СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ АЛЛОФИЛЬНЫХ И КСЕНОФИЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ РЕАКЦИЙ ОТТОРЖЕНИЯ ОРГАНИЗМА РЕЦИПИЕНТА НА ПЕРЕСАЖЕННЫЙ ОРГАН Российский патент 1996 года по МПК A61K31/19 A61K31/16 

Из Европейской патентной заявки 13376 известен 4-трифторметиланилид 5-метилизоксазол-1-карбоновой кислоты (соединение 1), как вещество, обладающее противовоспалительным действием. Там же приведен способ получения этого соединения.

Кроме того известно, что соединение I и его метаболит амид 4-трифторметилфенил-2-циан-3-гидроксикротоновой кислоты (соединение 2) обладает иммуномодулирующими свойствами, в связи с чем они могут применяться для лечения хронических гомологичных болезней ("трансплантат против хозяина), а также автоиммунных заболеваний, в частности систематических проявлений Lupus erythematodes (ЕР-А-217 206).

В патенте США N 4061767 описано применение анилидпроизводных гидроксиэтилиденциануксусной кислоты для получения лекарственных средств, обладающих противовоспалительным и анальгетическим действием.

В США в 1990 году было проведено 15000 операций по пересадке органов. Большей частью это были операции по трансплантации почек, однако в последнее время возрастает количество операций, связанных с пересадкой сердца, кожи, легких, печени и поджелудочной железы. У большого числа пациентов отмечаются при этом реакции отторжения организмом органа, пересаженного от другого человека. В этой связи отмечаются три формы реакции отторжения: сверхострое, острое и хроническое отторжение.

Сверхострое отторжение имеет место в основном вследствие циркулирующих в крови антител, действие которых направлено на ткани пересаженного органа (трансплантат), в результате чего в очень короткие сроки, иногда в считанные минуты может произойти некроз на трансплантате.

При остром отторжении трансплантата реакция отторжения временно задерживается. Наряду с этим возможна хроническая форма реакции отторжения. Трансплантаты, успешно пережившие первый год пересадки, могут отторгаться в ходе последующих лет. Известно также, что зависимость трансплантат-хозяин не ограничиваются одним только отторжением, обусловленным организмом хозяина. В определенных случаях может иметь место исходящая от трансплантата иммунная реакция, направленная против ткани хозяина (см.Европейскую заявку на патент ЕР-А-217206). Поэтому реакции отторжения принято делить на реакции отторжения между трансплантатом и хозяином и между хозяином и трансплантатом.

Далее известно, что реакции отторжения возможны и в том случае, когда проведена пересадка органов от различных по типу организмов, например, от мыши на крысу (Roit u camp. Immunology, Gower Medical Publishing Ltd. 1985).

До сих пор нет никаких сведений о лекарственном препарате, способном обеспечить эффективную защиту от сверхострых реакций отторжения. В клиниках до сих пор проводят испытания "донора" и "реципиента" на совместимость или несовместимость. У 20-40% пациентов возникает случай, что они не могут получить пересаживаемый орган. При этом острые реакции отторжения могут вылечиваться, однако, как было установлено, медикаменты часто обладают побочным действием нефротоксического характера. До сих пор не известны также медикаменты, действие которых было бы направлено на устранение причины хронических реакций отторжения.

В качестве основного патогенного фактора при разрушении органов при трансплантации могут выступать аллофильные и кселофильные антитела (Auchincloss H. Transplantation 46,1, 1988). Эти антитела в основном и определяют отторжение пересаженных органов в пределах одного вида организмов ("алло") или между двумя различными видами ("ксено").

Неожиданно было установлено, что соединение 1 и его метаболит, указанное выше соединение 2, обладают ярко выраженной способностью к сильному ингибированию аллофильных и ксенофильных антител. В результате создаются возможности для эффективного воздействия на сверхострые, острые и хронические реакции отторжения реципиента в отношении трансплантированного органа.

Поэтому изобретение касается применения 4-трифторметил-фенил-анилида 5-метил-изоксазол-4-карбоновой кислоты и амида -(4-трифторметилфенил)-2-циан-3-гидроксикротоновой кислоты и/или ее физиологически переносимых солей для лечения реакций отторжения реципиента по отношению к трансплантированному органу.

Подходящими физиологически переносимыми солями соединения 1 являются, например, соли щелочных, щелочно-земельных металлов и соли аммония, включая физиологически переносимые органические аммониевые основания.

Под термином "органы" следует понимать все органы млекопитающих, в частности, человека, например, почки, сердце, кожу и печень, поджелудочную железу, мышцы, кости, желудок, кишечник, а также кровь и волосы.

Под реакцией отторжения имеются ввиду ответные реакции организма реципиента, которые могут привести к омертвлению или разрушению тканей перенесенного органа или повлиять на его жизнеспособность.

