ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к вакцинации, проводимой с использованием полиалкиламиновых конъюгатов сфинголипидов для эффективной доставки биологически активных материалов, в частности антигенных молекул.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ниже приводится перечень разного рода материалов, которые можно рассматривать как существенные для характеристики достигнутого уровня в той области техники, к которой относится настоящее изобретение.
US 5334761: «Cationic lipids»;
US 2001/048939: «Cationic reagents of transfection»;
US 5659011: «Agents having high nitrоgen cоntent and high cationic charge based on dicyanimide dicyandiamide or guanidine and inorganic ammonium salts»;
US 5674908: «Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids»;
US 6281371: «Lipopolyamines, and the preparation and use thereof»;
US 6075012: «Reagents for intracellular delivery of macromolecules»;
US 5783565: «Cationic amphiphiles containing spermine or spermidine cationic group for intracellular delivery of therapeutic molecules»;
Marc Antoniu Ilies & Alexandru T. Balaban, Expert Opin. Ther. Patents, 11(11):1729-1752 (2001);
Miller AD. Chem. Int. Ed. Eng. 37: 1768-1785 (1998);
Nakanichi T. et al., J Control Release 61: 233-240 (1999);
Brunel F. et al., Vaccine 17: 2192-2193 (1999);
Guy B, et al. Vaccine 19: 1794-1805 (2001);
Lima KM et al. Vaccine 19: 3518-3525 (2001).
Многие природные биологические молекулы и их аналоги, включая белки и полинуклеотиды, чужеродные вещества и лекарственные средства, которые способны воздействовать на клеточную функцию на субклеточном или молекулярном уровне, для проявления своего эффекта преимущественно включаются в клетку. Для таких агентов клеточная мембрана представляет селективный барьер, который непроницаем для них. Клеточная мембрана имеет сложный состав, включающий фосфолипиды, гликолипиды и холестерин, а также эндогенные и экзогенные белки, функция которых опосредуется влиянием цитоплазматических компонентов, включающих Ca++ и ионы других металлов, анионы, АТФ, микрофиламенты, микротрубочки, ферменты и Ca++-связывающие белки, а также внеклеточный гликокаликс (протеогликаны, гликозаминогликаны и гликопротеины). Взаимодействие между структурными и цитоплазматическими компонентами клетки и их реакция на внешние сигналы определяют важность транспортных процессов для селективности мембраны, проявляемой как в аспекте внутриклеточной среды, так и на уровне межклеточных взаимодействий.
Также предметом исследования являлась успешная доставка средств, которые в естественных условиях не захватываются клеткой и не проникают в нее. Мембранный барьер может быть преодолен комплексами, образуемыми путем связывания средств с липидными композициями, которые очень близки по липидному составу природным клеточным мембранам. Такие композиции могут сливаться с клеточными мембранами, с которыми они вступают в контакт, или, чаще, могут захватываться по механизму пиноцитоза, эндоцитоза и/или фагоцитоза. Во всех этих процессах ассоциированные вещества доставляются внутрь клеток.
Липидные комплексы могут облегчать внутриклеточный транспорт также за счет того, что они позволяют преодолеть определяемое зарядом отталкивание между клеточными поверхностями, которые чаще всего заряжены отрицательно. Липиды в таких композициях включают амфипатический липид, такой как фосфолипиды клеточных мембран, и образуют в водных системах различные слои или агрегаты, такие как мицеллы или полые липидные везикулы (липосомы). Липосомы могут использоваться для захвата веществ, вводимых внутрь липосом; в других случаях рассматриваемые лекарственные молекулы могут включаться в липидные везикулы как внутренний компонент мембраны, а не захватываться в пространство водной везикулы или электростатически присоединяться к поверхности агрегата. Однако большинство используемых фосфолипидов является либо цвиттерионами (нейтральными молекулами), либо отрицательно заряженными молекулами.
