ПОЛИПЕПТИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ D-2-АЛКИЛТРИПТОФАН, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ГОРМОНА РОСТА Российский патент 2000 года по МПК C07K5/117 C07K7/06 C07K14/00 A61K38/06 A61K38/25 A61P5/02 

Настоящее изобретение относится к олигопептидным соединениям, которые обладают активностью при пероральном введении, включающие в себя аминокислоту D-2-алкилтриптофан, которая обладает способностью высвобождать соматропный гормон роста (GH).

Известный уровень техники
Увеличение уровней гормона роста (GH) у млекопитающих после введения соединений, индуцирующих секрецию GH, может приводить к ускорению роста, увеличению мышечной массы и усилению образования молока. Кроме того, известно, что увеличение уровней гормона роста у млекопитающих можно получить в результате введения факторов, высвобождающих ростовой гормон, таких как гормоны, высвобождающие ростовой гормон (GHRH).

Повышение уровней ростового гормона у млекопитающих можно получить путем введения пептидов, высвобождающих ростовой гормон, некоторые из них уже описаны, например в US 4223019, US 4223020, US 4223021, US 4224316, US 4226857, US 4228155, US 4228156, US 4228157, US 44228158, US 4440512, US 4410513, US 4411890 и US 4839344.

По этой причине существует потребность в довольно простых коротко-цепочечных полипептидах, промотирующих высвобождение ростового гормона, при условии их простого и удобного получения, легкой очисткой и образования композиций, которые активны при пероральном введении.

Одним из наиболее изученных пептидов, высвобождающий ростовой гормон (GHRP), был известный многие годы как GHRP-6 (C.Y. Bowers et al., Endocrinology 114:1537 (1984)), пептид с формулой His-D-Trp-Ala- Trp-D-Phe-Lys-NH₂, GHRP-6 высвобождает ростовой гормон ин витро и ин виво и обладает пероральной активностью у животных и человека. Изучили его молекулярный механизм и один из его аналогов - гептапептид GHRP-1 (Cheng et аl., Endocrinology 124: 2791 (1989); M.S. Akman et аl., Endocrinology 132:1286 (1993)). Установили, что в противоположность встречающемуся в природе GHRH, эти пептиды, чтобы высвободить GH, действуют через разные рецепторы, при помощи механизма, который не зависит от цАМФ и который действует через другие внутриклеточные пути, такие как мобилизация снабжения кальцием и процесс, зависимый от протеинкиназы C (РКС) (L. Bresson-Bepoldin and L. Dufy-Barbe, Cell. Calcium 15, 247, (1994)).

Краткое изложение существа изобретения
Было установлено, что интродуцирование D-2-алкилтриптофана (2-Mrp) в олигопептид из групп GHRP, модифицирует известный внутриклеточный механизм высвобождения GH. В некоторых случаях наблюдали значительное повышение активности аденилатциклазы в передней доле гипофиза мыши и человека, однако конкретный механизм оставался неясным.

Таким образом, модификация триптофана (для его D-конформации), полученная с помощью единственной алкильной группы в положении 2, благоприятно сказываясь на повышении стабильности аминокислотного остатка Trp (R. Deghenghi WO 91/18016, опубликованный 28.11.1991 и R. Deghenghi et al., Life Sciences 54, 1321, (1994)), кроме всего ответственна за неожиданное изменение внутриклеточных механизмов, которые теперь не зависят от кальция, отчасти зависят от аденилатциклазы, и более похожи на механизмы GHRH, как и других пептидных гормонов. (James D. Watson et al., Молекулярная Биология Гена, 4-е изд. , The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, California, 1987, p. 60). Другим отличительным признаком настоящего изобретения является очень высокая активность некоторых пента-, гекса-, и гептапептидов, а также очень благоприятное соотношение активность/сила в группе меньших тетрапептидов при оральном введении.

