СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСНОГО АНТИГЕНА В ФЕКАЛИЯХ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицинской вирусологии, в частности к диагностике вирусной инфекции человека. Известен способ диагностики вирусной инфекции иммуноферментным методом, в котором для выявления вирусов человека используют антитела, специфические к вирусам животных, основываясь на их групповой специфичности [1]
Однако способ ограничивает возможности выявления вирусов из-за узкого спектра иммуноглобулинов (ограниченных групповой специфичностью), полученных против вирусов животных. Кроме того, чувствительность иммуноферментного анализа (ИФА) ограничена за счет стерических препятствий взаимодействия антител с антигенами, расположенными во внутреннем капсиде вириона, а также количеством участвующих в реакции молекул антигена.

Целью изобретения является повышение чувствительности выявления вирусного антигена в клиническом материале. Указанная цель достигается тем, что вируссодержащий экстракт подвергают озвучиванию в присутствии катионного детергента, а затем определяют вирусный антиген иммуноферментным методом, причем в качестве сорбированных на твердой фазе антител используют иммуноглобулины, специфичные к антигенам вирусов человека.

Способ осуществляется следующим образом. На первом этапе специфические противовирусные иммуноглобулины человека с титром 1:1280 и выше, определенным в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в концентрации 20 мкг/мл на 0,01 М бикарбонат-карбонатном буфере pН 9,6, сорбируют на полистироловых планшетах в течение 18 ч при 4^oС или при 37^oC. Для чего в лунки планшет вносят соответствующей специфичности иммуноглобулин человека в объеме по 100 мкл (ТУ 42-14-113-77 "Иммуноглобулин человека нормальный"). Серии нормального иммуноглобулина человека, содержащие противовирусные антитела определенной специфичности в высоком титре, отбирают заранее. После каждого этапа внесения и экспозиции ингредиентов планшеты отмывают фосфатным буферным раствором pН 7,2, содержащим 0,1% твин-20 или тритон Х-100.

На втором этапе в лунки полистироловых планшет вносят исследуемый материал в объеме 100 мкл. Клинический материал перед исследованием подготавливают следующим образом: исследуемый материал 1 г фекальных масс интенсивно встряхивают с 4,5-9,0 мл охлажденного до 4^oС раствора Хенкса. Флаконы интенсивно встряхивают 15-20 мин вручную или с использованием аппарата для скоростного встряхивания АВБ-4П. Суспензию осветляют центрифугированием при 3000 об/мин, 15 мин. Осветленную надосадочную жидкость разводят в 10 раз 1% водным раствором катионного детергента (этония или пропония) и озвучивают в течение 15-30 сек в диапазоне частот 22-44 кГц, при охлаждении, после чего исследуют на наличие вирусного антигена иммуноферментным методом. При наличии в исследуемом материале вирусного антигена происходит его связывание с сорбированными на планшете антителами.

На третьем этапе специфический комплекс антиген-антитело (АГ-АТ) проявляется последовательным внесением конъюнгата специфических антител, меченных ферментом (например, пероксидазой хрена), и соответствующей субстратной смеси (перекись водорода и ортофенилендиамин). В положительных пробах развивается окраска, интенсивность которой пропорциональна количеству содержащегося в исследуемом материале вирусного антигена. Учет результатов проводят на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Использование специфических антивирусных иммуноглобулинов человека позволяет повысить чувствительность и выявляемость вирусов и их антигенов в клиническом материале (табл. 1).

Чувствительность метода выявления вирусного антигена также обусловлена формой презентации вирусного антигена к исследованию. Так, наличие в исследуемом материале преимущественно целых вирионов занижает чувствительность ИФА, а при солюбилизации вирусных антигенов ИФА проявляет максимальную чувствительность, что подтверждают данные сравнительного электронно-микроскопического исследования обработанных по данному способу и контрольных проб.

Таким образом, способ позволяет снять ограничения иммуноферментного анализа за счет полного перевода вирусных частиц в их антигенные смеси и расширения спектра специфичностей участвующих в реакции иммуноглобулинов, что повышает выявляемость вирусного антигена в 2-8 раз.

Пример 1. Исследуемый материал 1 г фекальных масс интенсивно встряхивают с 4,5-9,0 мл раствора Хенкса до гомогенного состояния. Суспензию осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15-30 мин. 100 мкл надосадочной жидкости разводят в 10 раз 1% водным раствором катионного детергента этония или пропония и озвучивают в течение 15-30 сек при частоте 22-44 кГц на аппарате УЗДН-2Т при охлаждении. Из полученного материала берут 100 мкл жидкости, в которой определяют антиген ротавируса человека иммуноферментным методом. Для сорбции полистироловых планшет используют коммерческие иммуноглобулины человека с титром соответствующих противовирусных антител 1:1280 и выше по РПГА, в концентрации 20 мкг/мл в объеме 100 мкл/лунку на 0,01 М бикарбонат-карбонатном буфере pН 9,6.

1. Сорбцию осуществляют 18 ч при 4^oС или 3 ч при 37^oC
2. Отмывку планшет производят 0,1 М фосфатным буфером pН 7,2, содержащим 0,1% твин-20 или тритон Х-100, в объеме не менее 150 мкл отмывающего раствора на лунку.

3. После удаления отмывающего раствора в рабочие лунки планшета вносят исследуемый материал и термостатируют планшет при 37^oС 1 час.

4. После экспозиции выполняют п. 2.

5. После отмывки планшета в рабочие лунки вносят конъюгат противовирусных антител, меченных ферментом пероксидазой хрена в рабочем разведении, в объеме 100 мкл. Экспозиция 45 мин при 37^oC.

6. Выполнение п. 2.

7. Внесение субстратной смеси (перекись водорода о-фенилендиамин) по 100 мкл. Экспозиция в затемненном месте при комнатной температуре до развития окраски.

8. Остановка ферментативной реакции внесением в каждую лунку 50 мкл 4 н серной кислоты.

9. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре при 492 нм.

Проведение анализа считается успешным, если среднее значение оптической плотности положительных контролей превышает среднее значение отрицательных контролей не менее чем на 0,3. При этом среднее значение оптической плотности отрицательных контролей не должно превышать 0,25.

Пример 2. Исследуемый фекальный материал обрабатывают, как описано в примере 1. После осветления суспензии и последующего озвучивания супернатанта в среде катионного детергента в нем определяют антиген вируса гепатита А иммуноферментным методом, причем в качестве сорбированных антител используют иммуноглобулины человека, специфичные к вирусу гепатита А. ТТТ1

Использование: медицина, иммунология, для выявления вирусного антигена в фекалиях. Сущность изобретения: метод основан на экстракции вируса из фекального материала, переводом вирусных частиц в антигенную смесь структурных белков вириона с помощью ультразвука в среде катионного детергента и последующим их определением иммуно-ферментным методом, причем в качестве сорбированных на твердой фазе антител используют иммуноглобулины, специфичные к антигенам вирусов человека.

Способ выявления вирусного антигена в фекалиях, включающий экстракцию исследуемого материала с последующим определением вируса иммуноферментным методом с помощью сорбированных на твердой фазе специфических иммуноглобулинов, отличающийся тем, что исследуемый материал перед проведением анализа подвергают ультразвуковой обработке в диапазоне частот 22 24 кГц в течение 15 с в присутствии катионного детергента, а в качестве сорбированных на твердой фазе антител используют иммуноглобулины, специфичные к антигенам вирусов человека.