Большим достижением в области изучения внутриклеточной доставки лекарственных веществ было открытие того факта, что положительно заряженный синтетический катионный липид хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTMA) в виде липосом или небольших везикул может спонтанно взаимодействовать с ДНК с образованием комплексов липид-ДНК, которые способны адсорбироваться на клеточных мембранах, и, захватываясь клетками либо путем слияния, либо, что более вероятно, по механизму адсорбционного эндоцитоза, приводят к экспрессии трансгена [Felgner, Р. L. et al., Prod. Nаtl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987); и U.S. Pat. No. 4897355 (Eppstein, D. et. аl.)]. В других случаях с успехом применяется аналог DOTMA 1,2-бис(олеоилокси)-3-(триметиламмоний)пропан (DOTAP) в сочетании с фосфолипидом, что приводит к образованию ДНК-комплексирующих везикул. Реагент Липофектин (Lipofectin™) (Bethesda Research Laboratoriеs, Gaithersburg, MD) является эффективным средством, применяемым для доставки полинуклеотидов с высоким анионным зарядом в живые клетки в культуре ткани, которое включает положительно заряженные липосомы, состоящие из положительно заряженного липида DOTMA и нейтрального липида диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE), который выполняет функцию так называемого хелперного липида. Указанные липосомы спонтанно взаимодействуют с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами с образованием комплексов, называемых липоплексами. При использовании избыточного количества положительно заряженных липосом относительно отрицательно заряженных молекул ДНК суммарный заряд образуемых комплексов становится также положительным. Положительно заряженные комплексы, получаемые таким способом, спонтанно присоединяются к отрицательно заряженным клеточным поверхностям или поступают в клетки либо по механизму адсорбционного эндоцитоза, либо по механизму, опосредованному слиянием с плазматической мембраной, так, что оба процесса приводят к доставке функционального полинуклеотида внутрь, например клеток в культуре ткани. DOTMA и DOTAP являются хорошими примерами монокатионных липидов [Illis et al., 2001, ibid.].
Было показано, что сами по себе поливалентные катионы (включая полиамины, неорганические соли и комплексы, а также дегидратирующие растворители) облегчают доставку макромолекул в клетки. В частности, поливалентные катионы провоцируют распад олиго- и полианионов (молекул нуклеиновых кислот, аминокислот и т.п.) до компактных структур и облегчают сборку таких полианионов в вирусы, их включение в липосомы, транспорт в клетки и т.п. [Thomas T.J. et al., Biochemistry 38:3821-3830 (1999)]. Самыми маленькими природными поликатионами, которые способны оказывать такое воздействие по компактному преобразованию ДНК, являются полиамины спермидин и спермин. Путем присоединения гидрофобной метки через линкер к таким молекулам может быть получен новый класс векторов трансфекции, поликатионные липополимеры.
Катионные липиды и катионные полимеры вступают в электростатическое взаимодействие с анионными группами ДНК (или любой другой полианионной макромолекулы) с образованием комплексов ДНК-липид (липоплексов) или ДНК-поликатионных комплексов (полиплексов). Образование комплекса сопряжено с высвобождением противоионов липидов или полимеров, что является термодинамической движущей силой для спонтанного образования липоплекса и полиплекса. Катионные липиды могут быть разделены на четыре класса: (i) четвертичная аммониевая соль липидов (например, DOTMA (LipofectinTM) и DOTAP) и пары фосфоний/арсоний; (ii) липополиамины; (iii) катионные липиды, содержащие как фрагменты четвертичного аммония, так и полиаминовые фрагменты и (iv) амидиниевая, гуанидиниевая и гетероциклическая соль липидов.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение относится к применению сфингоид-полиалкиламинового конъюгата для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции иммунного ответа у субъекта.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат включает сфингоидный каркас, содержащий через карбамоильную связь по меньшей мере одну полиалкиламиновую цепь.
Термин «сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат» в контексте настоящего описания обозначает химическую конъюгацию (связывание) между сфингоидным основанием (что в настоящем контексте описывается также термином «сфингоидный каркас») и по меньшей мере одной полиалкиламиновой цепью. Конъюгирование между сфингоидным основанием и по меньшей мере одной полиалкиламиновой цепью осуществляется через карбамоильную связь, что ниже будет описано более подробно.
Термин «сфингоидное основание/каркас» в контексте настоящего описания включает длинноцепочечные алифатические амины, содержащие две или три гидроксильных группы, где алифатическая цепь может быть насыщенной или ненасыщенной. Другим примером ненасыщенного сфингоидного основания является основание, содержащее характерную транс-двойную связь в положении 4.
Термин «модуляция» в контексте настоящего описания обозначает любое измеряемое регуляторное или биохимическое воздействие, оказываемое биологически активным материалом, доставляемым с помощью конъюгата, на иммунный ответ субъекта, включая клеточный ответ и/или гуморальный ответ. Модуляция включает ингибирование или, наоборот, стимуляцию или усиление одного или обоих типов ответов при введении указанному субъекту сфингоид-полиалкиламинового конъюгата в сочетании с биологически активными веществами. Термин «модуляция» предпочтительно используется применительно к стимуляции или усилению в два или более раз относительно уровня, выявляемого при введении биологически активной молекулы без конъюгата. Настоящее изобретение также относится к модуляции иммунного ответа в тех случаях, когда вводимый без конъюгата биологически активный материал является по существу неэффективным в плане генерирования такого ответа.
Кроме того, термин «модуляция» относится к ингибированию или супрессии иммунного ответа у субъекта, например, при лечении аутоиммунных заболеваний, а также при лечении аллергии.
