ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А Российский патент 1996 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к прикладной иммунологии.

Известен иммуноферментный метод обнаружения в нарастающем титре I₉М-анти-ВГА (антител к вирусу гепатита А) в продромальном периоде заболевания и начальной фазе периода разгара (Е.П.Шувалова. Инфекционные болезни. М. 1990,с.154).

Недостатком данного способа является то, что он направлен на выявление антител и не позволяет выявить возбудителя заболевания вирус гепатита А или его антигены.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является иммуноферментный способ определения антигенов аренавирусных инфекций, который основан на принципе меченых антител. В качестве метки используют фермент, например пероксидазу хрена. Результат теста учитывают по степени специфического связывания меченых антител с фиксированным на твердом носителе антигеном. Степень связывания меченых антител определяют по ферментной активности - разрушению ферментного субстрата, дающего окрашенный продукт (Методические рекомендации по применению твердофазных иммуносорбентных методов (энзиммеченного и радиоиммунологического анализа) для лабораторной диагностики аренавирусных инфекций, крымской геморрагической лихорадки и геморрагической лихорадки с почечным синдромом. М. 1982,с. 21 ).

Недостатком данного способа является отсутствие возможности выявить наличие вируса при его дискретном поступлении и малой концентрации, селективно концентрировать вирусы непосредственно из выделений больных или других загрязненных проб и сократить время проведения иммуноферментного анализа (ИФА) с 4 до 1 ч.

Обнаружение патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды связано с большими трудностями. Одним из наиболее специфичных методов концентрации микроорганизмов является применение магносорбентов. Эти препараты и приспособления хорошо зарекомендовали себя при выявлении возбудителя холеры из различных объектов внешней среды. Однако до настоящего времени не разработаны эффективные способы определения вируса инфекционного гепатита А из объектов внешней среды. Применение магнитных сорбентов и других приспособлений поможет разработать эффективные способы мониторинга окружающей среды на наличие возбудителя вирусного гепатита А. Использование гранулированных магнитных сорбентов в качестве твердой фазы при осуществлении иммуноферментного анализа для выявления возбудителя вирусного гепатита А из объектов внешней среды позволит повысить чувствительность анализа, существенно снизить трудоемкость и время проведения анализа, улучшить качественные характеристики определений.

Таким образом, ни использование в качестве твердого носителя магносорбентов, которые сенсибилизированы антигепатитными (А) иммуноглобулинами, ни использование иммунопероксидазного конъюгата на основе иммуноглобулинов к вирусу гепатита А, ни выявление вируса гепатита А иммуноферментным методом с применением магноиммуносорбентов в вирусологии на существующем уровне исследований нам не известны. Исходя из этого можно сделать вывод о том, что изобретение соответствует критерию изобретательского уровня.

Сущность изобретения заключается в том, что выявление вируса гепатита А осуществляют путем проведения ИФА на твердом носителе с использованием пероксидазного конъюгата.

Отличительные признаки заявляемого объекта: иммунологическую реакцию на твердом носителе осуществляют с использованием магносорбентов, которые сенсибилизированы антигепатитными (А) иммуноглобулинами их помещают в исследуемую среду; конструирование же иммунопероксидазного конъюгата проводят на основе иммуноглобулинов к вирусу гепатита А.

Когда поступление вируса дискретное, и малая концентрация не позволяет выявить его известными способами, то возникающая потребность селективно концентрировать вирус достигается при помощи совокупности признаков, включенных в формулу изобретения.

Тест-систему диагностическую осуществляют следующим образом.

1. Получают сыворотки от людей, больных вирусным гепатитом А, с высокими титрами специфических антител.

У больных вирусным гепатитом А в условиях стационара берут кровь из вены в последние дни желтушного периода или в первые дни периода реконвалесценции. Сыворотки, полученные из крови, инактивируют при 56^oС в течение 30 мин. Для определения титров антител используют трехфазный иммуноферментный метод (ТИМФ). Лунки полистиролового микропланшета сенсибилизируют кроличьими античеловеческими иммуноглобулинами G (IgG) в концентрации 10 мкг в 0,1 мл 0,05 М карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) рН 9,5. Инкубируют в течение 18 ч при 4^oС. Несорбированные IgG удаляют, в лунки микропланшета вносят по 0,05 мл 0,5% -ного бычьего сывороточного альбумина (БСА), инкубируют 30 мин при 37^oС. Затем БСА удаляют и вносят исследуемые сыворотки в объеме 0,1 мл, начиная с разведения 1:400, и титруют в 0,1 мл 0,1 М фосфорно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4 до 11-й лунки. Последняя лунка без сыворотки (контроль конъюгата). Для контроля специфичности диагностикума используют сыворотки, полученные от больных бруцеллезом, сальмонеллезом или другими инфекционными заболеваниями, и нормальную сыворотку человека. После внесения сывороток планшет инкубируют в течение 1 ч при 37^oС. Затем содержание лунок удаляют, лунки промывают 0,05%-ным раствором твин-20 в ФСБ. Наличие специфических антител в исследуемых сыворотках определяют с помощью коммерческого диагностикума советско-швейцарской фирмы "Диаплюс": антиген вируса гепатита А (из клеточной культуры), связанный с моноклональными антителами к вирусу гепатита , конъюгированными с пероксидазой хрена. Конъюгат вносят в каждую лунку в объеме 0,05 мл и инкубируют в течение 2 ч при 37^oС. Затем трижды промывают по 3 мин. 0,05% -ным раствором твин-20 в ФСБ и вносят по 0,1 мл субстрат-индикаторного раствора (0,01 М лимонная кислота с 0,2 М Na₂HPO₄ рН 5,0 в присутствии 0,006% -ной перекиси водорода и ортофенилендиамина в концентрации 0,4 мг/мл), инкубируют 15 мин при комнатной температуре (20-22)^oС в темноте. Для остановки реакции вносят 0,05 мл 2 М серной кислоты. В лунках, где присутствуют специфические антитела, раствор приобретает коричневое окрашивание. Контроль конъюгата и контроли специфичности остаются бесцветными. Высокотитражные сыворотки (1:600000-1:800000) используют для выделения специфических иммуноглобулинов.