Олигопептиды настоящего изобретения имеют следующую формулу:
A-D-Mrp-(Ala)_n-B-C,
в которой A представляет любую встречающуюся в природе L-аминокислоту или ее D-изомер, при условии, что A не является His, если B представляет собой Trp, C представляет D-Phe-Lys-NH₂, или A представляет имидазолацетил, изонипекотил, 4-аминобутирил, 4-(аминометил)циклогексанкарбонил, Glu-Tyr-Ala-His, Tyr-Ala-His, Tyr-His, D-Thr-His, а более предпочтительно A представляет D-Ala, D-Thr, Tyr; D относится к декстроизомеру, Mrp представляет 2-алкилтриптофан, предпочтительно 2-метилтриптофан; n представляет 0 или 1; B представляет L- или D-Trp, Phe или D-β- Nal; C представляет NH₂, D-Phe-Lys-NH₂, Phe-LysNH₂, D-Trp-LysNH₂, D-Phe-Lys-ThrNH₂, D-Phe-Lys-D-ThrNH₂, OR, в которой R представляет алкильную группу C₁-C₃, более предпочтительно, когда B представляет Trp, тогда C представляет Phe-LysNH₂ или D-Phe-LysNH₂, и когда B представляет Phe, тогда C представляет D-Trp-LysNH₂.

Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к короткоцепочечным полипептидам, которые способствуют высвобождению и повышению уровней ростового гормона в крови животных, каждый из которых включает в себя пептидную цепь D-изомера 2-алкилтриптофана (D-2-Me-Trp или D-Mrp).

Данные полипептиды, включенные в объем настоящего изобретения, выражены следующей формулой
A-D-Mrp-(Ala)_n-B-C
в которой A представляет встречающуюся в природе L-аминокислоту или ее D-изомер, при условии, что A не является His, если B представляет Trp, C представляет D-Phe-LysNH₂, или A представляет имидазолацетил, изонипекотил, 4-аминобутирил, 4-(аминометил)циклогексанкарбонил, Glu-Tyr-Ala-His, Tyr-Ala-His, Tyr-His, D-Thr-His, и более предпочтительно, что A представляет D-Ala, D-Thr, Tyr; D относится к декстроизомеру, Mrp представляет 2-алкилтриптофан, предпочтительно 2-метилтриптофан; n представляет 0 или 1; B представляет L-или D-Trp, или D -β-Nal; C представляет NH₂, D-Phe-LysNH₂, Phe-LysNH₂, D-Trp-LysNH₂, D-Phe-Lys-ThrNH₂, D- Phe-Lys-D-ThrNH₂, OR, в которой R представляет алкильную группу C₁-C₃, более предпочтительно, когда B представляет Trp, тогда C представляет Phe-LysNH₂ или D-Phe-LysNH₂, и когда B представляет Phe, тогда C представляет D-Trp-LysNH₂, и аддитивные соли фармацевтически приемлемых органических или неорганических кислот любых указанных полипептидов.

Использованные сокращения аминокислотных остатков применяются здесь согласно стандартной номенклатуре пептидов:
Gly = Глицин
Tyr = L-Тирозин
Ile = L-Изолейцин
Glu = L-Глутаминовая кислота
Thr = L-Треонин
Phe = L-Фенилаланин
Ala = L-Аланин
Lys = L-Лизин
Asp = L-Аспарагиновая кислота
Cys = L-Цистеин
Arg = L-Аргинин
Gln = L-Глутамин
Pro = L-Пролин
Leu = L-Лейцин
Met = L-Метионин
Ser = L-Серин
Asn = L-Аспарагин
His = L-Гистидин
Trp = L-Триптофан
Val = L-Валин.

Кроме того,
D -β- Nal = D- β -Нафтилаланин;
INIP = Изонипекотил;
IMA = Имидазолилацетил;
GAB = 4-аминобутирил;
Mrp = 2-алкилтриптофан.

В соответствии с настоящим изобретением под алкилом подразумевается низший алкил, включающий в себя от 1 до 3 углеродных атомов. Примеры низшего алкила представляют собой метил, этил, пропил, изопропил. Среди них метильная группа является наиболее предпочтительной.