Таким образом, термин «биологически активная молекула» в контексте настоящего описания обозначает любое вещество, которое при введении в сочетании со сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом оказывает воздействие на иммунную систему субъекта. Биологически активный материал предпочтительно является антигенным белком, антигенным пептидом, антигенным полипептидом или антигенным углеводом.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему введение указанному субъекту сфингоид-полиалкиламинового конъюгата вместе с биологически активной молекулой, где данный сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат включает сфингоидный каркас, содержащий присоединенную через карбамоильную связь по меньшей мере одну полиалкиламиновую цепь.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции иммунного ответа у субъекта, где указанная композиция содержит (i) по меньшей мере один сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат и (ii) по меньшей мере одну биологически активную молекулу, ассоциированную с данным конъюгатом.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к комплексу, включающему (i) сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат и (ii) биологически активный материал, способный модулировать иммунный ответ у субъекта.
И, наконец, настоящее изобретение относится к применению сфингоид-полиалкиламинового конъюгата, определенного выше, в качестве средства, удерживающего биологически активные молекулы (например, антигенные молекулы). В данном контексте сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат может представлять собой часть набора, используемого для захвата/удерживания биологически активных молекул, предпочтительно антигенных молекул и/или иммуностимуляторов и/или иммуносупрессоров, где данный набор включает, в дополнение к указанному конъюгату, инструкцию по его использованию для захвата/удерживания биологически активных молекул. Конъюгат в данном наборе может иметь форму сухого продукта, и в этом случае набор может также включать подходящую жидкость, с которой конъюгат смешивают перед использованием с получением суспензии или эмульсии, или раствора, или данный конъюгат уже может иметь жидкую форму (суспензии, эмульсии, раствора и т.п.). Данный набор может иметь множество применений. Так, например, набор может использоваться для исследования функций различных иммуномодулирующих молекул с точки зрения модуляции иммунных ответов, в процессах выделения биологически активных молекул и их идентификации. Специалистам в данной области известно, для каких целей может применяться такой удерживающее средство, в частности в исследовательских целях.
Термин «удерживающее средство» в контексте настоящего описания относится к конъюгату, способному к ассоциации с биологически активными молекулами, где последние несут отрицательный заряд, представляют собой отрицательный диполь или имеют локальный отрицательный заряд (площадь на молекуле, несущей суммарный отрицательный заряд) за счет поликатионной структуры конъюгата. Процесс захвата/удерживания per se включает электростатическое взаимодействие между захватываемой/удерживаемой молекулой, которая имеет такой отрицательный заряд, представляет собой отрицательный диполь или несет локальный отрицательный заряд, и положительно заряженным конъюгатом по настоящему изобретению.
Конъюгат по настоящему изобретению может также использоваться в качестве носителя для доставки путем переноса биологически активных молекул, осуществляемого по механизму захвата, в сайт-мишень и в целевую клетку.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Для пояснения настоящего изобретения и для более наглядной демонстрации путей его практической реализации ниже описываются некоторые варианты его осуществлени с помощью неограничивающих примеров и со ссылкой на сопровождающие описание чертежи.
На фиг. 1А-1D показаны некоторые возможные химические структуры, «линейные», «разветвленные» или «циклические» липидоподобные катионные соединения (LLC), которые охватываются общим определением сфингоид-полиалкиламинового конъюгата (I), где фиг.1А представляет иллюстрацию каркаса (церамида), присоединенного к одной полиалкиламиновой цепи, на фиг.1В и фиг.1С показан тот же самый каркас, присоединенный к двум полиалкиламиновым цепям, а на фиг.1D снова показан тот же самый каркас, однако в данном случае единственная полиалкиламиновая цепь присоединяется посредством двух гидроксильных фрагментов с образованием циклического полиалкиламинового конъюгата.
На фиг. 2A-2F показаны биологическое распределение и картина фармакокинетики различных флуоресцентно меченых липидных композиций в желудочно-кишечном тракте - ■-, в легких - ♦- или селезенке ---, не выявляемых -♦-; на фиг.2А показано распределение пустых структур DMPC:DMPG (молярное соотношение 9:1); на фиг.2В показано распределение DMPC:DMPG:HN; на фиг.2С показано распределение пустых структур DOTAP:холестерин; на фиг.2D показано распределение структур DOTAP:холестерин:HN; на фиг.2E показано распределение пустых структур CCS:холестерин и, наконец, на фиг.2F показано распределение структур CCS-холестерин:HN.
