Иммуноферментная тест-система для выявления антител к BLV в сыворотке крови, молоке крупного рогатого скота Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/28 C12N15/48 G01N33/53 

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии. Может быть использовано для качественного выявления суммарных антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (BLV) в индивидуальных или сборных образцах сыворотки крови и индивидуальных образцах молока крупного рогатого скота (КРС). Рекомендуется для клинической лабораторной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности выявления антител к BLV за счет использования «сэндвич» формата ИФА с биотин-стрептавидин системой и выявления всех классов антител к 11 известным генотипам BLV. За счет использования в изобретении рекомбинантного антигена р24 повышается специфичность выявления антител к BLV, не требуется верификация результата в подтверждающем тесте и уменьшаются производственные затраты.

Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является РНК-содержащий вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV), относящийся к семейству Retroviridae, роду Deltaretrovirus. Вирус в организме инфицированного животного присутствует пожизненно в форме провируса, интегрированного в ДНК клеток хозяина. Вирус поражает клетки лимфоидной ткани. Инкубационный период болезни составляет от 2 месяцев до 6 лет. В развитии болезни различаются бессимптомная, гематологическая и клиническая стадии. Клинические признаки проявляются, как правило, в заключительной стадии развития болезни, поэтому в диагностике заболевания они имеют лишь вспомогательное значение. Основу прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА).

Лабораторная диагностика BLV-инфекции базируется на исследовании проб биологического и (или) патологического материала с помощью серологических, гистологических, молекулярно-биологических и гематологических методов.

Согласно, ПРИКАЗУ МИНИСТЕРСТВА СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ от 24 марта 2021 г. N 156 «ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРАВИЛ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ, ДИАГНОСТИЧЕСКИХ, ОГРАНИЧИТЕЛЬНЫХ И ИНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ, УСТАНОВЛЕНИЯ И ОТМЕНЫ КАРАНТИНА И ИНЫХ ОГРАНИЧЕНИЙ, НАПРАВЛЕННЫХ НА ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ И ЛИКВИДАЦИЮ ОЧАГОВ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА» серологическая диагностика должна проводиться методами иммуноферментного анализа (ИФА) и (или) иммунодиффузии (РИД). Диагноз на лейкоз считается установленным в одном из следующих случаев: получен положительный результат при гематологическом исследовании; обнаружены патологоанатомические изменения, характерные для лейкоза при гистологическом исследовании; получен положительный результат при серологических исследованиях.

Среди серологических тестов, ИФА является более предпочтительным из-за его более высокой чувствительности, есть данные, что чувствительность РИД ниже на 30%. Для серологических методов диагностики BLV, мишенями являются антитела, распознающие капсидный белок р24, кодируемый геном gag и поверхностный гликопротеин gp51, кодируемый env [Bai L. et al., 2019; Marawan M.A. et al., 2021].

Белок gp51 необходим для проникновения вируса в клетки хозяина, из-за своей поверхностной локализации является мишенью для нейтрализующих антител. Конформационные эпитопы F, G и Н, расположенные в N-конце gp51, важны для формирования синцития. Env gp51 часто используется для филогенетического анализа BLV, выделяют 11 генотипов вируса. Генотип-1 является наиболее доминирующим генотипом BLV и распространен практически на всех континентах, вторым по распространенности генотипом является генотип-4, который преимущественно выявляется в Европе и некоторых странах Америки [Ruiz V. et al., 2018].

В России распространены 4, 7 и 8 генотипы вируса. Изучение нуклеотидных последовательностей BLV важно не только для установления филогенетических связей, но и для выяснения потенциального влияния изолятов из разных географических областей на серодиагностику вируса [ 2013].

Капсидный белок р24 обладает высокой иммуногенностью и присутствует как в вирионах, так и в инфицированных клетках в концентрациях, превышающих концентрации gp51. Белок gp51 локализуется на поверхности вирусной частицы и, поскольку он содержит сайт распознавания рецепторов, необходимых для проникновения вируса, считается естественной мишенью для нейтрализующих антител, он может вызывать сильный иммунный ответ у инфицированного крупного рогатого скота [Bai L. et al., 2019].

Разработано множество тестов для определения антител к BLV. Все они отличаются друг от друга форматом ИФА, типом диагностической мишени, выявляемым спектром антител, типом и объемом исследуемого образца, процедурой постановки. В таблице 1 собраны характеристики имеющихся на рынке основных ИФА тестов для диагностики BLV-инфекции.

