СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНГИБИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В МОЛОКЕ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/04 

Изобретение относится к молочной промышленности, а именно к контролю качества заготавливаемого молока.

Известен способ определения ингибирующих веществ в молоке по ГОСТу 23454 79, предусматривающий использование в качестве тест-культуры микроорганизмов Str. thermophilus, культивируемых на жидкой питательной среде обезжиренном молоке. В промышленных условиях тест-культуру готовят из сухих лиофилизированных штаммов путем двух последовательных перевивок, получая вначале лабораторную, а затем из нее рабочую тест-культуру. При использовании такой тест-культуры в производственных условиях необходимы многократные перевивки ее на молоке с целью активизации штаммов в процессе хранения.

При проведении анализа суточную (16 18 часовую) тест-культуру в количестве 0,3 см³ вносят в анализируемое молоко и инкубируют при 42^oC в течение 2-х часов, после чего вносят индикатор (раствор резазурина) м выдерживают при 42^oC еще 15 мин. По изменению окраски индикатора судят о наличии ингибирующих веществ в молоке.

Данный метод предусматривает определение в анализируемом молоке пенициллина, формалина и перекиси водорода. Недостатки указанного способа следующие. При частых перевивках тест-культуры в заводских лабораториях она подвергается риску загрязнения бактериофагом или другими видами микроорганизмов, в результате чего теряет свою активность и не может быть использована для проведения анализа. Применение жидкой культуры тест-организма делает неприемлемым анализ в условиях низкой молокоприемной сети, так как для поддержания в активном состоянии штаммов требуется квалифицированный лаборант и соответствующее оборудование. Кроме того, продолжительность анализа в целом составляет около 3-х часов, в связи с чем он выполняется не чаще одного раза в 10 дней. Чувствительность этого метода определена по пенициллину, хотя в последнее время для лечения лактирующих коров наряду с пенициллином широко используют антибиотики более широкого спектра действия (группы стрептомицина, тетрациклина, левомицитина и др.). Известен также метод обнаружения антибиотиков в молоке, предусматривающий в качестве тест-культуры использование штаммов Str. thermophilus совместно с Z. bulgaricum, которые также, как и в предыдущем способе, перевиваются и хранятся в лаборатории на молоке /Авторское свидетельство НРБ N13833, кл. G 01 N33/04, публ. 1976 г./.

Для приготовления такой тест-культуры стрептококки и палочки смешивают в соотношении 1: 3, затем соединяют 1 часть смеси с 1-частью стерильного обезжиренного молока или воды. 1 см³ подготовленной тест-культуры вносят в исследуемое молоко, инкубируют 40 минут и вносят индикатор. Через 3 5 10 минут фиксируют изменение окраски индикатора и делают заключение о наличии ингибирующих веществ в анализируемом молоке. Описываемый способ предусматривает определение в заготавливаемом молоке пенициллина, стрептомицина, биомицина и тетрациклина.

Основным недостатком данного способа остается, как и в предыдущем, перевивка и хранение тест-культуры на молоке в заводской лаборатории, а также невозможность использования жидкой тест-культуры в низовой молокоприемной сети. Кроме того, данный способ предусматривает перевивку двух культур, а также их последующую дозировку, что усложняет проведение анализа. Хотя продолжительность анализа составляет около часа, подготовка к его проведению (перевивка культур, их дозировка, смешивание) является не только трудоемкой, но и длительной операцией.

Известен способ определения ингибирующих веществ в молоке методом Дельвотест, являющийся прототипом настоящего изобретения /Е. Черна, Б.Пичманова. "Определение присутствия в молоке антибиотиков методом Дельвотест". Prumysl. potravim 1976,27, N4, с. 220.44-221.45/. Он предусматривает использование в качестве тест-культуры споровой формы штамма B. stearothermophilus var calidolactis, которая содержится в определенной питательной среде с индикатором. В эту среду вносят дополнительный питательный компонент в виде таблетки, а также исследуемую пробу молока. Полученная смесь погружается в специальную водяную баню (микротермостат) при температуре 63 - 66^oC. Через 2,5 3 часа проводят оценку результатов по изменению цвета индикатора.