На фиг. 3A-3D показано биологическое распределение различных композиций липидных структур, содержащих 125I-HN в желудочно-кишечном тракте - ■-, в легких - ♦- или селезенке -◊-, не выявляемых -х-, и, в частности, на фиг.3А проиллюстрировано биологическое распределение свободного 125I-HN; на фиг.3В показана содержащая 125I-HN липидная структура, которая состоит из DOTAP:холестерина; на фиг.3С показана содержащая 125I-HN липидная структура, которая состоит из DMPC:DMPG, и на фиг.3D показана содержащая 125I-HN липидная структура, которая состоит из CCS:холестерина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к применению сфингоид-полиалкиламиновых конъюгатов в качестве удерживающих средств для переноса биологически активных молекул, которые обладают эффективностью в модуляции иммунного ответа у субъекта.
Сфингоид-полиалкиламиновые конъюгаты являются липидоподобными катионными соединениями (LLC), которые могут быть синтезированы указанным ниже способом. Длинные цепочки с N-замещенными основаниями, в частности N-замещенными сфингоидами, или сфингоидные основания связываются с различными полиалкиламинами или их производными с образованием полиалкиламин-сфингоидной структуры, которая может использоваться в качестве таковой или может быть далее алкилирована.
Протонирование при соответствующем pH или алкилирование образованной полиалкиламин-сфингоидной структуры придает липидоподобным соединениям желательный положительный заряд, нужный для взаимодействия с биологически активными молекулами, доставляемыми в целевую клетку, и с целевыми клетками. Сфингоид-полиалкиламиновые конъюгаты эффективно ассоциируют с биологически активными молекулами благодаря электростатическим взаимодействиям между биологически активными молекулами, имеющими анионный характер, и полиалкиламиновыми фрагментами конъюгата с образованием комплексов (липоплексов).
Альтернативно, сфингоид-полиалкиламиновые конъюгаты могут формировать структуры, включающие биологически активные молекулы.
Сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат может иметь вид отдельных липидоподобных молекул или может представлять собой объединенную структуру. Один пример подходящей объединенной структуры включает образование мицелл везикул и, в частности, липосом. Другие примеры таких объединенных структур включают образование мицелл, инвертных фаз, фаз из кубических форм и т.п. Очевидно, что сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат может находиться в объединенной везикулярной/мицеллярной форме или в составе другого рода объединенных структур.
«Объединенная липидная структура» в контексте настоящего описания обозначает организованное образование липидных молекул, образующих, в частности, мицеллы и липосомы. Объединенные липидные структуры предпочтительно представляют собой стабильные объединенные липидные структуры. «Стабильная объединенная липидная структура» в контексте настоящего описания обозначает такую объединенную структуру, которая является химически и физически стабильной в условиях хранения (4°С, в физиологической среде) по меньшей мере в течение одного месяца.
В том случае, когда данные объединенные структуры имеют вид везикул (например, липосом), биологически активные молекулы могут быть инкапсулированы внутри таких везикул, частично в липидный бислой, или могут быть адсорбированы на поверхности везикул (или может иметь место любое сочетание указанных трех вариантов). Когда указанные объединенные структуры представляют собой мицеллы, биологически активные молекулы могут быть включены в амфифильные соединения, образующие мицеллы, и/или могут быть ассоциированы с ними в стабильном режиме за счет электростатического взаимодействия.
Таким образом, в контексте настоящего описания термины «инкапсулированные в», «содержащиеся в», «включенные в» или «ассоциированные с» указывают на физическое соединение, имеющееся между конъюгатом и биологически активной молекулой. Физическое соединение может представлять собой включение данной молекулы или ее захват в объединенные структуры (например, в везикулы, мицеллы или другие структуры), образованные из конъюгата; нековалентное связывание биологической молекулы с поверхностью таких объединенных структур или погружение биологической молекулы в пространство между сфингоид-полиалкиламиновыми конъюгатами, образующими такие объединенные структуры. Следует отметить, что в связи с положительным зарядом или положительным диполем сфингоид-полиалкиламинового конъюгата в физиологических условиях предпочтительная ассоциация между конъюгатом и биологически активным материалом осуществляется за счет электростатического, дипольного или кислотно-щелочного взаимодействия.
Несмотря на вышесказанное, настоящее изобретение не ограничивается конкретным типом ассоциации, возникающей между сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом и биологически активной молекулой. Таким образом, ассоциация означает любое взаимодействие между конъюгатом или образованной на его основе объединенной структурой и биологически активным материалом, которое способно привести к достижению желательного терапевтического эффекта.
