ЖИВАЯ РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА ГЕПАТИТА В НА ОСНОВЕ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/00 C12N15/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно, к иммунологии, в частности, к специфической профилактике инфекционного вирусного гепатита В.

Специфическая профилактика гепатита В основывается на индукции организмом иммунного ответа при введении антигенов вируса гепатита В. Основным иммуногенном является поверхностный (НВsAg) антиген вируса гепатита В, сборка частиц которого контролируется S-геном preS-1 и preS-2 областями генома вируса. HBsAg содержит и последовательности preS, усиливающие выработку защитных антител.

Известен ряд вакцин, предназначенных для специфической профилактики гепатита В. Первым поколением таких препаратов являются так называемые "плазменные" вакцины типа Heptavax В (США) и Hevac 13 (Франция). Они представляют собой выделенный из плазмы крови людей высокоочищенный HBsAg вируса гепатита В. Вакцины вводятся внутримышечно или подкожно трехкратно в течение 6 месяцев с образованием защитных антител у 91-100% привитых.

Недостатками такого рода вакцин являются сложность получения основного вакционного компонента (НBsAg) из плазмы крови в связи с дефицитностью плазмы людей; необходимость контроля безвредности вакцины на шимпанзе; длительность и высокая стоимость курса иммунизации (113-120 долл.США); опасность заражения вакцинируемого вирусами СПИДа, гепатитов, Т-лейкозов и др. при парентеральной вакцинации; сложность проведения массовой экспрессной иммунизации больших контингентов людей.

Препаратами второго поколения являются субъединичные вакцины, созданные на основе рекомбинантных плазмид, способных к экспрессии HBsAg в клетках микроорганизмов.

Примерами субъединичных вакцин являются вакцины фирмы Smith Kline (Бельгия) "Engerix-В" и фирмы Merck (США) "Recombivax-В", где системой экспрессии HBsAg являются дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae. Продуцируемый антиген является действующим началом вакцины. Эффективность вакцин по сероконверсии среди прошедших полный курс вакцинации составляет 92,6-100%
Однако указанные препараты требуют многократной и длительной схемы вакцинации, а парентеральный способ введения их сопряжен с угрозой заражения вирусами иммунодефицита человека, гепатитов и др. Недостатками являются также сложность достижения удовлетворительной степени очистки HBsAg от дрожжевых белков, что вызывает аллергические реакции у вакцинируемых. Продукты экспрессии гена HBsAg не всегда приобретают необходимую третичную и четвертичную структуру белка, характерную для высших эукариотов.

Вакцинами третьего поколения являются вакцины, полученные на основе рекомбинантных штаммов вирусов, экспрессирующих встроенные гены вируса гепатита В в клетках высших млекопитающих in vivo.

Примерами рекомбинантной вакцины на основе рекомбинантного вируса вакцины являются вакцины, содержащие встроенный S-ген вируса гепатита В. Такие вакцины при однократном введении вызывают слабый иммунный ответ и не защищают вакцинированных животных от инаппарантной инфекции. Накожный способ вакцинации сопровождается угрозой заражения вакцинируемых вирусами иммунодефицита, гепатитов и др. Отмечается низкая производительность иммунизации.

В качестве систем экспрессии HBsAg применяют также рекомбинантные штаммы аденовирусов 7 и 4 типов. В ДНК данного вектора встроен S-ген вируса гепатита В. Такой вектор при пероральном введении шимпанзе вызывал выраженный иммунный ответ (11). У животных после заражения вирусом гепатита В отмечена либо полная защита, либо инаппарантное течение заболевания.

Однако использование в качестве иммуногена продуктов экспрессии только S-гена вируса гепатита В снижает эффективность вакционного препарата.

Известна живая рекомбинантная вакцина против гепатита В на основе вируса осповакцины для накожного применения, предназначенная для специфической профилактики гепатита В и натуральной оспы (прототип).

Препарат изготовлен на основе штамма рекомбинатного вируса осповакцины ГКВ2131, способного синтезировать preS2- и HBsAg вируса гепатита В. При вакцинации на коже образуются оспины, характерные для вируса вакцины.

Споcоб производства вакцины соcтоит в выращивании рекомбинатного штамма вируса вакцины ГКВ 2131 на коже теленка, получении с нее оспенного детрита, выделении и очистке вирусного материала с последующим лиофильным высушиванием. Вакцина представляет собой высушенную в ампулах гигроскопическую аморфную массу. Содержит в одном мл не менее 2,5•10⁸ ООЕ, одна прививочная доза не менее 10⁶ ООЕ в 0,01 мл. Массовая доля влаги не более 2,5% В 1 мл вирусной суспензии не более 50 колоний сапрофитной микрофлоры при отсутствии патогенной. Нетоксична для белых мышей и морских свинок, при двукратном накожном введении вызывает образование антител к HBsAg у 60% привитых людей.

Недостатками прототипа являются использование дорогостоящего и дефицитного продуцента (телята), низка производительность вакцинации (19-34 чел.в 1 ч), необходимость квалифицированного медицинского персонала для проведения вакцинации, угроза инфицирования прививаемого вирусами иммунодефицита, гепатитов и др. При вакцинации скарификацией возможно выделение вируса вакцины в окружающую среду, что грозит неконтролируемой его передачей к непривитым людям с риском развития тяжелых осложнений.

Основной задачей разработки было создание высокоэффективной технологичной вакцины, позволяющей быстро в короткие сроки привить против гепатита В и натуральной оспы большие контингенты людей без привлечения квалифицированного медицинского персонала при исключении возможности заражения прививаемых людей вирусами иммунодефицита, гепатитов и других инфекционных заболеваний.