2. Получение специфических антигепатитных (А) иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины выделяют, используя метод двойного высаливания сернокислым аммонием. Добавляют к сыворотке равный объем дистиллированной воды, затем навеску сернокислого аммония до 40%-ного насыщения раствора добавляют медленно при перемешивании раствора на магнитной мешалке в течение 30 мин. Затем оставляют при 4^oС на 18 ч для стабилизации белка и формирования осадка. Центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до двойного объема исходной сыворотки. Вносят в раствор навеску сернокислого аммония до 40%-ного насыщения, инкубируют 30 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре, а затем 18 ч при 4^oС. Центрифугируют вышеуказанным способом, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до первоначального объема взятой в работу сыворотки.

Полученный раствор иммуноглобулино диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды до исчезновения ионов NH+4

Определяют количество белка спектрофотометрическим способом и активность иммуноглобулинов в ТИМФ. Содержание белка при выделении иммуноглобулинов таким способом составляет 25-30 мг/мл, а активность в ТИМФ 1:600000-1: 800000.

Полученные иммуноглобулины используют для получения иммунопероксидазного конъюгата и гепатитного (А) магноиммуносорбента.

3. Получение иммунопероксидазного гепатитного (А) конъюгата.

Иммуноглобулины гепатитные (А), меченные пероксидазой хрена, получают методом перйодатного окисления пероксидазы хрена.

Для конъюгации иммуноглобулина с ферментом используют пероксидазу хрена тип VI, RZ-3,0 НПО "Биохимреактив" ВНИИ прикладной биохимии (г. Олайне), которую в количестве 5 мг растворяют в 1 мл свежеприготовленного раствора 0,3 М двууглекислого натрия.

Добавление 0,25 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин. Затем добавляют 1 мл 0,04 М перйодата натрия, осторожно перемешивают на магнитной мешалке еще 30 мин. Цвет раствора приобретает зеленовато-желтый оттенок. Вносят в раствор 1 мл 0,16 М этиленгликоля, перемешивают 1 ч. Все перечисленные операции проводят при комнатной температуре. Раствор переносят в диализный мешок, диализуют против 1 л 0,01 М карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) рН 9,5 при 4^oC в течение 18 ч. Раствор переносят во флакон, добавляют иммуноглобулины гепатитные (А) в концентрации 10 мг/мл в 1 мл КББ, перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляют 5 мг боргидрида натрия, оставляют без перемешивания на 2 ч при 4^oС. Затем раствор диализуют против 1 л 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4 в течение 18 ч при 4^oC. Из диализного мешка раствор наносят на заранее приготовленную колонку (1,5 см•90 см) с сефадексом G-100, уравновешенную 0,1 М ФСБ рН 7,4. Элюируют тем же буфером при 4^oС, собирая фракции по 3 мл. Каждую фракцию фотометрируют при длине волн 280 нм и 403 нм. Отношение экстинкций 403 нм/280 нм (RZ) должно быть не менее 0,5 (при этом одна молекула иммуноглобулина связана примерно с одной молекулой пероксидазы). Во фракции с RZ около 0,5 (пиковые фракции) добавляют бычий сывороточный альбумин (БСА) 10 мг на 1 мл. Конъюгат разливают в ампулы, лиофилизируют и хранят при 4^oС.

4. Получение гепатитного (А) магноиммуносорбента.

Магноиммуносорбент (МИС) получают путем ковалентной сшивки иммуноглобулина к вирусу гепатита А на поверхности гранул.

Магносорбент отмывают от консерванта дистиллированной водой /3-4 раза в течение 1 мин/. 1 г магносорбента заливают 10 мл 8%-ного раствора глутаральдегида, инкубируют в течение 18 ч при комнатной температуре (20-22)^oС со встряхиванием. Затем отмывают от глутаральдегида десятью объемами дистиллированной воды и 3-4 объемами 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,6. Активированный магносорбент конъюгируют с 10 мл антигепатитных иммуноглобулинов в ФСБ рН 7,6 с концентрацией белка 500-600 мкг/мл. Конъюгацию проводят в течение 18 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Магноиммуносорбент отмывают тремя объемами 0,1 М ФСБ рН 7,6. Заливают 10 мл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), шуттелируют в течение 3 ч при комнатной температуре. Отмывают тремя объемами 0,1 ФСБ рН 7,6, добавляют мертиолат натрия до конечной концентрации 1:10000 и хранят препарат при 4^oС. Срок годности препарата 6 мес (срок наблюдения).