Ассоциация биологически активных молекул и конъюгата может быть достигнута с использованием любого способа, известного в данной области. Такой способ включает, без ограничения, пост- или совместную лиофилизацию конъюгата с биологически активной молекулой или простое смешивание предварительного сформированного сфингоид-полиалкиламинового конъюгата с биологической молекулой. Способ совместной лиофилизации описан, в частности, в патентах США №№ 6156337 и 6066331, а способы пост-инкапсулирования описаны, например, в WO 03/000227, и все указанные документы включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Таким образом, настоящее изобретение в соответствии с первым из его аспектов относится к применению сфингоид-полиалкиламинового конъюгата для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для модуляции иммунного ответа у субъекта, где указанный сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат включает сфингоидный каркас, содержащий присоединенные через карбамоильную связь по меньшей мере одну, и предпочтительно одну или две полиалкиламиновых цепи.
Как указывалось выше, сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат включает связь сфингоидного каркаса по меньшей мере с одной полиалкиламиновой цепью, где указанная связь осуществлена посредством соответствующих карбамоильных связей. Более предпочтительно, сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат имеет общую формулу (I):
где R1 означает водород, разветвленный или линейный алкил, арил, алкиламин или группу -C(O)R5;
R2 и R5 независимо друг от друга означают разветвленные или линейные C10-C24алкильные, алкенильные или полиенильные группы;
R3 и R4 независимо друг от друга означают группу -C(O)-NR6R7, где R6 и R7, которые могут быть такими же как R3 и R4 или отличаться от них, и независимо друг от друга означают водород или насыщенный, или ненасыщенный, разветвленный или линейный полиалкиламин, причем одна или несколько аминных единиц в указанном полиалкиламине может представлять собой четвертичный аммоний; или
R3 означает водород; или
R3 и R4 формируют вместе с атомами кислорода, к которым они присоединены, гетероциклическое кольцо, включающее -C(O)-NR9-[R8-NR9]m-C(O)-, R8 означает насыщенный или ненасыщенный C1-C4алкил и R9 означает водород или полиалкиламин формулы -[R8-NR9]n-, где указанные R9 или каждая алкиламиновая единица R8NR9 может быть той же самой или различаться в указанном полиалкиламине; и
n и m независимо являются целым числом от 1 до 10, предпочтительно от 3 до 6;
W означает группу, выбранную из -CH=CH-, CH2-CH(OH)- или -CH2-CH2-.
Неограничивающие примеры сфингоидов или сфингоидных оснований, которые могут использоваться в более частном варианте осуществления настоящего изобретения, включают сфингозины, дигидросфингозины, фитосфингозины, дегидрофитосфингозин и их производные. Неограничивающие примеры таких производных включают ацильные производные, такие как церамид (N-ацилсфингозин), дигидроцерамиды, фитоцерамиды и дигидрофитоцерамиды, соответственно, а также церамины (N-алкилсфингозин) и соответствующие производные (например, дигидроцерамин, фитоцерамин и т.п.). Соответствующим образом N-замещенные сфингоиды или сфингоидные основания содержат две гидроксильные группы, которые активируются и впоследствии вступают в реакцию с полиалкиламином с образованием полиалкиламин-сфингоидной структуры. Неограничивающие примеры активирующих агентов включают N,N'-дисукцинимидилкарбонат, ди- или три-фосгеновые или имидазольные производные. Взаимодействие указанных активирующих агентов со сфингоидами или сфингоидными основаниями приводит к образованию сукцинимидилоксикарбонил-, хлорформиат- или имидазол-карбамата, соответственно по одному или обоим гидроксилам. Реакция активирования сфингоидов полиалкиламинами может приводить к образованию разветвленных, линейных (неразветвленных) или циклических конъюгатов, как показано на фиг.1.
В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения сфингоидный каркас представляет собой церамид, присоединенный к одной (фиг.1A) или двум (фиг.1B или 1C) полиалкиламиновым цепям, или указанное присоединение происходит вовлечением двух гидроксильных фрагментов, приводя к образованию циклического полиалкиламинового фрагмента (фиг.1D).
Сформированные сфингоид-полиалкиламиновые конъюгаты могут дальше вступать в реакцию с метилирующими агентами, образуя четвертичные амины. Полученные соединения несут положительный заряд разной величины, определяемый соотношением между четвертичными, первичными и/или вторичными аминами в составе сформированных конъюгатов. Как таковой, сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат существует в виде кватернизованной азотной соли, включающей, без ограничения перечисленными, четвертичный хлорид аммония, четвертичный иодид аммония, четвертичный фторид аммония, четвертичный бромид аммония, четвертичный оксианион аммония и их сочетание.
Сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат предпочтительно используют в сочетании с биологически активной молекулой. Биологически активный материал представляет собой любой молекулу, которая при введении вместе со сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом оказывает воздействие на иммунную систему субъекта, и в соответствии с одним из вариантов изобретения это может быть стимулирующее или усиливающее воздействие. Предпочтительно, данное воздействие представляет собой в два или более раза усиленное воздействие относительно воздействия биологически активной молекулы при введении ее субъекту без данного конъюгата.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения биологически активный материал представляет собой белок, полипептид, пептид или углевод. Конкретно, биологически активная молекула может представлять собой иммуномодулятор, включающий антигенный белок или антигенный пептид, иммуностимуляторы и/или иммуносупрессоры. Антигенные белки и пептиды, иммуностимуляторы и иммуносупрессоры хорошо известны в данной области. Предпочтительно, биологически активный белок, пептид или углевод имеет при физиологическом значении pH суммарный отрицательный дипольный момент или суммарный отрицательный заряд, или содержит по меньшей мере один участок, характеризующийся суммарным отрицательным зарядом.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения биологически активный материал представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, такую как олигодезоксинуклеотиды (ОДН).
Предпочтительное массовое соотношение между сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом и биологически активным материалом составляет от 1000:1 до 1:1.
Сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат может быть также объединен с другими активными веществами, в отношении которых известно, что они могут использоваться в сочетании с антигенными молекулами. Такие вещества включают, например, иммуностимулирующие средства (известные также под названием «иммуностимулятор» или «адъювант»). Такие средства включают любое вещество, которое при добавлении к вакцине повышает иммунный ответ, так что при использовании меньшего количества вакцины можно добиться более выраженного ответа. Иммуностимулирующее средство может вводиться вместе с конъюгатом/биологически активным материалом или в течение определенного интервала времени (например, от нескольких часов или дней до или после введения конъюгата/биологически активной молекулы).
Предпочтительные иммуностимулирующие средства включают, без ограничения перечисленными, цитокины, такие как интерлейкины (IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18), интерфероны (IFN альфа, бета, гамма), олигодезоксинуклеотиды (ОДН), токсины (например, холерный токсин (СТ), стафилококковый энтеротоксин В (SEB)), термолабильный энтеротоксин E. coli (HLT), а также любые другие известные в данной области адъюванты, используемые для усиления или стимуляции иммунного ответа на антигенную молекулу.
Объединенные структуры могут включать сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат (неметилированный или метилированный) в качестве единственного липидоподобного ингредиента или могут быть объединены с другими хелперными липидными веществами. Такие хелперные липидные вещества могут включать некатионные липиды типа DOPE, DOPC, DMPC, холестерина, олеиновой кислоты или других веществ, в разных молярных соотношениях относительно липидоподобного соединения. Холестерин представляет собой одно такое предпочтительное для применения in vivo дополнительное вещество, тогда как DOPE может быть предпочтительным хелперным липидом для случаев применения in vitro. В данном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения коэффициент молярного отношения холестерина к катионному липиду находится в диапазоне от 0,01 до 1,0 и предпочтительно от 0,1 до 0,4.
В объединенную структуру могут быть также включены энхансеры (известные в данной области, такие как СaCl2) и растворимые полиалкиламины.
Другие компоненты, которые могут быть включены в липидную структуру и которые используются в подобного рода структурах, включают стерические стабилизаторы. Один пример таких часто используемых стерических стабилизаторов включает представителей семейства липополимеров, например липиды, дериватизированные полиэтиленгликолем (ПЭГ-липидный конъюгат). Известно, что указанное семейство соединений, в частности, повышает (увеличивает) время циркуляции липидов в крови.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения образованные липосомы могут иметь вид несортированных гетерогенных и гетерослойных везикул (UHV) с диаметром примерно от 50 до 5000 нм. Далее полученные UHV могут быть отсортированы и преобразованы путем дальнейшего процессинга в крупные (более гомогенные) однослойные везикулы (LUV) с диаметром примерно 50-100 нм. Структура и размеры везикул, такие как их форма и размер, могут оказывать выраженное влияние на их эффективность как везикул, осуществляющих доставку активных биологических структур к мишени, то есть являются параметрами, определяющими их способность осуществлять доставку.
Предпочтительная группа полиалкиламиновых цепей, формирующих часть сфингоид-полиалкиламинового конъюгата, была структурно определена выше применительно к формуле (I). В соответствии с данным вариантом осуществления изобретения полиалкиламиновые цепи, которые могут быть одинаковыми или разными в конъюгате формулы (I), выбирают из спермина, спермидина, полиалкиламинового аналога или их сочетания. Термин «полиалкиламиновый аналог» используется для обозначения любой полиалкиламиновой цепи и в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения обозначает полиалкиламин, включающий от 1 до 10 аминогрупп, предпочтительно от 3 до 6 аминогрупп и более предпочтительно 3 или 4 аминогруппы. Алкиламины в составе полиалкиламиновой цепи могут быть одинаковыми или разными и каждый из них может представлять собой первичный, вторичный, третичный или четвертичный амин.