Анализ инструкций по применению некоторых зарубежных и отечественных иммуноферментных тест-систем для определения антител к BLV показал, что для скрининга лейкоза КРС используется метод непрямого ИФА или конкурентный ИФА, в качестве подтверждающего теста используется непрямой ИФА, в состав которого входят стрипы с BLV антигеном и стрипы с контрольным антигеном. Результаты, полученные в наборах реагентов, в состав которых входят высоко очищенный антиген - не требуют дополнительной верификации. Все тест-системы с двухстадийным форматом постановки.

В составе большинства тест-систем ИФА используют лизат вируса или лизатный антиген gp51, в 1 тест-системе используются антигены gp51 и р24. Тест-системы определяют антитела класса G к BLV или общие антитела.

Были исследованы релевантные документы, связанные с диагностикой вирусных инфекций иммуноферментным методом. В тест-системах ИФА используется лизат вируса или антиген gp51 BLV, которые получают из культуральной жидкости клеточной линии эмбриональной почки ягненка (FLK), инфицированной BLV (FLK-BLV). Многоэтапная процедура очистки вируса или его антигенов требует дорогостоящей сложной аппаратуры. Для культивирования клеток FLK, инфицированных BLV, обычно используют телячью сыворотку, содержащую иммуноглобулины КРС, из-за этого происходит контаминация gp51 антигена, несмотря на сложные этапы очистки, что приводит к ложноположительным результатам ИФА. Технологии, описанные в патентах PL 214884 B1, ЕР 2328912 А1 позволяют использовать среды для культивирования клеток, не содержащие бычьей сыворотки и получить антиген gp51 BLV без контаминации антителами КРС.

В патенте RU 2377962 C1 было предложено другое решение, для того чтобы избежать сложной процедуры очистки и повысить специфичность и чувствительность анализа проводят иммобилизацию лизатного gp51 антигена на твердом носителе в три этапа с помощью моноклональных антител. Первый этап - неспецифическая адсорбция моноклональных антител мыши к глобулинам овцы 1Н8, не реагирующих с иммуноглобулинами крупного рогатого скота. Второй этап - специфическое иммунологическое связывание с указанными антителами моноклональных антител овцы к антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота 8С12. Третий этап - специфическое иммунологическое связывание gp51 BLV с моноклональными антителами овцы к этому антигену.

В патенте CN 110078820 А описано получение рекомбинантного р24 BLV в системе экспрессии Escherichia coli и мышиных моноклональных антител (МКА) к р24 BLV, в патенте KR 100576170 B1 получение рекомбинантного р24 BLV в бакуловирусной системе экспрессии.

В патенте KZ 25695 изложен способ детекции специфических антител к BLV, в котором для приготовления иммуносорбента используют антиген р24, сенсибилизированный на поверхности носителя посредством моноклональных антител к р24.

Недостатком использования серологических тестов только на основе gp51, является то, что этот поверхностный гликопротеин является высоко вариабельным, то есть животные, инфицированные другим генотипом вируса, могут не иметь антител к уникальному эпитопу и возможен ложноотрицательный результат. В тестах, основанных на высоко консервативном р24 BLV, такая проблема отсутствует [Andreolla А.Р., 2018].

Использование систем экспрессии Escherichia coli или бакуловируса для получения рекомбинантных антигенов BLV было бы очень полезным для улучшения стандартизации тестов и снижения их производственных затрат [Larsen A. et al., 2017].

В некоторых публикациях показано удачное получение и использование для серодиагностики рекомбинантного р24, полученного в системе Escherichia coli [Bai L. et al., 2019; Gutiérrez G. et al., 2009; Andreolla A.P., 2018].

До конца не ясно, какие антитела появляются раньше, по одним данным антитела к gp51 появляются первыми [Ruiz V. et al., 2018], по другим данным антитела к р24 обнаруживаются раньше. По всей видимости, первоочередность образования антител к одному или другому белку и их титры зависят от конкретного животного [Bai L. et al., 2019] и/или от чувствительности тест-системы, используемой для детекции этих антител [Larsen A. et al., 2017].

