СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В СИСТЕМЕ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/52 G01N33/557 

Изобретение относится к области клинической медицины, экспериментальной и клинической иммунологии и общей патологии и может быть использовано для ранней диагностики иммунодефицитных и геперергических состояний, для мониторинга функциональной активности иммуноокомпетентных клеток (ИКК) при иммунокоррекции, при испытании фармакологических препаратов и в оценке эффективности интенсивной терапии.

Известны хемилюминесцентные способы оценки функциональной активности выделенных из цельной крови ИКК по времени достижения максимума (Т_мах) хемилюминесцентной реакции (ХЛР), оценке степени повреждения мембран эритроцитов по светосумме (S), по количеству импульсов света на пике ХЛР (I_мах) и пересчету их на одну клетку. Оценка ХЛР в данных работах является неточной и неинформативной, так как при оценке ХЛР по Т_мах и I_мах при равных значениях в исследуемых двух пробах величин Т_мах возможны различия в величинах пика и светосуммы ХЛР, а при оценке ХЛР по S или по I_мах при равных значениях S или I_мах возможна разная кинетика ХЛР.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является микрометод оценки функциональной активности ИКК в цельной крови по величине амплитуды и расчетом числа импульсов амплитуды на одну фагоцитировавшую клетку. При этом забирают кровь из пальца в гепаринизированный капилляр и смешивают с неокрашенным раствором Хэнкса в пластиковых пробирках "Эппендорф", в другие пластиковые пробирки типа "Эппендорф" вносят люминол и опсонизированный зимозан, а затем вносят разведенную кровь, после чего пробирки помещают в сцинциляционный счетчик для замера I_мах. Затем по окончании измерений пробирки с клетками встряхивают, забирают 100 мкл суспензии и смешивают ее с равным объемом 0,25% раствора генцианвиолета в 3% уксусной кислоте, инкубируют при комнатной температуре 15 мин и далее в камере Горяева просчитывают число клеток, захвативших зимозан. После этого производят пересчет числа импульсов (I_мах) ХЛР на количество фагоцитировавших клеток. Способ отличается трудоемкостью, обусловленной необходимостью определения числа фагоцитирующих клеток и приготовления реактивов для их определения, которое используется для пересчета количества импульсов на одну клетку. Этот трудоемкий процесс не повышает точности и информативности диагностики функциональной активности ИКК крови, так как при низком их содержании в крови, несмотря на высокую или нормальную их индивидуальную активность, общая функциональная активность ИКК в крови будет снижена и, наоборот, при высоком содержании ИКК в крови на фоне низкой их удельной активности общая функциональная активность ИКК может быть нормальной. И одним из основных недостатков прототипа является то, что не учитывается кинетика ХЛР, имеющая важное диагностическое значение.

Целью изобретения является повышение точности, информативности, а также упрощение способа.

Для этого наряду с измерением показателя общей активности процесса хемилюминесценции (светосуммы S) предлагается впервые измерить интегральный кинетический параметр Т_c (время, за которое реализуется 50% ХЛР), характеризующий усиление или снижение скорости ХЛР, что дает представления об активности состояния окислительно-восстановительных систем ИКК, играющих важную роль в их кислородном метаболизме.

Сущность способа заключается в том, что в пробу цельной крови добавляют хемилюминесцентный зонд и индуктор ХЛР, измеряют параметры S и Т_c. Затем вычисляют критерий Е, показывающий процент отклонения хемилюминограммы больного с вычислением знака "выше", "ниже", "левого" или "правого" сдвигов относительно нормы. За норму принимают среднестатическое значение параметров S и Т_c (±σ)) хемилюминограммы группы практически здоровых детей или взрослых. Диагностическое значение имеют отклонения Е выше 35% - гиперергическая реакция, или ниже иммунодефицитное состояние с указанием левого или правого сдвигов.

Способ поясняется фиг.1 4.

Оценочный показатель (Е) определяет в относительных единицах (%) степень отличия одной хемилюминесцентной кривой (ХЛК), например, ХЛК1-норма, от другой ХЛК2-больного. Это отличие можно увидеть, если каждую ХЛК представить на плоскости в виде одной точки в системе S, Т_c координат (фиг.1).

По оси S откладывается площадь данной ХЛК1, измеряемая в импульсах/с, а на оси Т_c ее время прохождения 50% хемилюминесцентной реакции (ХЛР) - значение ее Тс1, измеряемое в мин. Аналогично построены точки ХЛК2 и ХЛК3 (т.е. ХЛК больного-1 и ХЛК больного-2).