Препарат вакцины "Ревакс-ВТ", представляющий собой сладкие таблетки двояковыпуклой формы со вкусом и запахом ванилина, покрытые защитным кислотно-устойчивым покрытием, содержит рекомбинантный вирус осповакцины не менее 1•10⁷ ООЕ на таблетку, лактозу 87,7% сахарозу 10,0% стеарат кальция 2,0% ванилин 0,2% Действующим началом разработанного препарата является рекомбинантный штамм вирус осповакцины ГКВ 2131 с типичными свойствами вируса осповакцины, способный к синтезу preS2-Ag и HBsAg вируса гепатита В в организме человека.

"Входными воротами" для вируса при иммунизации является слизистая оболочка полости рта и глотки или тонкого кишечника.

Способ производства вакцины гепатита В эмбриональной жидкой рекомбинантной таблетированной включает в себя культивирование штамма рекомбинантного вируса осповакцины ГКВ 2131 на хорионаллантоисных оболочках развивающихся 12- 13-cуточных куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) с последующим получением вируссодержащего материала в виде гомогената ХАО с 20% лактозы, который подвергают лиофильному высушиванию. Сухой вируссодержащий биопрепарат измельчают, смешивают с компонентами наполнителя для приготовления таблеточной массы, из которой путем прессования получают таблетки вакцины "Ревакс-ВТ".

Предложенный способ производства вакцины исключает использование дорогостоящего и дефицитного продукта телят, что в значительной степени удешевляет конечный продукт.

Таким образом, получена вакцина, предназначенная для активной специфичеcкой профилактики гепатита В и натуральной оспы путем приема перрорально таблетки, что исключает возможность заражения прививаемого вирусами иммунодефицита человека, гепатитов и др. инфекций, что возможно при парентеральных способах введения. Иммунизация не может привести к выделению вируса вакцины в окружающую среду, что полностью снимает угрозу осложнений для непривитых лиц. Вакцинация проста по технике исполнения, не требует присутствия медицинского персонала, высокопроизводительна. За 1 ч можно привить от 840 до 1230 человек.

Пример осуществления предлагаемого изобретения.Способ производcтва вакцины гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной таблетированной включает в себя культивирование рекомбинантного вируса вакцины на ХАО 12-13- суточных РКЭ с последующим получением вируссодержащего материала в виде гомогената ХАО с 20% лактозы, который подвергают лиофильному высушиванию. Сухой вируссодержащий биопрепарат измельчают, смешивают с компонентами наполнителя (лактоза 87,8% сахароза 10,0% стеарат кальция 2,0% ванилин 0,2%) для приготовления таблеточной массы. Из последней путем прессования получают таблетки вакцины, на которые наносят защитное кислотоустойчивое покрытие из ацетилфталилцеллюлозы или шеллака.

По данному способу получено 20 серий вакцины. Препарат прошел необходимое доклиническое изучение. В соответствии с методическими указаниями РД 42-28-5-88 (приказ Минздрава N 655 от 15.08.88 г.) на вакцину оформлены: Инструкция по изготовлению и контролю вакцины гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной таблетированной для перорального применения "Ревакс ВТ", обоснование целесообразности разработки препарата, Отчет о доклиническом испытании препарата, Проект программы испытаний вакцины на ограниченной группе людей (добровольцах).

Сравнительная характеристика разработанной вакцины и прототипа представлены в таблице.

Как видно из данных таблицы, вакцина "Ревакс-ВТ" позволяет быстро без угрозы передачи вирусов иммунодефицита, гепатитов прививаемому и без выделения вируса осповакцины в окружающую среду привить большие контингенты людей против гепатита В и натуральной оспы. Для проведения вакцинации не требуется наличия квалифицированного медицинского персонала. Способ получения вакцины исключает применение в качестве продуцентов дорогостоящих телят.

Изобретение относится к медицине, в частности, к живой рекомбинантной вакцине гапатита В на основе вируса осповакцины для перорального применения и способу ее получения. Вакцина представляет собой таблетки, покрытые защитной кислотоустойчивой оболочкой, состоящие из рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего preS2-Ag и НВsAg, и наполнителя (лактоза, сахароза, ванилин, стеарат кальция). Применение данного препарата позволяет повысить безопасность и эффективность специфической профилактики гепатита В и натуральной оспы среди больших контингентов людей за счет перорального применения. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Живая рекомбинантная вакцина гепатита В на основе вируса осповакцины для перорального применения, включающая рекомбинантный штамм вируса осповакцины ГКВ2131 с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS 2-Ag и HBsAg вируса гепатита В, и предназначенная для специфической профилактики гепатита В и натуральной оспы, отличающаяся тем, что вакцина сконструирована в таблетированной форме и содержит в одной таблетке, покрытой кислотоустойчивой оболочкой, рекомбинантный вирус осповакцины не менее 1•10⁷ ООЕ на таблетку, лактозу 87,8% сахарозу 10% стеарат кальция 2% ванилин 0,2%
2. Способ получения живой рекомбинантной вакцины гепатита В на основе вируса осповакцины для перорального применения, включающий пассирование штамма рекомбинантного вируса осповакцины ГКВ2131 на куриных эмбрионах, получение вируссодержащего материала и лиофилизацию, отличающийся тем, что вируссодержащий материал, лиофильно высушенный с 20% лактозы, измельчают, смешивают с наполнителем, прессуют и покрывают таблетки защитной кислотоустойчивой оболочкой.