Данное решение имеет ряд недостатков. Использование в качестве тест-культуры спорообразующих микроорганизмов создает опасность загрязнения ими молокоперерабатывающих предприятий и требует для проведения анализов квалифицированных специалистов.

Данный способ обладает высокой чувствительностью и точностью, однако он невоспроизводим в условиях отечественных заводских лабораторий, поскольку требует специального оборудования и приспособления для постановки пробы. Кроме того, время проведения анализа длительное, что не позволяет оценить поступившее на предприятие молоко до его переработки.

Целью данного изобретения является разработка способа определения ингибирующих веществ в молоке, обеспечивающего сокращение продолжительности анализа, снижение его трудоемкости, повышение чувствительности и точности пробы.

Поставленная цель достигается использованием сухого бактериального препарата термофильного молочнокислого стрептококка штамма В19 (тест-культура), обладающего высокой чувствительностью к ингибирующим веществам, применение которого не требует перевивок тест-культуры на предприятиях молочной промышленности.

Известно, что молоко, содержащее ингибирующие вещества, непригодно для производства из него кисломолочных продуктов и представляет опасность для здоровья потребителей. По результатам исследований, проведенных ранее во ВНИИМС, установлено, что молоко с ингибирующими веществами всегда являлось несыропригодным. Применение молока, содержащего в своем составе ингибиторы, из-за подавления роста молочнокислой микрофлоры приводит к сильному размножению грамотрицательных бактерий и, в конечном счете, выработке нестандартных ферментированных молочных продуктов. Из ингибиторов, присутствующих в заготавливаемом молоке, особое значение придают антибиотикам. Наряду с отмеченными производственными трудностями, связанными с попаданием антибиотиков в молоко, могут возникать также и нежелательные последствия для здоровья потребителей: возможность возникновения аллергии к антибиотикам, появление резистентных к антибиотикам условно-патогенных штаммов или патогенных микроорганизмов, развитие дисбактериозов.

Поэтому очень важно разработать более быстрый способ определения ингибирующих веществ в закупаемом молоке, позволяющий оценить пригодность сырья по этому показателю до его переработки на молочном заводе.

В предлагаемом способе сокращение времени поведения анализа достигается за счет использования сухого бактериального концентрата термофильного стрептококка штамма Str. thermophilus В19, полученного путем селекции и обладающего повышенной энергией роста, способностью накапливать редуцирующие вещества за более короткий промежуток времени (табл.1), а также высокой чувствительностью к ингибирующим веществам (табл.2). Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика" под номером ВКПМ В-5626.

Предлагаемый способ с использованием тест-культуры сухого бактериального концентрата термофильного стрептококка штамма В19 обладает большей чувствительностью к антибиотикам по сравнению с сухой закваской ВНИКМИ, используемой в настоящее время для определения ингибирующих веществ и тест-культурой на питательной среде, взятой за прототип. Особенно это видно по стрептомицину, где чувствительность сухого концентрата термофильного стрептококка составила 2,5 мкг/см³ молока, а чувствительность тест-культуры на питательной среде (прототип) даже при концентрации 10 мкг/см³ была сомнительной. Концентрация антибиотиков, определяемая предлагаемым способом, составляет не менее: пенициллина 0,005 ЕД/см³, стрептомицина 2,5 мгк/см³, тетрациклина 0,1 мкг/см³ и левомицетина 2,5 мгк/см³. Характеристика штамма В19 приведена в таблице 3.

В зависимости от активности сухого концентрата термофильного стрептококка количество его в 1 порции, необходимой для постановки пробы, колеблется от 500 до 1000 млн КОЕ.

Для проведения пробы сухой концентрат термофильного стрептококка разводят стерильной или кипяченной дистиллированной водой и 0,3 см³ взвеси вносят в исследуемое молоко. Затем исследуемое молоко с тест-культурой выдерживают в водяной бане или термостате при температуре, благоприятной для интенсивного развития тест-культуры без потери ее чувствительности. В предлагаемом способе эта температура составляет 45 48^oC с выдержкой при этой температуре в течение 50 75 мин (табл. 4).

После инкубации в пробирки с исследуемым молоком и тест-культурой вносят индикатор (резазурин) и при той же температуре определяют окраску индикатора, по которой и оценивают результат.

