. При желании трифторацетатная соль может быть превращена в другие приемлемые соли хорошо известными ионообменными методами.

Пептиды гидролизуют под вакуумом в паровой фазе на рабочей установке Pico-Tag Work (Waters) Station с использованием постоянно кипящей HCl (Pierce) в присутствии в качестве расщепляющего средства фенола при 110^oC в течение 24 ч. Продукты гидролиза анализируют на аминокислотном анализаторе фирмы Beckman, модель 6300. Содержание пептида подсчитывают с использованием в качестве внутреннего стандарта норлейцина известной концентрации.

Пример 1.

Получение трифторацетатной соли Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂
Соед. N 1
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле:
H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществляют ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретические значения: Asp 3,96 (4), Thr 1,84 (2), Ser 1,79 (2), Glu 2,01 (2), Ala 3,04 (3), Val 0,99 (1), Ile 1,93 (2), Leu 5,05 (5), Tyr 1,96 (2), Phe 0,96 (1), Lys 2,02 (2), Arg 3,09 (3).

Пример 2.

Получение трифторацетатной соли Val² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂,
Соед. N 2
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле:
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (в виде соли CF₃COOH) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретические значения: Asp 4,11 (4), Thr 0,96 (1), Ser 1,79 (2), Glu 2,11 (2), Ala 3,04 (3), Val 2,1 (2), Ile 1,91 (2), Leu 5,17 (5), Tyr 2,00 (2), Phe 0,98 (1), Lys 1,99 (2), Arg 2,70 (3).

Пример 3.

Получение трифторацетатной соли Ile² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂,
Соед. N 3
Синтез пептида-аналога GRF отвечающего формуле
H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gn-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 4,12 (4), Thr 0,97 (1), Ser 1,75 (2), Glu 2,09 (2), Ala 3,00 (3), Val 1,05 (1), Ile 2,91 (3), Leu 5,16 (5), Tyr 2,00 (2), Phe 0,99 (1), Lys 1,98 (2), Arg 2,75 (3).

Пример 4.

Получение трифторацетатной соли N-a-(Tyr-Thr)Tyr¹ Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, Соед. N 4
Синтез пептида-аналога GRF отвечающего формуле:
H-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 9,05 (4), Thr 2,68 (3), Ser 1,77 (2), Glu 2,07 (2), Ala 2,9 (3), Val 1,08 (1), Ile 1,89 (2), Leu 5,20 (5), Tyr 2,87 (3), Phe 0,93 (1), Lys 2,01 (2), Arg 3,07 (3).

Пример 5.

Получение N-a-(Tyr-Thr)₂Tyr¹ Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, трифторацетатной соли; Соед. N 5
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле
H-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Aksp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 4,06 (4), Thr 3,66 (4), Ser 1,85 (2), Glu 2,05 (2), Ala 2,94 (3), Val 1,09 (1), Ile 1,91 (2), Leu 5,15 (5), Tyr 3,91 (4), Phe 0,95 (1), Lys 2,00 (2), Arg 3,04 (3).

Пример 6.

Получение N-a-(Tyr-Thr)Tyr¹ Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, трифторацетатной соли; Соед. N 6
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле:
Y-Tyr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 4,06 (4), Thr 1,86 (2), Ser 1,77 (2), Glu 2,07 (2), Ala 3,98 (4), Val 1,08 (1), Ile 1,89 (2), Leu 5,14 (5), Tyr 2,94 (3), Phe 0,96 (1), Lys 1,99 (2), Arg 3,04 (3).

Пример 7.

Получение трифторацетатной соли N-a-(Tyr-Thr)Tyr¹ Ile² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH₂, Соед. N 7
Синтез пептида-аналога GRF отвечающего формуле:
H-Tyr-Thr-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) получен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 4,07 (4), Thr 1,87 (2), Ser 1,75 (2), Glu 2,07 (2), Ala 2,94 (3), Val 1,09 (1), Ile 2,87 (3), Leu 5,12 (5), Tyr 2,92 (3), Phe 0,96 (1), Lys 2,00 (2), Arg 3,05 (3).

Пример 8.

Получение трифторацетатной соли N-a-(Tyr-Ser)Tyr¹ Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF (1-29)NH₂, Соед. N 8
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле:
H-Tyr-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (в виде CF₃COOH соли), осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 4,11 (4), Thr 1,82 (2), Ser 2,64 (3), Glu 2,05 (2), Ala 2,90 (3), Val 1,04 (1), Ile 1,87 (2), Leu 5,16 (5), Tyr 2,92 (3), Phe 0,94 (1), Lys 2,01 (2), Arg 3,04 (3).

Пример 9.