Буква "D", предшествующая трем буквам аббревиатуры, свидетельствует о D-конфигурации аминокислотного остатка.

Предпочтительные соединения, высвобождающие ростовой гормон в варианте осуществления настоящего изобретения представляют:
INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂;
INIP-D-Mrp-D -β- Nal-Phe-Lys-NH₂;
IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂;
IMA-D-Mrp-D -β- Nal-Phe-Lys-NH₂;
GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂;
GAB-D-Mrp-D -β- Nal-Phe-Lys-NH₂;
GAB-D-Mrp-D -β- Nal-NH₂;
GAB-D-Mrp-D -β- Nal-OC₂H₅;
4-(аминометил)циклогексанкарбонил-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂;
4-(аминометил)циклогесанкарбонил-D-Mrp-D -β- Nal-Phe-Lys-NH₂;
D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂;
D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂;
His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH₂;
Tyr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂;
His-D-Mrp-Ala-TrpNH₂;
D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH₂;
в которых Mrp представляет 2-метилтриптофан, INIP, IMA и GAB представляют, как указано выше,
и аддитивные соли фармацевтически приемлемых органических и неорганических кислот любого из указанных полипептидов.

Эти соединения можно вводить парентерально, интраназально и перорально, или можно составить рецептуру с контролируемой системой высвобождения в виде биологически распадающихся микрокапсул, микросфер, подкожных имплантантов и т.п.

Данные полипептидные соединения в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены обычными химическими способами, как твердофазным синтезом или синтезом в растворе, или при помощи классических способов, известных в технике. Твердофазный синтез начинают с C-конца пептида. Готовят соответствующий исходный материал, например, присоединяя необходимую защищенную альфа-аминокислоту к хлорметилированной смоле, гидроксиметилированной смоле, бензгидриламиновой смоле (BHA) или к параметилбензгидриламиновой смоле (p-Me-BHA). К примеру, хлорметилированная смола продается под торговой маркой BIOBEDS^® SX 1 Лабораторией BioRad, Richmond, California. Получение гидроксиметильной смолы описано у Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 15997, (1966). Получение BHA-смолы описано Pietta and Marshal, Chem. Comm., 650 (1970) и продается Peninsula Laboratories Inc., Belmont, California.

После присоединения на начальном этапе, защитную группу альфа-аминокислоты удаляют с помощью различных кислотных реагентов, включающих в себя трифторуксусную кислоту (TFA) или соляную кислоту (HCl), растворенных в органических растворителях при комнатной температуре. После удаления защитной группы альфа-аминокислоты, оставшиеся защищенные аминокислоты последовательно присоединяют в определенном порядке. Каждая защищенная аминокислота может, как правило, реагировать примерно более трех раз, используя соответствующую карбоксильную активирующую группу, такую как дициклогексилкарбодиимид (DCC) или диизопропилкарбодиимид (DIC), растворенный, например, в метиленхлориде (CH₂Cl₂) или диметил-формамиде (DMF) и их смеси. После завершения построений необходимой аминокислотной последовательности, пептид отщепляют от смолы-носителя путем обработки ее реагентом, таким как фтористый водород (HF), который отщепляет не только пептид от смолы, но также, что более обычно, защитные группы боковых цепей. Когда используют хлорметилированную смолу или гидроксиметилированную смолу, обработка с помощью HF приводит к образованию кислого пептида в свободной форме. Когда используют смолу BHA или смолу p-Me-BHA, обработка с помощью HF непосредственно приводит к образованию амидного пептида в свободной форме.

Рассмотренная выше методика твердофазного синтеза известна в технике и описана Atherton and Sheppard, Твердофазный синтез пептидов (IRL Press, Оксфорд, 1989).

Некоторые способы, проводимые в растворе, которые можно использовать для синтеза пептидных составляющих настоящего изобретения, подробно описаны у Bodansky et al., Синтез пептидов, 2-е издание, John Wiley & Sons, Нью Йорк, N. Y. 1976 и у Jones, Химический синтез пептидов, (Clarendon Press, Оксфорд, 1994).