Широко обсуждается опасность вируса лейкоза крупного рогатого скота для здоровья человека, так как провирусная ДНК BLV обнаруживается в молочных и мясных продуктах. В нескольких сообщениях показано, что BLV может нанести вред человеку из-за возможной связи между BLV-инфекцией и развитием рака молочной железы у женщин, а также других гемопоэтических неопластических заболеваний [Marawan MA, 2021, Andreolla АР, 2018].

BLV проникает в клетку хозяина, используя белок AP3D1 в качестве рецептора, который консервативен у большинства видов млекопитающих. ДНК BLV обнаружена у овец и буйволов, что свидетельствует о циркуляции вируса среди нескольких видов, что может быть связано с распространением вируса в условиях совместного содержания животных. Из-за присутствия вируса у нескольких видов и наблюдаемых высоких показателей распространенности следует рассмотреть комплексные стратегии профилактики и контроля в животноводстве, чтобы уменьшить распространение BLV [Olaya-Galán NN, 2022].

Раскрытие сущности изобретения

Предлагаемое техническое решение заключается в создании иммуноферментной тест-системы для выявления суммарных антител к капсидному белку BLV. Включает иммуносорбент на основе рекомбинантного р24 антигена и детектирующие реагенты.

Технический результат заключается в повышении чувствительности выявления антител к BLV за счет использования «сэндвич» формата ИФА с биотин-стрептавидин системой и выявления всех классов антител к 11 известным генотипам BLV. За счет использования в изобретении рекомбинантного антигена р24 повышается специфичность выявления антител к BLV, не требуется верификация результата в подтверждающем тесте и уменьшаются производственные затраты.

Иммуноферментная тест-система содержит следующий набор реагентов: Иммуносорбент - Планшет полистироловый 96-луночный разборный до стрипов (или до лунок), в лунках которого сорбирован рекомбинантный р24 антиген BLV (BLV р24, кат. № ABLV 1010, ООО «НПО «Диагностические системы»); Конъюгат-1 - Концентрат (×11). Рекомбинантный антиген BLV, конъюгированный с биотином (BLV p24-Biotin, кат. № ABLV-b-101, ООО «НПО «Диагностические системы»); Конъюгат-2 - Концентрат (×11). Стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (rec Streptavidin-HRP, кат. № ASTREP-p-919b, ООО «НПО «Диагностические системы»); РРК-1 - Раствор для разведения Конъюгата-1; РРК-2 - Раствор для разведения Конъюгата-2; К+ - Контрольный положительный образец; К- - Контрольный отрицательный образец; ПР - Промывочный раствор. Концентрат (×25) фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т); Стоп-реагент - Раствор серной кислоты (0,2М); ТМБ-Субстратный раствор - Раствор, содержащий 3,3', 5,5' -тетраметилбензидин и раствор перекиси водорода.

Метод основан на твердофазном иммуноферментном «сэндвич» анализе. Твердая фаза покрыта рекомбинантным р24 антигеном BLV. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют с Конъюгатом-1 (рекомбинантный антиген BLV, конъюгированный с биотином). Присутствующие в исследуемом образце антитела к BLV взаимодействуют одновременно с антигеном BLV в составе Иммуносорбента и Конъюгата-1. На второй стадии после отмывки образовавшиеся комплексы выявляют с помощью конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена. После отмывки не связавшихся компонентов визуализация происходит в химической реакции пероксидазы с ТМБ-Субстратным раствором с образованием цветной реакции. Интенсивность окрашивания раствора в лунках после внесения Стоп-реагента измеряют спектрофотометрически. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце антител к BLV.

Данное техническое решение отличается от известных тем, что предлагаемый тест разработан на основе рекомбинантного р24 антигена BLV в «сэндвич» формате ИФА, с использованием биотин-стрептавидин системы.

Данные уникальные особенности изобретения обуславливают его преимущества:

- использование рекомбинантного р24 антигена BLV позволяет выявлять антитела ко всем генотипам BLV и уменьшить производственные затраты, исключить верификацию результата в подтверждающем тесте;

- использование «сэндвич» формата ИФА позволяет выявлять суммарные антитела (классов G, М и А) к капсидному белку BLV и определять антитела к BLV у других видов животных. Возможность определения антител к BLV у других видов животных особенно актуальна, в связи с открытием способности вируса преодолевать межвидовые барьеры и в экспериментальных условиях вызывать заболевание у овец, коз, свиней, лошадей, кроликов, хомяков, морских свинок и обезьян, в естественных условиях - инфицировать овец при совместном содержании животных. Выявление антител к BLV у человека может быть дополнительным инструментом в исследовании возможной связи между BLV-инфекцией и развитием онкологических заболеваний человека;