Получение трифторацетатной соли Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse⁴⁵ bGRF(1-45)NH₂, Соед. N 9
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле:
H-Tyr-Val-Asp-Ala-He-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Hse-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 3,05 (3), Thr 0,93 (1), Ser 3,20 (4), Glu 8,41 (8), Gly 2,04 (2), Ala 4,17 (4), Val 2,87 (3), Ile 1,79 (2), Leu 5,96 (6), Tyr 1,88 (2), Phe 0,83 (1), Lys 2,94 (3), Arg 4,93 (5). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 5179,3; теоретически 5179,9.

Пример 10:
Получение трифторацетатной соли Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(1-33)NH₂, Соед. N 10
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле:
H-Tyr-Val-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Hse-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 2,04 (2), Thr 0,93 (1), Ser 3,23 (4), Glu 4,19 (4), Gly 0,95 (1), Ala 3,21 (3), Val 1,93 (2), Ile 1,82 (2), Leu 4,96 (5), Tyr 1,91 (2), Phe 0,91 (1), Lys 1,99 (2), Arg 3,03 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3770,1; теоретически 3770,4.

Пример 11.

Получение трифторацетатной соли Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(1-30)NH₂, Соед. N 11
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле:
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Hse-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 2,05 (2), Thr 0,96 (1), Ser 3,32 (4), Glu 2,04 (2), Ala 3,10 (3), Val 2,12 (2), Ile 1,86 (2), Leu 5,04 (5), Tyr 1,91 (2), Phe 0,89 (1), Lys 2,06 (2), Arg 3,05 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3456,7; теоретически 3457,0.

Пример 12.

Получение трифторацетатной соли Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(1-28)NH₂,
Соединение N 12
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле: H-Tyr-Val-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Hse-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 2,05 (2), Thr 0,99 (1), Ser 2,46 (3), Glu 2,06 (2), Ala 3,09 (3), Val 2,02 (2), Ile 1,86 (2), Leu 5,01 (5), Tyr 1,96 (2), Phe 0,96 (1), Lys 2,00 (2), Arg 2,01 (2). Macc-спектр (M+H)⁺: найдено 3213,5; теоретически 3213,8.

Пример 13.

Получение трифторацетатной соли Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Hse²⁶ bGRF(1-26)NH₂,
Соединение N 13
Синтез пептида-аналога GRF, отвечающего формуле: H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Hse-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 2,06 (2), Thr 0,92 (1), Ser 2,68 (3), Glu 2,1 (2), Ala 3,46 (3), Val 1,89 (2), Ile 0,86 (1), Leu 4,11 (4), Tyr 1,78 (2), Phe 0,82 (1), Lys 1,88 (2), Arg 1,94 (2). Macc-спектр (M+H)⁺: найдено 2986,7; теоретически 2987,5.

Пример 14.

Получение трифторацетатной соли Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Hse²¹ bGRF(1-21)NH₂,
Соединение N 14
Синтез пептида-аналога, отвечающего формуле:
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg-Hse-NH₂ (в виде CF₃COOH соли) осуществлен ступенчатым путем по методике А. Аминокислотный анализ, в скобках приведены теоретические значения: Asp 1,03 (1), Thr 0,94 (1), Ser 2,77 (3), Glu 1,06 (1), Ala 3,38 (3), Val 1,86 (2), Ile 0,84 (1), Leu 2,04 (2), Tyr 1,84 (2), Phe 0,86 (1), Lys 0,93 (1), Arg 2,02 (2). Macc-спектр (M+H)⁺: найдено 2389,3; теоретически 2389,0.

Кроме того, с использованием методики А ступенчатым путем синтезированы следующие пептиды в виде их трифторацетатных солей:
N-a-(Tyr-Thr)•[Thr²Ala¹⁵ Leu²⁷]bGRF(1-29)NH₂, трифторацетатная соль H-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 4,05 (4), Thr 2,69 (3), Ser 1,77 (2), Glu 2,07 (2), Ala 2,90 (3), Val 1,08 (1), Ile 1,89 (2), Leu 5,20 (5), Tyr 2,87 (3), Phe 0,93 (1), Lys 2,01 (2), Arg 3,07 (3).

N-a-(Tyr-Thr-Tyr-Thr)•[Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷]bGRF(1-29)NH₂, трифторацетатная соль
H-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 4,06 (4), Thr 3,66 (4), Ser 1,85 (2), Glu 2,05 (2), Ala 2,93 (3), Val 1,09 (1), Ile 1,91 (2), Leu 5,15 (5), Tyr 3,91 (4), Phe 0,95 (1), Lys 2,00 (2), Arg 3,04 (3).