В общем случае точки в координатном пространстве S, Тс разных ХЛК не совпадают, поэтому появляется новая характеристика "расстояние" между двумя ХЛК, соединяющее 2 точки (2 ХЛК) ХЛК1 (норма) и ХЛК2 (больной 1) или ХЛК1 и ХЛК3 (больной 2). В координатах (Тс, S) расстояние между двумя точками определяют как:

Если в координатах (Тс, S) есть точка "норма", то величина расстояния от точки "норма" (ХЛК1) до любой другой кривой (ХЛК2) характеризует степень несовпадения с нормой. Используя нормирование R2Δ

Однако для увеличения точности и информативности оценки отличий ХЛК больных от ХЛК "норма" рассчитывают кинематические знаки "выше" или "ниже" нормы расположения ХЛК больных в системе координат S, Тс, а так же "левый" и "правый" сдвиги, характеризующие "слева" или "справа" от Тс "норма" расположены ТС ХЛК больных в системе Тс, S координат, что будет характеризовать различия по скорости ХЛР, обеспечиваемой в "норме" динамическим равновесием окислительно-восстановительных систем в мембране иммунокомпетентных клеток (ИКК). Отсюда знак "выше" (^) или "ниже" (v) рассчитывается как разность (S больного S нормы) и при положительном его значении и значении разности, превышающей S_норма + σ различие расценивают как "выше" верхней границы нормы, а при отрицательном при значении разности ниже S_норма s расценивают как различие ниже нижней границы нормы.

Аналогично рассчитывают знак по Тс "слева": если при (Тc больного Тс нормы) знак положительный и при этом значения разности превышают Тс норма + s, то различия расценивают как снижение скорости ХЛР ниже нижней границы нормы, а при отрицательном значении знака разности и значении ее меньше, чем Тс норма s, результат расценивают как "левый сдвиг", свидетельствующий об увеличении скорости ХЛР выше верхней границы нормы. В обоих случаях указывающий на грубые нарушения в динамически равновесном состоянии окислительно-восстановительных систем мембраны ИКК с преобладанием активности одной из них.

Таким образом, впервые дается наиболее информативный и точный показатель оценки различий между двумя ХЛК с учетом кинетических характеристик ХЛР.

Способ осуществляется следующим образом. Смоченным гепарином наконечником автоматической пипетки забирают кровь из пальца (микрометод) и вносят в пробирку из пластика типа "Эппендорф" c неокрашенным раствором Хэнкса (кровь разводится в 10 раз), затем в сканируемую полистереновую кювету "Klinicon", добавляют 200 мкл хемилюминесцентного зонда (люминол "Sigma" в концентрации 2,2 х 10^-4М), 100 мкл разведенной в 10 раз средой Хэнкса крови и 50 мкл индуктора ХЛР (опсонизированных свежей сывороткой крови от 10 доноров частиц латекса НИИСК, С-Петербург, размером 2,4 мкм в концентрации 5 х 10⁸част/мл).

Для записи ХЛР использован 36-канальный автоматизированный и компьютеризированный анализатор хемилюминесценции, работающий в режиме счета квантов, с термостатированием и перемешиванием проб (Институт биофизи СО РАН). Время записи кинетики ХЛР составляет 90 мин. Для диагностики функциональной активности ИКК больного вычисляют параметры хемилюминограммы и Т_c (cоответственно светосумма ХЛР и время реализации 50% ХЛР), затем по формуле вычисляют критерий Е:

c определением направленности и скорости ХЛР. Для этого проводят операции по определению знака "выше" ↑ и "ниже"- < нормы по формуле:
S₁ SGN (S больного S нормы),
где: S₁ SGN (-а) 1 (ниже нормы) и
S₁ SGN (+a) + 1 (выше нормы)
и правый или левый сдвиги по формуле:
T_c1 SGN (T_c больного Т_c нормы),
где Т_c1 SGN (-а) 1 (левый сдвиг) и
T_c1 SGN (+a) + 1 (правый сдвиг),
где SGN операция определения знака.

Предварительно вычисляют среднестатические параметры кривой ХЛР для нормы (S и T_c) ± σ, представляющей группу практически здоровых детей или взрослых. Величина Е для больного выражается в отклонения от нормы с указанием знаков "выше ниже" (↑, <) и левый и правый сдвиги (J, L), характеризующие скорость ХЛР, регулируемую про- и антиоксадантными системами ИКК. В нашем случае экспериментально установлено, что если Е превышает 35% то параметры анализируемой кривой хемилюминесценции отличаются от среднестатистических параметров нормы в сторону увеличения (гиперергическая реакция) или снижения (иммунодефицитное состояние) на величину, превышающую среднеквадратичное отклонение от нормы ((±σ)), что имеет диагностическое значение.