- использование биотин-стрептавидин системы - позволяет амплифицировать сигнал за счет наличия у стрептавидина нескольких сайтов связывания с биотином;

- возможность исследования индивидуальных или сборных образцов сыворотки крови и индивидуальных образцов молока КРС;

Предложенное решение характеризуется:

- высокой чувствительностью и специфичностью определения антител в сыворотке крови КРС;

- высокой чувствительностью и специфичностью определения антител в молоке КРС.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - представлены ROC кривые - кривые параметрического типа соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов для каждого теста в сравнительном анализе.

Осуществление изобретения

«Набор реагентов для выявления антител к BLV в сыворотке крови и молоке КРС методом иммуноферментного анализа» («ДС-ИФА-АНТИ-BLV»), предназначен для выявления суммарных антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (КРС) в индивидуальных или сборных образцах сыворотки крови и индивидуальных образцах молока КРС.

Предназначен для качественного анализа. Рекомендуется для клинической лабораторной диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Учет результатов проводят спектрофотометрически при двух длинах волн - 450 нм и при референс-длине волны в диапазоне от 620 до 680 нм с настройкой прибора по «воздуху». Допустим учет результатов при одной длине волны - 450 нм.

Наличие антител к BLV оценивается сравнением оптической плотности (ОП), измеряемой для каждого образца, с расчетной величиной ОП критической (ОП крит.).

Результаты анализа учитывать, если среднее значение ОП в лунках с К- (ОПср.К-) не более 0,200, значение ОП в лунках с К+ - не менее 0,600.

ОП крит. рассчитывать по формуле:

ОП крит. = ОПср.К- + А,

где А - коэффициент, определяемый производителем методом статистической обработки результатов постановки ИФА.

Исследуемые образцы расценивать как положительные: если ОП ≥ ОП крит.

Исследуемые образцы расценивать как отрицательные: если ОП < ОП крит.

Возможен учет результатов по коэффициенту позитивности (КП) по формуле:

КП=ОП/ОП крит.

Исследуемые образцы расценивать как положительные: если КП≥1,0.

Исследуемые образцы расценивать как отрицательные: если КП<1,0

Если сборный образец сыворотки крови КРС был определен, как положительный, то сыворотки, входящие в состав пула, должны быть протестированы индивидуально.

Пример 1.

Диагностическая чувствительность и специфичность по образцам сыворотки крови КРС

В наборе реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» были протестированы 140 образцов сыворотки крови КРС в диагностическом наборе для обнаружения антител к BLV иммунодиффузным методом в агаровом геле (РИД анти-BLV) и методом ИФА в тест-системе «IDEXX Leukosis Serum Х2», IDEXX Laboratories, США кат. № ЕВТ1132Т, серия SN АС081, годен до 05-09-2023.

Диагностическая чувствительность «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» составила 100% (95%CI: 94,7-100%), диагностическая специфичность - 100% (95%CI: 94,9-100%), общее совпадение с «IDEXX Leukosis Serum Х2» составило 100% (95%CI: 97,33-100%).

Исследована диагностическая эффективность (точность) «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» с помощью ROC анализа, в котором сравнивали между собой ROC кривые, построенные для «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» и для других тестов/методов, отраженные на фиг.1.

ROC кривая - это кривая параметрического типа соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов. ROC кривая строится таким образом по оси ординат откладывается чувствительность, а по оси абсцисс значение 1-специфичность, т.е. другими словами неспецифичность. Чувствительность отображает долю истинно положительных результатов, а неспецифичность - частоту ложно положительных результатов.

Наиболее четкое разграничение между больными и здоровыми обследуемыми достигается при использовании тестов, которые имеют характеристическую кривую результатов, сдвинутую в сторону левого верхнего угла графика.

Для получения численного значения диагностической эффективности (точности) теста, а также для сравнения двух тестов, используется показатель AUC (Area Under Curve), который может быть рассчитан при помощи численных методов, например, метода трапеций. Судить о качестве теста можно по экспертной шкале для значений AUC, где 0,9 - 1 это хороший показатель значения AUC. Показатель AUC равный 0,5 и менее, считается неудовлетворительным.

У всех исследованных тестов значение площади под кривой было выше 0,9.