N-a-(Tyr-Thr)• [Ile²Ala¹⁵Leu²⁷]bGRF(1-29)NH₂, трифторацетатная соль
H-Tyr-Thr-Tyr-Ile-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Asn-Arg-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 4,07 (4), Thr 1,87 (2), Ser 1,75 (2), Glu 2,07 (2), Ala 2,94 (3), Val 1,09 (1), Ile 2,87 (3), Leu 5,12 (5), Tyr 2,92 (3), Phe 0,96 (1), Lys 2,00 (2), Arg 3,05 (3).

N-a-(Tyr-Ser)•[Thr²Ala¹⁵Leu²⁷] bGRF(1-29)NH₂, трифторацетатная соль H-Tyr-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 4,11 (4), Thr 1,82 (2), Ser 2,64 (3), Glu 2,05 (2), Ala 2,90 (3), Val 1,04 (1), Ile 1,87 (2), Leu 5,16 (5), Tyr 2,92 (3), Phe 0,94 (1), Lys 2,01 (2), Arg 3,04 (3).

[Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Hse²⁸]bGRF(1-28)NH₂, трифторацетатная соль
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys- Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Hse-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 2,05 (2), Thr 0,99 (1), Ser 2,46 (3), Hse 0,25 (1), Glu 2,06 (2), Ala 3,09 (3), Val 2,02 (2), Ile 1,86 (2), Leu 5,01 (5), Tyr 1,96 (2), Phe 0,96 (1), Lys 2,00 (2), Arg 2,01 (2). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3213,5; теоретически 3213,8.

[Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Hse³⁰]bGRF(1-30)NH₂, трифторацетатная соль
H-Tyr-Val-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Hse-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 2,03 (2), Thr 0,95 (1), Ser 3,24 (4), Hse 0,61 (1), Glu 2,06 (2), Ala 3,28 (3), Val 1,98 (2), Ile 1,84 (2), Leu 4,97 (5), Tyr 1,89 (2), Phe 0,90 (1), Lys 1,98 (2), Arg 2,92 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3456,6; теоретически 3457,0.

[Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³³] bGRF (1-33)NH₂, трифторацетатная соль H-Tyr-Val-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Hse-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 2,04 (2), Thr 0,93 (1), Ser 3,23 (4), Hse 0,2 (1), Glu 4,19 (4), Gly 0,95 (1), Ala 3,21 (3), Val 1,93 (2), Ile 1,82 (2), Leu 4,96 (5), Tyr 1,91 (2), Phe 0,91 (1), Lys 1,99 (2), Arg 3,03 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3770,1; теоретически 3770,4.

[[Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁵] bGRF(1-45)NH₂, трифторацетатная соль
H-Tyr-Val-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Ser-Arg-Glrl-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Hse-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 3,05 (3), Thr 0,93 (1), Ser 3,20 (4), Hse 0,21 (1), Glu 8,41 (8), Gly 2,04 (2), Ala 4,17 (4), Val 2,83 (3), Ile 1,79 (2), Leu 5,96 (6), Tyr 1,88 (2), Phe 0,83 (1), Lys 2,94 (3), Arg 4,93 (5). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 5179,3; теоретически 5179,9.

[Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Hse²⁸]bGRF(1-28)NH-C₂H₅, трифторацетатная соль
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Hse-NH-этил (CF₃COOH соль). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3241,8; теоретически 3241,8.

[Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸ Hse³³]bGRF(1-33)NH-C₂H₅, трифторацетатная соль
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Hse-NH-этил (CF₃COOH соль). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3797,9; теоретически 3798,4.

[Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰]bGRF(1-30)NH-C₂H₅, трифторацетатная соль
H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Ser-Arg-Hse-NH-этил (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 1,93 (2), Thr 0,87 (1), Ser 3,20 (4), Hse 0,42 (1), Glu 2,00 (2), Ala 3,08 (3), Val 1,98 (2), Ile 1,85 (2), Leu 4,99 (5), Tyr 1,96 (2), Phe 0,97 (1), Lys 2,19 (2), Arg 3,03 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3485,4; теоретически 3485,1.

[Thr²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰] bGRF(1-30)NH₂, трифторацетатная соль H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Ser-Arg-Hse-NH₂ (CF₃COOH соль). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3458,7; теоретически 3459,0.

[Ile²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰] bGRF(1-30)NH₂, трифторацетатная соль H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Hse-NH₂ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 2,04 (2), Thr 0,93 (1), Ser 3,41 (4), Hse 0,56 (1), Glu 2,04 (2), Ala 3,01 (3), Val 1,13 (1), Ile 2,93 (3), Leu 5,11 (5), Tyr 2,00 (2), Phe 0,96 (1), Lys 1,99 (2), Arg 2,93 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3470,4; теоретически 3471,1.