На фиг. 1, 2, 3 приводятся примеры, в которых показаны результаты исследования функциональной активности ИКК крови больных: Х. С. М. У больного Х. функциональная активность ИКК выше ↑ нормы (гиперергическая реакция) на 53,7% с левым сдвигом (J), свидетельствующим об ускорении генерации активных форм кислорода (АФК) и соответственно ХЛР, связанных с нарушением в соотношении про- и антиоксидантных систем. У больного С. функциональная активность ИКК ниже < нормы на 45,9% (вторичная иммунная недостаточность) с левым сдвигом (J)- свидетельствующим также о нарушении в про- и антиоксидантных системах с усилением скорости генерации АФК (у детей с хроническим грануломатозом, с генетически детерминированным дефектом НАДФН оксидазной активности эффект генерации АФК и ХЛР полностью отсутствует). У больного М. функциональная активность ИКК выше нормы на 77,4% с правым сдвигом (L), что свидетельствует о высоком уровне генерации АФК с замедленным развитием ХЛР, свидетельствующем о нарушении преимущественно в антиоксидантной системе, не способной в данном случае к гашению ХЛР.

Таким образом, предлагаемый способ значительно проще за счет отмены трудоемкой операции по определению числа фагоцитирующих клеток. При этом значительно повышается точность, информативность и объективность диагностики за счет учета кинетических особенностей генерации АФК, позволяющих оценить активность ключевых для жизнедеятельности ИКК ферментных систем, обеспечивающих их кислородный метаболизм: про- и антиоксидантных систем. Последнее позволяет врачу под контролем хе милюминограммы проводить не только мониторинг функциональной активности ИКК, но и мониторинг эффективности назначаемой про- и антиоксидантной терапии, коррегирующей кислородный метаболизм клетки.

Микровариант хемилюминесцентного способа оценки функциональной активности ИКК по интегральному кинетическому параметру ТЛР Т_c- S и критерию Е прост и его легко автоматизировать. Авторами разработан пакет программы компьютерной диагностики "Lograf exe" и анализа кривых функциональной активности ИКК, позволяющих полностью автоматизировать процесс диагностики функциональной активности ИКК.

Использование: медицина, экспериментальная и клиническая иммунология, общая патология и может быть использовано для определения функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Сущность изобретения: в пробу цельной крови добавляют хемилюминесцентный зонд и индуктор хемилюминесцентной реакции (ХЛР). Затем измеряют показатель общей активности процесса хемилюминесценции (светосумму - S) и интегральный кинетический параметр Т _c (время, за которое реализуется 50% хемилюминесцентной реакции), характеризующий усиление или снижение скорости ХЛР. По параметрам S и T _c вычисляют критерий Е, показывающий процент отклонения хемилюминограммы больного с вычислением знаков выше, ниже и левого или правого сдвига относительно нормы. За норму принимают среднестатистическое значение параметров S и T _c (±σ) хемилюминограммы группы практически здоровых детей или взрослых. Экспериментально установлено, что если Е превышает 35%, то параметры анализируемой кривой хемилюминесценции отличаются от среднестатистических параметров нормы в сторону увеличения (гиперергическая реакция) или снижения (иммунодефицитное состояние) на величину, превышающую среднеквадратичное отклонение от нормы (±σ), что имеет диагностическое значение. 4 ил.

Способ оценки функциональной активности иммунокомпетентных клеток (ИКК) в системе цельной крови, включающий отбор пробы крови, регистрацию уровня хемилюминесцентной реакции (ХЛР) в присутствии индуктора и хемилюминесцентного зонда с последующим расчетом оценочного показателя Е, отличающийся тем, что регистрируют светосумму (S) хемилюминесценции как площадь под кривой ХЛР и время, за которое реализуется 50% светосуммы ХЛР (Тс), а оценочный показатель (E), характеризующий степень различий между двумя хемилюминесцентными кривыми (ХЛК) ХЛК больного и ХЛК нормы, составляет расстояние между этими двумя ХЛК, которые можно представить на плоскости в виде 2-х точек в системе S, Тс координат, рассчитываемое как нормированный квадрат расстояния между этими двумя точками к квадрату расстояния от начала координат (Тс, S) до точки ХЛКI (точка нормы) по формуле

где за норму принимают параметры среднестатистической кривой ХЛР: для практически здоровых пациентов, затем рассчитывают дополнительно кинетические характеристики ХЛР в системе S, Тс координат как разности (S больного S нормы) и (Тс больного Тс нормы), по которым при S больного > S нормы + σ судят о превышении активности ХЛР больного выше верхней границы нормы, а при S больного < S нормы s судят о снижении активности ХЛР ниже нижней границы нормы, а при Тс больного < Тс нормы s судят о "левом сдвиге", свидетельствующем об увеличении скорости ХЛР выше верхней границы нормы, а при Тс больного > Тс нормы + s судят о "правом сдвиге", свидетельствующем о снижении скорости ХЛР ниже нижней границы нормы.