Пример 2.

Диагностическая чувствительность и специфичность по образцам молока КРС.

В наборе реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» были протестированы 39 образцов молока КРС, с известным результатом исследования сыворотки крови КРС в «IDEXX Leukosis Serum Х2» от того же животного и забранные в то же время, что и исследуемый образец молока.

Диагностическая чувствительность «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» по образцам молока КРС составила 100% (95%CI: 83,2-100%), диагностическая специфичность - 100% (95%CI: 83,9-100%), общее совпадение с результатами тестирования образцов сыворотки крови от одного и того же животного, забранных в одно и то же время в «IDEXX Leukosis Serum Х2» составило 100% (95%CI: 91,0-100%).

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии. Описаны иммуноферментная тест-система и способ ее применения. Тест-система содержит набор реагентов: Иммуносорбент, Конъюгат-1, Конъюгат-2, РРК-1, РРК-2, К+, К-, ПР, Стоп-реагент и ТМБ-субстратный раствор. Изобретение может быть использовано для качественного выявления суммарных антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (BLV) в индивидуальных или сборных образцах сыворотки крови и индивидуальных образцах молока крупного рогатого скота (КРС). Технический результат заключается в повышении чувствительности выявления антител к BLV за счет использования «сэндвич» формата ИФА с биотин-стрептавидин системой и выявления всех классов антител к 11 известным генотипам BLV. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 2 пр.

1. Иммуноферментная тест-система для выявления суммарных антител к капсидному белку BLV у крупного рогатого скота, содержащая: Иммуносорбент - планшет полистироловый 96-луночный разборный до стрипов или до лунок, в лунках которого сорбирован рекомбинантный р24 антиген BLV; Конъюгат-1 - Концентрат (×11) рекомбинантный антиген BLV, конъюгированный с биотином; Конъюгат-2 - Концентрат (×11) Стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена; раствор для разведения Конъюгата-1 (РРК-1); раствор для разведения Конъюгата-2 (РРК-2); контрольный положительный образец (К+); контрольный отрицательный образец (К-); промывочный раствор (ПР); Стоп-реагент; ТМБ-субстратный раствор - раствор, содержащий 3,3', 5,5'-тетраметилбензидин, и раствор перекиси водорода.

2. Иммуноферментная тест-система по п. 1, где Стоп-реагент представляет собой раствор серной кислоты 0,2 М, ПР представляет собой концентрат (×25) фосфатно-солевого буферного раствора с твином.

3. Способ применения тест-системы по пп. 1, 2 для выявления суммарных антител к капсидному белку BLV, включающий внесение в лунки Иммуносорбента по 50 мкл раствора Конъюгата-1 непосредственно перед добавлением контрольных и исследуемых образцов; внесение в лунки Иммуносорбента по 50 мкл контрольных образцов:

1-2 стрипа - К+ - 1 лунка, К- - 2 лунки,

3 стрипа и более - К+ - 2 лунки, К- - 3 лунки;

внесение в лунки Иммуносорбента исследуемых образцов:

- по 50 мкл индивидуальных или сборных образцов сыворотки крови КРС и/или

- по 100 мкл индивидуальных образцов молока КРС;

тщательное перемешивание контрольных и исследуемых образцов пипетированием, при этом время внесения образцов не должно превышать 15 мин; заклеивание планшета защитной пленкой и выдерживание его 60 мин при температуре 20,0-25,0°С; удаление содержимого лунок с помощью автоматического устройства для промывания планшетов и промывка планшета 4 раза ПР; внесение во все лунки 100 мкл раствора Конъюгата-2; заклеивание планшета защитной пленкой и выдерживание его 60 мин при температуре 20,0-25,0°С; удаление содержимого лунок с помощью автоматического устройства для промывания планшетов и промывка планшета 4 раза ПР; внесение во все лунки по 100 мкл ТМБ-субстратного раствора; выдерживание планшета 20 мин в защищенном от света месте при комнатной температуре; внесение во все лунки по 150 мкл Стоп-реагента, встряхивание стрипов в течение 5-10 с и измерение ОП при двух длинах волн 450 и 620-680 нм; проведение спектрофотометрического учета результатов реакции не позднее чем через 20 мин после внесения Стоп-реагента, значения ОП в лунках с (К+) должны быть не менее 0,600, а среднее значение ОП в лунках с (К-) - не более 0,200.