[Ile²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰] bGRF(1-30)NH-C₂H₅, трифторацетатная соль H-Tyr-Ile-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Ser-Arg-Hse-NH-C₂H₅ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 2,01 (2), Thr 0,94 (1), Ser 3,35 (4), Hse 0,47 (1), Glu 2,01 (2), Ala 3,03 (3), Val 1,14 (1), Ile 2,89 (3), Leu 5,12 (5), Tyr 1,99 (2), Phe 0,97 (1), Lys 1,97 (2), Arg 3,00 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3498,7; теоретически 3499,2.

[Ile²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰]bGRF (1-30)NH-C₂H₅, ацетатная соль
H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Hse-NH-C₂H₅ (CH₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 2,16 (2), Thr 0,93 (1), Ser 3,31 (4), Hse 0,62 (1), Glu 1,98 (2), Ala 3,01 (3), Val 1,04 (1), Ile 2,79 (3), Leu 4,97 (5), Tyr 1,94 (2), Phe 0,96 (1), Lys 2,18 (2), Arg 3,63 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3499,9; теоретически 3499,2.

[His¹Ile²Ser⁸Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰] bGRF (1-30)NH-C₂H₅, трифторацетатная соль H-His-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Hse-NH-C₂H₅ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 1,94 (2), Thr 0,91 (1), Ser 3,23 (4), Hse 0,91 (1), Glu 1,97 (2), Gly 0,96 (1), Ala 1,93 (2), Val 0,97 (1), Ile 2,80 (3), Leu 4,90 (5), Tyr 0,96 (1), Phe 0,96 (1), His 0,94 (1), Lys 1,93 (2), Arg 3,70 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3460,3; теоретически 3459,1.

[His¹Ile²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸, Hse³⁰]bGRF(1-30)NH-C₂H₅, трифторацетатная соль
H-His-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Hse-NH-C₂H₅ (CF₃COOH соль). Аминокислотный анализ, в скобках указаны теоретически вычисленные значения: Asp 1,91 (2), Thr 0,88 (1), Ser 3,39 (4), Hse 0,26 (1), Glu 1,90 (2), Ala 2,86 (3), Val 0,99 (1), Ile 2,79 (3), Leu 5,02 (5), Tyr 0,95 (1), Phe 0,95 (1), His 0,92 (1), Lys 1,96 (2), Arg 3,73 (3). Масс-спектр (M+H)⁺: найдено 3473,0; теоретически 3473,1.

Методика В
Помимо получения аналогов GRF твердофазным методом эти аналоги могут быть получены методами генной инженерии по методике, приведенной для получения Leu²⁷ bGRF(1-44)OH (заявка на Европейский патент N 0212531) со следующими модификациями в сегменте ДНК, кодирующими bGRF(1-44)OH, где кодоны для Ala², Asn⁸, Gly¹⁵ и Asn²⁸ заменяются, например, кодонами: (AGT) Thr² или (ATT) Ile² или (GTT) Val², (AGT) Ser⁸, (GCT) Ala¹⁵, (AGT) Ser²⁸, соответственно.

Кроме того, для Cya³, содержащих аналоги GRF, кодон GAT (Asp³) заменяется кодоном TGT для Cys³. После экспрессии белка и расщепления бромцианом в муравьиной кислоте по методике, приведенной в вышеуказанной заявке на Европейский патент, к раствору примерно при 0^oC добавляют перекись водорода с целью окисления остатков Cys в Cya. После этого пептид очищают описанными способами.

Помимо этого, для N-терминальных аналогов GRF к N-концам добавляют следующие кодирующие удлинение сегменты ДНК: (TATACT) для Tyr-Thr, (TATACT)_n для (Tyr-Thr)_n, или (TATAGT) для Tyr-Ser, (TATAGT)_n для (Tyr- Ser)_n, или (TATAGTTATACT) для Tyr-Ser-Tyr-Thr, или (TATACTTATACT) для Tyr-Thr-Tyr-Ser, (GATGCT) для Asp-Ala и т.д. После экспрессии белка отделение измененных веществ и последующее их расщепление бромцианом в муравьиной кислоте осуществляют по методике, приведенной в вышеуказанной заявке, и выделяют при пониженном давлении. Сырой пептид затем очищают описанными методами.

Возможность получать соединения настоящего изобретения известными методами генной инженерии обусловлена тем, что заявленные пептиды целиком состоят из природных аминокислот. В этом их отличие от известных аналогов, содержащих не кодируемые ДНК компоненты, такие как: D-Ala и/или дезамино-Tyr, требующие для широкомасштабного получения дорогостоящего химического синтеза или сочетания методов генной инженерии с химическими методами.

Рекомбинантные микроорганизмы-хозяева, используемые в настоящем изобретении, получают методами биотехнологии, хорошо известными специалистам, и изложенными, например, в издании "Молекулярное клонирование, T.Maniatis et al. Cold Spring Harbor Laboratory (1982) и B.Perbal "Практическое руководство к молекулярному клонированию", John Wiley Sons (1984). Аналоги с С-концевыми Hse(лактоном), HseOH и HseN(R_a)(R_b,) могут быть получены методами, приведенными Kempe et al. "Биотехнология", т.4, с.565-568 (1986).