Соединения 1 и 2, согласно изобретению, могут быть получены следующим способом:
Соединение с формулой 1
(I)
где Х атом галогена, например, хлор или бром, вступают во взаимодействие с амином с формулой II
(II)
с последующим преобразованием в присутствии основного средства в соединение 2.

Указанные выше реакции протекают при стандартных условиях по известному методу (ЕР-В-13 376, США 4061767).

Исходные вещества взаимодействия известны и могут быть получены по описанным в литературе методам.

Изобретение касается также лекарственных средств, содержащих эффективные количества соединения 1 или соединения 2 и/или их физиологически совместимых солей, наряду с обычными фармацевтическими добавками, веществами-носителями, разбавителями и/или другими вспомогательными средствами.

Изобретение касается также способа получения лекарственного препарата для лечения реакций отторжения реципиента на пересаженный орган, который отличается тем, что соединение 1 или 2 и/или физиологически переносимую соль соединения 2 доводят с подходящим физиологически приемлемым носителем и в случае необходимости с другими вспомогательными веществами, добавками и действующими веществами до подходящей лекарственной формы.

Лекарственные средства, согласно изобретению, могут применяться орально, локально, ректально, внутривенно или парентерально. Применение осуществляют до, во время и после трансплантации органа реципиентом или донором.

Подходящими твердыми или жидкими галеновыми формами могут являться, например, гранулы, порошки, драже, таблетки (микро)капсулы, свечи, сиропы, соки, суспензии, эмульсии, капли или растворы для инъекций, а также препараты с протрафированным выделением активного вещества, при получении которых могут быть использованы обычные фармацевтические добавки, такие как вещества-носители, связывающие, обволакивающие, разбухающие, смазывающие средства, а также вкусовые вещества, подслащивающие средства или стимуляторы растворения. Наиболее часто применяемые вспомогательные вещества это, например, карбонат магния, двуокись титана, лактоза, маннит или другие сахара, тальк, молочный белок, желатин, крахмал, целлюлоза и ее производные, животные и растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители, такие как стерильная вода или одно- или многоатомные спирты, например, глицерин.

Предпочтительно получать и применять препараты в унифицированных дозировочных формах, причем каждая из этих форм должна содержать в качестве активного компонента определенную дозу соединения 2 или 1 и/или физиологически совместимую соль соединения 2. В твердых лекарственных формах, например, в таблетках, капсулах или свечах эта доза может составлять до 300 мг, предпочтительно от 10 до 200 мг.

Для лечения пациента, которому пересажен орган (70 кг) в ранних фазах пересадки проводится внутривенное вливание в количестве максимум 1200 мг в день, а на более поздних стадиях реабилитации оральное введение 3 раза по 300 мг соединения 1 или 2 и/или соответствующей соли соединения 2.

Однако при определенных обстоятельствах может появиться необходимость в введении более высоких и более низких доз. Доза может применяться за один раз в виде единой лекарственной формы, а может быть разделена на множество мелких лекарственных единиц и приниматься многократно через определенные интервалы.

И, наконец, соединения 1 или 2 и/или его соответствующая соль при производстве указанных выше лекарственных форм может комбинироваться с другими активными веществами, например, средствами, применяемыми при лечении заболеваний органов мочеиспускания, ингибиторами агрегации тромбоцитов, анальгетиками и стероидными и нестероидными противовоспалительными средствами.

Дальнейшие примеры выполнены поясняют изобретения, не ограничивая его.

Пример 1. Фармакологические испытания и полученные результаты.

Крыс в возрасте 2-3 месяцев сенсибилизировали 2 10⁷ внутрибрюшинно лимфоцитами крови человека. За 4 дня до сенсибилизации начинали внутрибрюшинные введения соединения 2, которые заканчивали через 10 дней после сенсибилизации крыс. Из копчиковой вены отбирали пробы сыворотки и хранили их при температуре -881^oC. Благодаря тепловой активации избегают комплементной функции.

Ксенофильные антитела естественного происхождения (пХА) к ксенофильные антитела, индуцированные сенсибилизацией (сХА), титруют и к ним добавляют "живые" периферийные лимфоциты крови человека (45 мин. при 20). После интенсивного промывания добавляют маркированные FITC-антитела log g или lg M и определяют количественное связывание сХА и пХА методом проточной цитометрии (FACS can Бектон Дикинсон).

А) Несенсибилизированные крысы.

Самцы крыс (LEW) содержат в сыворотке своей крови пХА связанные витальные лимфоциты крови человека. С помощью среднего М-титра были установлены следующие значения: lgM титр менее 1:1 и lgM-титр соответственно 1:4.

Крысы (n=8), ежедневно обрабатываемые 10 мг/кг соединения 2, на 11 день показывают 30%-ное уменьшение lg g -титра и 50%-ное уменьшение lgM.