Эти соединения можно вводить животным и человеку в эффективной дозе, которую может легко определить специалист в данной области и которую можно изменять в соответствии с видом, возрастом, полом и весом подвергающегося лечению субъекта. Например, при внутривенном введении предпочтительная доза лежит в пределе примерно от 0,1 мкг до 10 мкг общего количества пептида на кг веса тела. При пероральном введении обычно требуются большие количества. Например, при пероральном введении уровень дозирования обычно изменяется от примерно 30 мкг до примерно 1000 мкг полипептида на кг веса тела. Точную дозу можно легко определить эмпирически на основании вышеприведенного описания.

Композиции, которые включают в качестве активного ингредиента органические и неорганические аддитивные соли вышеописанных полипептидов и их сочетания, необязательно в смеси с носителем, разбавителем, связующим веществом или покрытием, задерживающим высвобождение, также включены в объем настоящего изобретения. Фармацевтические формы с задержанным высвобождением, включающие разлагающиеся основы, пригодные для подкожного имплантирования, являются особенно интересными. Примеры этих связывающих веществ описаны в WO 9222600 и WO 9512629.

Биологическая активность
Активность этих соединений ин виво определяли в течение десяти дней на крысах, которым вводили подкожно (s.c.) дозу 300 мкг/кг или различные дозы при изучении дозовой зависимости, в соответствии с подробно описанными исследованиями у R. Deghenghi et al., Life Sciences 54, 1321, (1994). Результаты подытожены в нижеприведенной Таблице, количество освобожденного GH измеряли через 15 минут после введения.

Стандартный образец GHRP-2 имел структуру D-Ala-D -β- Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂ (Chen and Clarke, J. Neuroend. 7, 179 (1995)).

Действие ин витро на активность аденилатциклазы измеряли в клетках передней доли гипофиза крыс весом 150 г и показали 30% повышение, в сравнении с базисной линией при EC₅₀=0,23 нм для пептида D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂, тогда как GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂) приводил к инактивированию.

Нижеследующие примеры более подробно иллюстрируют настоящее изобретение.

ПРИМЕР 1
Синтез GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe/Lys-NH₂ (Mrp = 2-метилтриптофан)
Твердофазный синтез осуществляли с 9-флуоренилметилоксикарбонильными (Fmoc)-аминокислотами при подготовке смолы для упаковки колонки-реактора в соответствии с одним из нескольких способов, известным специалистам в данной области, поясненных примером в "Твердофазном синтезе пептидов" под редакцией A. Atherton and R.C. Sheppard, IRL press at Oxford University press, 1989. Защищенные аминокислоты представляют собой Fmoc-Lys(Fmoc)-Opfp (Opfp = пентафторфениловый эфир), Fmoc-Phe-Opfp, Fmoc-D-Trp-Opfp, Fmoc-D-2-Me-Trp-Opfp и Fmoc-GAB-Opfp (GAB = гамма-аминомасляная кислота). Альтернативно, реактивы Кастро, ВОР и РуВОР (сравни Le Nguen and Castro (1988), B: Химии пептидов 1987, с. 231-238. Фонд исследования белков, Осака; и Tetragedron Letters 31, 205 (1990)) также можно использовать, преимущественно как прямо присоединяющие реактивы.

После отщепления и отделения, названный пептид выделяли очисткой в виде ацетатной соли. Степень очистки (ЖХВД): 98%, М.в. (М+Н⁺)=764,3 (М.в.расчетный=763,9).