Методика С
Данная методика относится к получению N-алкилированных аналогов GRF, раскрытых в настоящем изобретении. Сами пептиды могут быть получены либо химическими, либо биотехнологическими методами (соответственно по методике А или по методике В). N-алкилирование затем может быть осуществлено известными методами, например, согласно Murphy W.A. И Coy D.H. "Активные долгодействующие алкилированные аналоги фактора выделения гормона роста", Peptide Research 1, 36-41 (1988), V.Sythyamoorthy et al. "Восстановительное метилирование ботулинового нейротоксина типов А и В", Mol. Cell. Biochem. 83, 65-72 (1988).

По методике С могут быть также получены следующие пептиды:
N-∈-iPr-Tyr¹ Thr² Ser⁸ N-e-iPr-Lys^12,21 Val¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(1-29)NH₂
N-e-iPr-Tyr¹ Thr² Ser⁸ N-e-iPr-Lys^12,21 Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(1-40)NH₂
N-e-Bzl-Tyr¹ Thr² Ser⁸ N-e-Bzl-Lys^21,21 Val¹⁵ Ile²⁷ Ser²⁸ bGRF(1-32)NH₂
N-e-iPr-Tyr¹ Ile² Ser⁸ N-e-iPr-Lys^12,21 Ala¹⁵ Leu²⁷ bGRF(1-40)NH₂
N-e-Bzl-Tyr¹ Val² Ser⁸ N-e-Bzl-Lys^12,21 Val¹⁵ Ile²⁷ Ser²⁸ bGRF(1-32)NH₂
Все синтетические GRF пептиды настоящего изобретения, включая пентоды, приготовленные согласно примерам, как считают, являются биологически активными и применимы для стимулирования выделения GH гипофизом.

Дозировки в интервале от 10 нанограмм до 5 микрограмм на килограмм (кг) массы тела, как считают, будут особенно эффективными для стимулирования секреции GH.

Стимулирование секреции GH подобными пептидами должно привести к сопутствующему росту человекообразных, коров и прочих животных с нормальным уровнем GH. Более того, введение пептидов должно изменить содержание жира в организме и модифицировать другие зависящие от GH метаболические, иммунологические и связанные с развитием процессы. К примеру, подобные аналоги могут оказаться полезными в качестве средств стимулирования анаболических процессов в человеческом организме, например, после ожогов. В качестве другого примера можно указать на введение этих аналогов домашним теплокровным животным, таким как цыплята, индюшки, свиньи, козы, крупный рогатый скот и овцы; они могут быть использованы также в сельском хозяйстве для выращивания рыбы и других холоднокровных морских животных, например морских черепах и угрей, а также амфибий для ускорения их роста и увеличения соотношения белков к жирам, при добавлении в корм эффективных количеств пептидов. Указанные аналоги могут быть использованы для повышения иммунных функций у человека или животного.

Ежедневные дозировки в интервале от 10 нанограмм/кг до примерно 50 микрограмм/кг, как полагают, будут особенно эффективными для повышения лактации, роста и стимулирования иммунных функций.

Вводимые человеку или животным такие синтетические пептиды должны иметь чистоту по меньшей мере 93% предпочтительно не менее 98%
Подобные синтетические пептиды или их нетоксичные соли в сочетании с фармацевтически или ветеринарно приемлемыми носителями образуют фармацевтическую композицию, предпочтительно состав с постепенно высвобождающимся активным веществом, который может быть введен животным, в том числе и человеку, внутривенно, внутримышечно, подкожно, например через нос. Введение может быть назначено врачом с целью стимулировать выделение GH в тех случаях, когда подвергаемый обработке объект нуждается в такой лечебной помощи. Необходимая дозировка будет меняться в зависимости от конкретного подвергаемого лечению заболевания, тяжести заболевания и длительности необходимого лечения.

Подобные пептиды часто вводят в виде нетоксичных солей, таких как соли, образованные добавлением кислот, или комплексы с металлами, например цинком, железом и т.п. (которые в настоящей заявке для простоты рассматриваются как соли). Иллюстрацией таких, образованных добавлением кислот, солей могут служить гидрохлорид, гидробромид, сульфат, малеат, ацетат, нитрат, бензоат, сукцинат, малеат, аскорбат, тартрат и т.п. При внутривенном введении активного компонента могут быть использованы изотонический солевой раствор, фосфатный буферный раствор и т.п.