При отсутствии в анализируемом молоке ингибирующих веществ или их концентрации в 1 см³ молока менее 0,005 МЕ пенициллина, 2,5 мкг стрептомицина, 0,1 см³ молока менее 0,005 МЕ пенициллина, 2,5 мкг стрептомицина, 0,1 мкг тетрациклина и 2,5 мкг левомицетина цвет индикатора изменяется от сине-стального до розового или белого. Если цвет индикатора не изменился и остался сине-стальным или сине-фиолетовым, проба анализируемого молока содержит ингибирующие вещества. Примеры осуществления предлагаемого способа.

Пример 1.

1 порция сухого бактериального концентрата, содержащего 500 млн КОЕ тест-культуры термофильного стрептококка штамм В19 разводят стерильной дистиллированной водой, 0,3 см³ взвеси вносят в 10 см³ исследуемого пастеризованного молока и выдерживают в водяной бане при температуре 45^oC в течение 50 мин. Затем добавляют 1 см³ индикатора (резазурина) и через 10 мин выдержки при этой же температуре по цвету индикатора оценивают результат. Если цвет индикатора изменился с сине-стального на розовый или белый, то проба молока не содержит ингибирующих веществ или содержит их в концентрациях менее 0,005 МЕ пенициллина; 2,5 мкг стрептомицина, 0,1 мкг тетрациклина и 2,5 мкг левомицетина в 1 см³ молока. Проба, имеющая сине-стальную или сине-фиолетовую окраску (не изменившийся цвет индикатора), содержит ингибирующие вещества.

Пример 2.

Порцию сухого бактериального концентрата, содержащего 1000 млн КОЕ тест-культуры термофильного стрептококка В19 разводят кипяченой дистиллированной водой. 0,3 см³ взвеси вносят в 10 см³ анализируемого пастеризованного молока и выдерживают в термостате при температуре 46^oC в течение 75 мин. Затем добавляют 1 см³ резазурина и через 10 мин выдержки при этой температуре оценивают результат. Оценку результата проводят аналогично описанному в примере 1.

Пример 3.

Порцию сухого бакконцентрата, содержащего 750 млн КОЕ тест-культуры термофильного стрептококка В19 разводят стерильной или кипяченой дистиллированной водой. 0,3 см³ взвеси вносят в 10 см³ анализируемого пастеризованного молока и выдерживают в водяной бане при температуре 48^oC в течение 60 мин. Затем добавляют 1 см³ индикатора и через 10 мин выдержки при этой же температуре оценивают результат. Оценку результата проводят аналогично примеру 1. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4

Назначение: молочная промышленность, а именно контроль качества изготавливаемого молока. Сущность: в исследуемую пробу молока вносят в качестве тест-культуры бактериальный концентрат специально подобранного штамма Streptococcus tnermophilus В-19 в виде водной взвеси, приготовленной из сухого препарата, из расчета 0,3 см<M^>3<D> взвеси на 10 см<M^>3<D> исследуемого молока, а оценку результатов проводят по изменению окраски индикатора через 50 - 75 мин. инкубации анализируемого образца при 45 - 48<198>C. Для приготовления водной взвеси тест-культуры сублимированный концентрат ее вносят в стерильную или прокипяченную дистиллированную воду из расчета 500 - 1000 млн колонн образующих единиц на 1 см<M^>3<D> воды. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ определения ингибирующих веществ в молоке, предусматривающий приготовление и внесение тест-культуры термофильной бактерии в анализируемый образец молока, инкубирование полученной смеси и оценку результатов по изменению цвета индикатора, отличающийся тем, что в качестве тест-культуры используют бактериальный концентрат термофильного стрептококка Streptococcus thermophilus ВКПМ R-5626 в виде водной взвеси, причем внесение последней в анализируемый образец молока осуществляют при поддержании соотношения компонентов в смеси 0,3:10.0, а инкубирование полученной смеси ведут при 45 - 48°С в течение 50 75 мин. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для приготовления водной взвеси тест-культуры сублимированный концентрат последней вносят в стерильную или кипяченую дистиллированную воду из расчета 500 1000 млн. колоний образующих единиц на 1 см³. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что оценку результатов исследования осуществляют по изменению цвета индикатора, вводимого в смесь анализируемого образца молока с тест-культурой термофильной бактерии после ее инкубирования с последующей выдержкой в течение 10 мин.