ПРИМЕР 2
В соответствии с методикой, описанной в Примере 1, синтезировали и получили в виде ацетатных солей нижеследующие пептиды:
INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂; степень очистки (ЖХВД)=99,0%,
М.в.(М+H⁺=790,4; расчетный = 790,0)
INIP-D-Mrp-D -β- Nal-Phe-Lys-NH₂; степень очистки (ЖХВД)=96,5%,
М.в.(М+H⁺=801,4; расчетный = 801,0)
IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂; степень очистки (ЖХВД)=99,2%, М.в.(М+H⁺= 786,5; расчетный = 786,8)
IMA-D-Mrp-D -β- Nal-Phe-Lys-NH₂; степень очистки (ЖХВД)=97,3%, М.в. (М+H⁺=798,3; расчетный = 797,9)
GAB-D-Mrp-D -β- Nal-Phe-Lys-NH₂;
4-(аминометил)циклогексанкарбонил-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂;
4-(aминометил)циклогексанкарбонил-D-Mrp-D -β- Nal-Phe-Lys-NH₂;
D-Ala- D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂;
D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂;
His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH₂;
Tyr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂;
His-D-Mrp-Ala-TrpNH₂;
D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH₂;
в которых Mrp представляет 2-метилтриптофан, a INIP, IMA и GAB представлены выше.

Описывается новый пептид, имеющий формулу (I) AD-Mrp-(Al)_n-B-С, где A-D-Thr-His, имидазолацетил, изонипетотил, 4-аминобутирил, D -относится к дестроизомеру, Мrр представляет собой 2-(С₁-С₃-алкил)триптофан, n - 0 или 1, B-D-Trp, D-β-Nal, C-NH₂, pheLysNH₂, H аддитивные соли фармацевтически приемлемых органических или неорганических кислот. Пептид включает в себя аминокислоту D-2-алкилтриптофан, которая обладает способностью высвобождать соматропный гормон роста. 3 c. и 6 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Пептид, имеющий формулу I
A-D-Mrp-(Ala)_n-B-С,
А - D - Thr - Нis, имидазолацетил, изонипекотил, 4-аминобутирил;
D - относится к декстроизомеру;
Mrp представляет собой 2-(С₁-С₃-алкил)триптофан;
n - 0 или 1;
В является D-Trp, D-β-Nal;
С представляет собой NН₂, Рhe Lys NН₂,
и их аддитивные соли фармацевтически приемлемых органических или неорганических кислот. 2. Пептид по п. 1, в котором Mrp выбирают из 2-метилтриптофана, 2-этилтриптофана, 2-пропилтриптофана, 2-изопропилтриптофана. 3. Пептид по п.1, в котором Mrp представляет 2-метилтриптофан. 4. Пептид по п.1, в котором А представляет имидазолацетил, изонипекотил, 4-аминобутирил. 5. Пептид по п.1, выбранный из группы, включающей
имидазолацетил-D-Mrp-D-Trp-Рhe-Lys-NН₂,
имидазолацетил-D-Mrp-D-β-Nal-Рhe-Lys-NН₂,
изонипекотил-D-Mrp-D-Trp-Рhe-Lys-NН₂,
изонипекотил-D-Mrp-D-β-Nal-Рhe-Lys-NН₂,
4-аминобутирил-D-Mrp-D-Trp-Рhe-Lys-NН₂,
4-аминобутирил-D-Mrp-D-β-Nal-Рhe-Lys-NН₂,
4-аминобутирил-D-Mrp-D-β-Nal-NН₂. 6. Пептид по п.4, в котором Mrp представляет 2-метилтриптофан. 7. Пептиды общей формулы I по п.1, обладающие способностью стимулировать высвобождение гормона роста у животных. 8. Фармацевтическая композиция, проявляющая активность в отношении стимулирования высвобождения гормона роста у животных, включающая в качестве активного ингредиента пептид по пп.1 - 5 в эффективном количестве, причем этот пептид может необязательно находиться в смеси с носителями или наполнителями. 9. Композиция по п.8 в форме парентерального, интраназального, орального введения с контролируемым высвобождением для подкожного имплантирования.

Приоритет по пунктам:
27.09.94 - по п. 1: А - имидазолацетил, изонипекотил, 4-аминобутирил, D-Thr Нis; n = 0; В = D-Trp, D-β-Nal; п.5;
16.06.95 - по п. 1: n = 1, С = NН₂, Рhe-Lys-NН₂; пп.2 и 3; п.4: А - имидазолацетил; пп.7 и 8.