Пептиды следует вводить человеку под наблюдением врача, и фармацевтические композиции обычно содержат пептид в сочетании с обычным твердым или жидким фармацевтически приемлемым носителем. Как правило, парентеральная дозировка будет содержать от примерно 100 нанограмм до примерно 50 микрограмм пентода на килограмм массы тела пациента.

Хотя изобретение и содержит возможные рекомендуемые варианты осуществления, тем не менее необходимо подчеркнуть, что, как очевидно обычному специалисту, возможны и другие различные изменения и модификации, не выходящие за рамки объема изобретения. К примеру, в соответствии с известной к настоящему времени экспериментальной практикой могут быть получены модификации пептидной цепи. В частности, при отщеплении одного или двух остатков в начале С-терминального пептида можно получить пептиды, сохраняющие очень существенные остатки, ответственные за биологическую активность пептида, и такие пептиды рассматриваются, как охватываемые объемом настоящего изобретения. Кроме того, может быть осуществлено наращивание С-конца и/или N-конца, и/или эквивалентные остатки могут быть заменены природными остатками, что известно в химии пептидов, с образованием других аналогов, обладающих, например, повышенной устойчивостью к протеолизу и одновременно сохраняющих по меньшей мере частично активность заявленных пептидов, не выходя за объем изобретения, иллюстрируемого примерами 1-14. Аналогично, известные изменения в карбоксильном фрагменте у С-конца, например, в виде низшего алкиламида, также приведут к эквивалентным молекулам.

Путем, аналогичным вышеописанному,
GRF пептиды формулы:
R'-R₁-R'₂-R₃-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈-Ser-Tyr-Arg-R'₁₂-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln-Leu-R₁₈-Ala-Arg-R'₂₁-R₂₂-Leu-Gln-R₂₅-Ile-R₂₇-R₂₈-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄-R₃₅-Gln-Glu-R₃₈-R₃₉-R₄₀-Arg-R₄₂-Arg-Leu-Z,
где
R' представляет H-(Y-X)_n, где Y и X одинаковы или различны, представляют аминокислоту; выбранные из Thr или Ser, n 1, 2;
R₁ Tyr или His;
R'₂ Thr, Val или Ile;
R₃ Asp;
R₈ Ash или Ser;
R'₁₂ Lys;
R₁₃ Val;
R₁₅ Ala, Val, Leu, Ile или Gly;
R₁₈ Ser;
R'₂₁ Lys или Arg;
R₂₂ Ala или Leu;
R₂₅ Asp;
R₂₇ Ile или Leu;
R₂₈ Asn или Ser;
R₃₄ Ser;
R₃₅ Ash или Ser;
R₃₈ Arg или Glu;
R₃₉ Gly или Arg;
R₄₀ Ala или Ser;
R₄₂ Ala, Val или Phe; и
Z представляет карбоксильный фрагмент аминокислотного остатка у С-конца и является радикалом формул: -COOR_a, -CON(R_a)(R_b) или -CH₂OR_a, в которых R_a и R_b представляют C₁-C₈ алкил или водород; или биологически активный фрагмент пептида, имеющийся в аминокислотной последовательности 20-44, предпочтительно 27-44, от R заместителя у N-конца до С-конца; или Hse(лактон), HseOH или HseN(R_a)(R_b) со значениями, указанными выше и/или нетоксичная соль, могут быть получены в соответствии с известными в настоящее время методами с сохранением основной биологической активности пентода. Подобные пептиды также входят в объем притязаний настоящего изобретения. Указанные пептиды могут быть получены замещением метил-D-аланина, D-аланина или предпочтительно аланина в положении 2 на Val, Ile или Thr и могут быть использованы аналогично.

Поскольку речь идет об активности химических соединений, эти сведения ограничены экспериментом in vitro для отдельных представителей. Также приводится обширный материал, демонстрирующий их действие как релизинг-фактора (в том числе in vivo), их более высокую метаболическую стабильность по сравнению с природным GRF (как видно, например, из табл.1). Дозировки и способы введения препаратов, содержащих заявляемые соединения, указаны выше не только для животных, но и для человека.

В табл. 1 термин "бычки" относится к бычкам из породы Гольштейна (животные из отряда рогатого скота). Термин "биоактивность" относится к активности выделения гормона роста (GH) у бычков с учетом доз и пути введения лекарства, отмеченных в табл.1. Иначе говоря, приведенная здесь биоактивность отражает количество GH, индуцированного специфическими аналогами GRF на гипофизарном уровне и выброшенного в кроваток. Сыворотка GH затем вычисляется на основе площади под кривой сыворотки GH для каждого введения лекарства.

Данные, приведенные в табл.1, могут быть использованы с целью их экстраполяции на другие аналоги GHR, содержащие заместители Thr², Val² или Ile² для доказательства способности этих соединений высвобождать гормон роста (GH).