Б) Сенсибилизированные крысы.

Для сенсибилизированных крыс были установлены значительно более высокие значения SXA. lg g -титр показал 1:1024-1,16384 и lg M -титр соответственно 1: 4-1:256. Значения lg g -титра в течение 50 дней оставались неизменными, в то время как lg M -титр через 10 дней показал медленное снижение указанной характеристики.

Сенсибилизированные крысы (n=5) обрабатывались 3-10 мг/кг соединения 2. На 11 день были получены значения для сХА-титра (см.табл.1).

Действие соединения 2 на связывание аллофильных антител.

Самцы крыс Браун-Норвей весом от 200 до 250 г использовались в качестве доноров сердца. Их сердца трансплантировались самцам крыс Льюиса аналогичного веса. Для всех крыс поддерживалась стандартная диета и водный режим. Крысы выдерживались в условиях света и темноты в течение 12 часов.

У крыс-реципиентов (крысы Льюиса) в день трансплантации сердца и затем через 4 дня отбирали из копчиковой вены по 2 мл крови. Определяли титр аллофильных антител в крови крыс-реципиентов, инкубируя различные варианты разбавленной крови реципиента с клетками селезенки крыс-доноров (крысы Браун-Норвей) и комплементом кролика. Определяли и цитотоксичность по методу выталкивания "трипан-голубой" (трипановая синька). Используя стандартной Т-метод, определяли значение рН для антител, сравнивая его с соответствующим значением для необработанной контрольной группы животных.

Обработку соединением 2 начинали на 4-ый день после трансплантации. Вводят по 10 мг/кг соединения 2 один раз в день внутрибрюшинно. Одновременно обрабатывают 5 животных. Обработка заканчивалась на 17-ый день. Приведенная ниже таблица 2 отражает средние значения цитотоксичности (%) в процессе обработки.

Пример 2
Получение 4-трифторметил-анилида-5-изоксазол-4-карбоновой кислоты (соединение 1)

Раствор 0,05 молей хлорида 5-метилизоксазол-4-карбоновой кислоты (7,3 г) в 20 мл ацетонитрила при комнатной температуре добавляют по каплям в раствор 0,1 моля 4-трифторметиланилина (16,1 г) в 150 мл ацетонитрила. После перемешивания в течение 20 минут отсасывают выпавший в осадок 4-трифторметиланилин-гидрохлорид, дважды промывают каждый раз 20 мл ацетонитрила и объединенный фильтрат концентрируют под пониженным давлением. Получают 12,8 г белого кристаллического продукта, представляющего собой 4-(трифторметил)анилид 5-метилизоксазол-4-карбоновой кислоты (соединение 1).

Пример 3
Получение амида N-(4-трифторметилфенил)-2-циано-3-гидроксикротоновой кислоты (соединение 2):

0,1 моль 4-трифторметил-анилида 5-метилизоксазол-4-карбоновой кислоты растворяют в 100 мл метанола и при +10^oC разбавляют раствором 0,11 ммолей (4,4 г) едкого натра в 100 мл воды. Перемешивают в течение 30 минут и после разбавления водой подкисляют концентрированной соляной кислотой. Выпавшую в осадок кристаллическую массу отсасывают и высушивают на воздухе. Выход составляет 24,4 г амида N-(4-трифторметилфенил)-2-циан-3-гидроксикротоновой кислоты (соединение 2). Т.пл. из метанола 205-206^oC.

Пример 4
Острая токсичность после внутрибрюшинного введения.

Определения острой токсичности после внутрибрюшинного введения исследуемого вещества проводили на мышах (20-25 г) и крысах (120-195^oC). Исследуемое вещество суспендировали в 1%-ный раствор натрий-карбоксиметилцеллюлозы. Вводили различные дозировки исследуемого вещества мышам в количестве 10 мл/кг веса тела, крысам соответственно в количестве 5 мл/кг. На каждую дозировку брали соответственно по 10 животных. Через 3 недели определяли острую токсичность по методу Литчфилда и Вилкоксона. Результаты представлены в таблице 3. ТТТ1

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантологии. Предлагается применение 4-трифторметиланилида 5-метил-изоксазол-1-карбоновой кислоты и амида N-(4-трифторметил-фенил)-2-циано-3-гидроксикротоновой кислоты в качестве средств для ингибирования образования аллофильных и ксенофильных антител для уменьшения реакций отторжения организма реципиента на пересаженный орган. 3 табл.

Применение 4-трифторметиланилида 5-метил-изоксазол-1-карбоновой кислоты или амида N-(4-трифторметил-фенил)-2-циано-3-гидроксикротоновой кислоты в качестве средства для ингибирования образования аллофильных и ксенофильных антител для уменьшения реакций отторжения организма реципиента на пересаженный орган.