5. Проведение анализа, направленного на выявление вируса гепатита А.

Твердофазный иммуноферментный метод с применением магноиммуносорбета (МИС).

Для проведения иммуноферментного анализа, направленного на выявление вируса гепатита А или его антигенов, микропланшет заполняют реагентами в соответствии со следующей схемой реакции: в лунки первого ряда помещают навески по 5 мг МИС (или 50 мкл 10%-ной взвеси) и отмывающий раствор - фосфатно-солевой буфер (ФСБ) рН 7,2 по 200 мкл; в лунки второго ряда - анализируемые пробы по 100 мкл, содержащие антигены, кроме последней лунки ряда, которую используют в качестве контроля и заполняют 100 мкл ФСБ; в лунки третьего ряда по 200 мкл ФСБ для промывания; в лунки четвертого ряда по 100 мкл рабочего разведения иммунопероксидазного конъюгата; в лунки пятого, шестого и седьмого рядов по 200 мкл ФСБ для промывания; в лунки восьмого ряда по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (0,1 М лимонная кислота с 0,2 М Na₂HPO₄ рН 5,0 в присутствии 0,006%-ной перекиси водорода и ортофенилендиамина в концентрации 0,4 мг/мл).

Подготовленный планшет устанавливают в рамку устройства для проведения ИВФ с использованием МИС и проводят операции в следующей последовательности:
отмывание МИС от консерванта в лунках первого ряда 30 с с перемешиванием;
перенос с помощью металлической гребенки МИС в лунки второго ряда. Инкубирование с пробами 20 мин с перемешиванием пятикратно по 30 с;
перенос МИС в лунки третьего ряда. Промывание с перемешиванием 30 с;
перенос МИС в лунки четвертого ряда. Инкубирование с иммунопероксидазным конъюгатом 20 мин с перемешиванием пятикратно по 30 с;
перенос МИС в лунки пятого, шестого и седьмого рядов с перемешиванием в каждом ряду по 30 с для промывания;
перенос МИС в лунки восьмого ряда для реагирования с субстрат-индикаторным раствором, инкубирование 3-5 мин с перемешиванием 30 с.

После развития цветной реакции МИС удаляют из лунок восьмого ряда. Реакцию останавливают внесением в лунки по 100 мл 2 М серной кислоты. Результат реакции оценивают визуально по сравнению с контролем. Положительными считают пробы, окрашивание которых превышает аналогичный показатель контроля на 70-80% Анализ длится 45-50 мин.

Пример.

Обнаружение вируса гепатита А или его антигенов в объектах внешней среды.

Для обнаружения вируса гепатита А или его антигенов в водопроводной сети, канализационных стоках или открытых водоемах использовали магнитные ловушки, в которые помещали гепатитный (А) магноиммуносорбент (МИС) и оставляли на сутки на объекте исследования: канализационные стоки инфекционной больницы г. Ставрополя, водопроводная сеть, очистные сооружения в г. Ессентуки, канализационный сток курортной зоны в г. Пятигорске и другие объекты. За это время происходила селективная концентрация вируса гепатита А или его антигенов на поверхности гепатитных МИС. Затем ловушки снимали, МИС отмывали несколько раз в физиологическом растворе и далее проводили иммуноферментный анализ с использованием магноиммуносорбентов. Этот вариант анализа исключает момент соединения пробы с МИС на микропланшете, так как этот процесс происходит во время нахождения магноиммуносорбента на магнитной ловушке. Сам анализ длится 25-30 мин.

В результате проведенных исследований было установлено, что с использованием предлагаемой тест-системы вирус гепатита А был выявлен в канализационных стоках инфекционной больницы г. Ставрополя, в сточных водах курортной зоны г. Пятигорска, канализационном коллекторе инфекционной больницы г. Ессентуки и других объектах.

Использование: медицина, вирусология, прикладная иммунология, для диагностики вируса гепатита А. Сущность изобретения: проводят иммуноферментный анализ на твердом носителе с использованием пероксидазного коньюгата и магносорбентов, сенсибилизированных антигепатитным (А) иммуноглобулином. Пероксидазный коньюгат конструируют на основе иммуноглобулинов к вирусу гепатита А.

Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А путем проведения иммуноферментного анализа на твердом носителе с использованием пероксидазного коньюгата, отличающаяся тем, что иммунологическую реакцию на твердом носителе осуществляют с использованием магносорбентов, которые сенсибилизируют антигепатитными (А) иммуноглобулинами и помещают их в исследуемую среду, а конструирование иммунопероксидазного коньюгата проводят на основе иммуноглобулинов к вирусу гепатита А.