Данные табл.1 показывают способность высвобождать гормон роста (GH) для четырех (4) аналогов из заявленных соединений, а именно Thr²Leu²⁷-bGRF(1-29)NH₂, Thr²Ala¹⁵Leu²⁷-bGRF(1-29)NH₂, Val²Ala¹⁵Leu²⁷- bGRF(1-29)NH₂ и Ile²Ala¹⁵Leu²⁷-bGRF(1-29)NH₂. При этих испытаниях на животных (бычки Гольштейна) не было отмечено никакого токсического воздействия.

Ниже приведены другие результаты испытаний соединений, содержащих Val²:
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸-bGRF(1-28)NH₂
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸-bGRF(1-28)NH-C₂H₅
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸-bGRF(1-28)NH-C₄H₉
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸-bGRF(1-28)NH-C₈H₁₇
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH₂
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH-C₂H₅
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH-C₄H₉
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH-C₈H₁₇
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁸ Ser²⁸ Hse³³-bGRF(1-33)NH₂
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³-bGRF(1-33)NH-C₂H₅
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³-bGRF(1-33)NH-C₄H₉
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³-bGRF(1-33)NH-C₈H₁₇
a также сравнительных соединений bGRF(1-44)NH₂ и дезамино-Tyr¹ D-Ala² Ala¹⁵hGRF(1-29)NH₂. В этом опыте проводился анализ на соматотропин (GH) высвобождающую активность, а именно с использованием методов, описанных W.M. Moseley et al. В J.Endocrinol. 117, 253-259 (1988). (см. табл.2).

Аналогичные исследования были проведены для соединений
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸-bGRF(1-28)NH₂,
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH₂,
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³-bGRF(1-33)NH₂,
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse⁴⁵-bGRF(1-45)NH₂.

(Cм. прилагаемые табл.3 и 4).

Так же исследовался полипептид с Ile² Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰- bGRF(1-30)NH₂. (Cм. прилагаемую табл.5).

Аналогично исследовались полипептиды:
Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH-C₂H₅
His¹ Ile² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH-C₂H₅
Ile² Ser⁸ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH-C₂H₅
His¹ Ile² Ser⁸ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰-bGRF(1-30)NH-C₂H₅
и сравнительные данные с bGRF(1-44)NH₂ (см. табл.6 и 7).

Другие исследования проводились на GRF-аналогах с различными N-концевыми группами:
N-α-(Tyr-Thr)Tyr¹ Тhr² Ala¹⁵ Leu²⁷-bGRF(1-29)NH₂
N-a-(Tyr-Thr)₂Tyr¹ Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷-bGRF(1-29)NH₂
N-a-(Tyr-Thr)Tyr¹ Ile² Ala¹⁵ Leu²⁷-bGRF(1-29)NH₂
N-a-(Tyr-Ser)Tyr¹ Thr² Ala¹⁵ Leu²⁷-bGRF(1-29)NH₂.

Они также сравнивались со сравнительными соединениями -bGRF(1- 44)NH₂ по активности выделения соматотропина (GH) описано в вышеупомянутом журнале J. Endocrinol. 117, 253-259 (1988) (см.табл.8).

Новые GRF пептиды исследовались в виде их трифторацетатных солей. Однако, совершенно очевидно, что может быть использована любая нетоксичная фармацевтически приемлемая соль. Хорошо известно также и то, что действующим началом, естественно, является само соединение, структура которого "несет ответственность" за вид биологической активности.

Как видно из приведенных данных, полученные пептиды превосходят известные GRF-аналоги.

Использование: в медицине и ветеринарии, как соединения, промотирующие высвобождение гормона роста гипофизом. Сущность изобретения: новые GRF пептиды с повышенной стабильностью в плазме и водных средах при нейтральных значениях pH. 13 з.п.ф-лы, 8 табл.

1. Производные пептидов аналоги GRF общей формулы I
R R₁ R₂ Asp Ala Jle Phe Thr R₈ Ser Tyr Arg Lys Val Leu R_1 5 Gln Leu Ser Ala Arg A B C y x z;
R H, H[Tyr Thr]n; n 1, 2; H[Tyr Ser]
R₁ Tyr, His;
R₂ Thr, Val, Jle;
R₈ Ser, Asu;
R_1 5 Ala, Gly, Val, Leu, Jle;
A связь или группа Lys²¹-Leu²²-Leu²³-Gln²⁴-Asp²⁵;
B связь или группа Jle²⁶-Leu²⁷;
C связь или группа Ser Arg-; -Ser Arg Gln Gln Gly Ser Arg Ser Arg Gln Glu Gly;
Y связь или Asn,
или -[Gln Arg Asu Gln Glu Gln Gly Ala Lys Val Arg - Leu-]
X Hse, Arg;
Z NH₂, NHAlk (C₁ C₈),
или их нетоксичные соли. 2. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что аминокислота в положении 15 представлена Ala. 3. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он отвечает формуле
H Tyr Val Asp Ala Jle Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln Leu Ser Ala Arg HseNH₂. 4. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что он включает его биологически активный фрагмент, проходящий от R у N-конца к остатку в любом из положений 27 44 у его C-конца, и где R_1 5 Ala, Val, Leu, Jle. 5. Пептид по п.4, отличающийся тем, что R H, R_1 5 Ala. 6. Пептид по п.5, отличающийся тем, что R₁ Tyr. 7. Пептид по п.6, отличающийся тем, что R₈ и R₂₈ Ser. 8. Пептид по п.7, отличающийся тем, что он отвечает формуле
HTyr Val Asp Ala Jle Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys - Val Leu Ala Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp - Jle Leu Ser Arg Gln Gln Gly HseNH₂,
или его нетоксичная соль. 9. Пептид по п.4, отличающийся тем, что R₂ Thr. 10. Пептид по п.9, отличающийся тем, что он отвечает формуле
H Tyr Thr Asp Ala Jle Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Jle Leu Ser Arg Gln Glu Gly HseNH₂;
H Tyr Thr Asp Ala Jle Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Jle Leu Ser Arg Gln Gln Gly HseNHC₂H₅;
H Tyr Thr Asp Ala Jle Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Jle Leu HseNH₂,
или его нетоксичная соль. 11. Пептид по п.4, отличающийся тем, что R₂ Jle. 12. Пептид по п.11, отличающийся тем, что он отвечает формуле
H Tyr Jle Asp Ala Jle Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln Leu Ser Ala Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Jle Leu Ser Arg HseNH₂,
или его нетоксичная соль. 13. Пептид по п.4, отличающийся тем, что он выбран из группы, включающей
Val² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 0 bGRF(1 30)NH₂
Val² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 0 bGRF(1 30) NHC₂H₅
Jle² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 0 bGRF(1 30) NH₂
Jle² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 0 bGRF(1 30) NHC₂H₅
Val² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 3 bGRF (1 33) NH₂
Val² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 3 bGRF (1 33) NHC₂H₅
Jle² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 3 bGRF (1 33) NH₂
Jle² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 3 bGRF (1 33) NHC₂H₅
Thr² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 0 bGRF (1 30) NH₂
Thr² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 0 bGRF (1 30) NHC₂H₅
Thr² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 3 bGRF (1 33) NH₂
Thr² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 3 bGRF (1 33) NHC₂H₅
Val² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Hse^2 8 bGRF (1 28) NH₂
Val² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Hse^2 8 bGRF (1 28) NHC₂H₅
Jle² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Hse^2 8 bGRF (1 28) NH₂
Jle² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Hse^2 8 bGRF (1 28) NHC₂H₅,
или его нетоксичная соль. 14. Пептид по п.4, отличающийся тем, что он выбран из группы, включающей
Thr² Ala^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
Val² Ala^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
Jle² Ala^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
N -α- (Tyr Thr) Tyr¹ Thr², Ala^1 5, Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
N -α- (Tyr Thr)₂ Tur¹ Thr² Ala^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
N -α- (Tyr Thr) Tyr¹ Ala^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
N -α- (Tyr Thr) Tyr¹ Jle² Ala^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
N -α- (Tyr Ser) Tyr¹ Thr² Ala^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
Val² Ser⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse⁴⁵ bGRF (1 45) NH₂,
Jle² Ser⁸ Ala^1 5 Hse^2 7 bGRF (1 - 27) NH₂,
Thr² Val^1 5 bGRF (1 29) NH₂;
Thr² Leu^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂;
Thr² Jle^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂;
Thr² Ser⁸ Val^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 0 bGRF (1 30) NH₂;
Thr² Ser⁸ Ala^1 5 Jle^2 7 Ser^2 8 bGRF (1 29) NH₂;
Thr² Ser⁸ Leu^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 Hse^3 0 bGRF (1 30) OH;
Thr² Ser⁸ Jle^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 bGRF (1 40) OH;
N -α- (Tyr Thr)₂ Tyr¹ Thr² Val^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂;
N -α- (Tyr Ser)² Tyr¹ Thr²Ala^1 5 Leu^2 7 Hse^3 0 bGRF (1 30) NH₂;
N -α- (Tyr Thr)₂ Tyr¹ Thr² Jle^1 5 Leu^2 7 bGRF (1 29) NH₂,
N -α- (Tyr Thr) Tyr¹ Thr² Ser⁸ Ala^1 5 Leu^2 7 Ser^2 8 bGRF (1 29) NH₂,
или его нетоксичная соль.

Приоритет по признакам:
16.06.89 при R₂ Тhr;
27.10.89 при R₂ Val, Jle.