Алкильные фрагменты могут быть одинаковыми или разными в полиалкиламиновой цепи и каждый из них представляет предпочтительно С1-С6алифатическую повторяющуюся единицу. Некоторые неограничивающие примеры полиалкиламинов включают спермидин, N-(2-аминоэтил)-1,3-пропандиамин, 3,3'-иминобиспропиламин, спермин и бис(этильные) производные спермина, полиэтиленимин.
Наиболее предпочтительным сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом по настоящему изобретению является N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермин (CCS). Данный конъюгат включает церамид, присоединенный через карбамоильную связь к спермину.
Сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат по настоящему изобретению предпочтительно используется для приготовления вакцины.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат и предпочтительно ССS используется для приготовления противогриппозной вакцины. В данном варианте биологически активный материал получают из вируса гриппа или из биологически активного аналога молекулы, полученного из вируса гриппа. Такие аналоги включают любое вещество, которое входит в состав антигенного фрагмента, полученного из вируса гриппа, и которое вызывает иммунный ответ.
Конкретным антигенным материалом, полученным из вируса гриппа, являются молекулы гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA), сочетание которых обозначается как NH.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, где данный способ включает лечение указанного субъекта сфингоид-полиалкиламиновым конъюгатом в сочетании с биологически активным материалом.
Комбинированное лечение включает введение сфингоид-полиалкиламинового конъюгата и биологически активного материала либо вместе, либо в течение заданного периода времени, такого как несколько часов или несколько дней (необязательно в сочетании с иммуностимулирующим средством). Однако в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, конъюгат и биологически активный материал смешивают друг с другом перед введением субъекту.
Введение сфингоид-полиалкиламинового конъюгата вместе с биологически активным материалом относится к другому аспекту настоящего изобретения. Соответственно, предлагается фармацевтическая композиция, которая содержит физиологически приемлемый носитель и эффективное количество сфингоид-полиалкиламинового конъюгата вместе с биологически активным материалом. Фармацевтическая композиция необязательно содержит иммуностимулирующее средство.
При введении сфингоид-полиалкиламинового конъюгата в сочетании с биологически активным материалом его доза может быть подобрана в соответствии с результатами его практического применения в медицине с учетом клинического состояния индивидуума, места и способа введения, режима введения, возраста пациента, его пола, веса тела и других существенных факторов, известных в медицинской практике.
Термин «эффективное количество» в контексте настоящего описания обозначает то количество, которое является эффективным для модуляции (усиления или стимуляции, в соответствии с данным выше определением) иммунного ответа у субъекта относительно эффекта, достигаемого в том случае, когда биологически активный материал вводят субъекту без сфингоид-полиалкиламинового конъюгата. Предпочтительно данное количество эффективно для иммунизации субъекта применительно к определенному заболеванию или расстройству.
Независимо от вышесказанного, данное количество может быть эффективным для достижения супрессии или ингибирования иммунного ответа, например, с целью лечения аллергии или аутоиммунных реакций.
Композиция по настоящему изобретению, содержащая сфингоид-полиалкиламиновый конъюгат в сочетании с биологически активным материалом, может вводиться различными способами. Неограничивающие примеры способов введения включают пероральный, подкожный (п/к), парентеральный, включая внутривенный (в/в), внутриартериальный (в/а), внутримышечный (в/м), внутрибрюшинный (в/б), интраректальный (и/р) и интраназальный (и/н) пути введения, а также методы инфузии для введения в область глаза, интраокулярное введение. Предпочтительные способы введения включают интраназальное или внутримышечное введение.
Физиологически приемлемый носитель по настоящему изобретению в основном относится к инертным, нетоксичным, твердым или жидким веществам, предпочтительно не вступающим во взаимодействие с биологически активным материалом или с конъюгатом и который требуется для эффективной доставки конъюгата вместе с биологически активной молекулой.
Неограничивающие примеры физиологически приемлемого носителя включают воду, солевой раствор, 5% декстрозу (глюкозу), 10% сахарозу и т.п., либо в отдельности, либо с небольшим количеством (до 10%) спирта, такого как этанол.
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению представляет собой жидкую композицию, включая суспензии, водные растворы, или имеет форму аэрозоля, где все указанные формы известны специалистам в данной области. Аэрозольные композиции могут быть введены в состав форм, включающих приемлемые пропелленты, находящиеся под давлением, такие как пропан, азот и т.п. Кроме того, они могут быть введены в состав фармацевтических препаратов с носителями, не находящимися под давлением, такими как носители в составе небулайзеров или атомайзеров.
ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ПРИМЕРОВ
ГРИПП
Характеристика катионных липосом, нагруженных антигеном HN
Была исследована эффективность инкапсулирования HN (коммерческого препарата гемагглютинина и нейраминидазы, полученных из вирусов гриппа), вводимого в различные катионные липосомальные композиции в разных массовых соотношениях липид/белок (3/1-300/1), с использованием холестерина (Chol) или без него. В таблице 1 показаны результаты такого эксперимента с использованием катионных липидов DOTAP и CCS.
DOTAP/HN
DOTAP/Chol
CCS/HN
CCS/Chol
HN
100/1
50/1
30/1
10/1
3/1
1/1
1/1
1/1
1/1
1/1
90
90
88
79
35
100/1
30/1
10/1
1/0
1/0
1/0
64
38
1
100/1
100/1
100/1
1/1
2/1
4/1
92
89
80
100/1
30/1
10/1
3/2
3/2
3/2
64
41
0
Процент включения для DOTAP составляет 75-90% при использовании массового соотношения липид/протеин в диапазоне от 50/1 до 300/1 как при наличии, так и в отсутствие холестерина (Chol). При использовании массовых соотношений липид/белок в диапазоне от 30/1 до 300/1 достигается ~90% антигенный потенциал, снижающийся до 79% и 35% в случае массового соотношения 10/1 и 3/1 соответственно. Добавление Chol к композиции не влияет на антигенный потенциал при оценке молярных соотношений DOTAP/Chol 1/1 и 2/1, однако наблюдается некоторое снижение инкапсулирования (80%) в соотношении 4/1. В случае CCS, как при наличии, так и в отсутствие Chol, эффективность включения ниже (64-73% при варьировании массового соотношения в диапазоне 100/1-300/1).
Определяют также уровень ассоциации HN с липосомами при простом смешивании растворимого антигена с предварительно сформированными пустыми липосомами. В таких случаях 40-60% антигена ассоциируется с липосомами при использовании массового соотношения липид/белок от 100/1 до 300/1, независимо от состава композиции.
В совокупности данные результаты свидетельствуют об очень высокой эффективности включения (>60%) в случае всех композиций при использовании простой и быстрой (продолжительностью 5 минут) процедуры. Кроме того, даже предварительно сформированные липосомы в водной суспензии способны к эффективной ассоциации с поверхностными антигенами вируса гриппа.
Проводят также оценку иммуногенности композиции при использовании разных массовых соотношений липид/антиген (при наличии или в отсутствие холестерина).
В первом эксперименте определяют сывороточные уровни антител HI, IgG1 и IgG2a после и/н вакцинации молодых (двухмесячных) мышей BALB/с HN-содержащими нейтральными, анионными или катионными липосомами (таблица 2А). HN антиген представляет собой моновалентную субъединичную вакцину, полученную из штамма A/New Caledonia (H1N1). В том же эксперименте определяют также легочные и назальные уровни антител HI, IgG1, IgG2a и IgA, а также количество INFγ, продуцируемого клетками селезенки (таблицы 2B и 2C).
2
3
F-HN
Lip(DMPC)-HN (нейтральная)
0
3±7(0)
55
150
0
0
6
7
8
9
10
11
Lip(DSTAP:Chol)-HN
Lip(DDAB:Chol)-HN
Lip(DOTAP:Chol)-HN
Lip(DMTAP:Chol)-HN
Lip(CCS:Chol)-HN
F-HN+CT (1 мкг)
28±29(40)
136±32(100)
576±128(100)
672±212(100)
2368±1805(100)
1664±572(100)
20
100
15000
30000
30000
55000
0
0
730
470
9000
7000
В частности, проводят сравнение между вариантами введения нейтральных (DMPC), анионных (DMPC/DMPG, молярное соотношение 9/1) и катионных (6 композиций) объединенных структур (Lip) с инкапсулированными HN антигенами для целей индукции локальных и системных ответов после двух и/н введений. Во всех композициях массовое соотношение липид/HN составляет 300/1, а молярное соотношение катионного липида/Сhol или катионного липида/DOPE составляет 1/1. Параллельно исследуют свободный антиген (F-HN) и F-HN, введенный вместе с холерным токсином (CT, 1 мкг) в качестве адъюванта. Данную вакцину вводят в дни 0 и 7 в количестве 3 мкг/дозу (по 10 мкл на ноздрю) и ответы определяют через 4-6 недель после введения второй дозы вакцины.
n=5
2
3
F-HN
Lip(DMPC)-HN (нейтральная)
0
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
6
7
8
9
10
11
Lip(DSTAP:Chol)-HN
Lip(DDAB:Chol)-HN
Lip(DOTAP:Chol)-HN
Lip(DMTAP:Chol)-HN
Lip(CCS:Chol)-HN
F-HN+CT (1 мкг)
0
0
730
470
9000
7000
20
80
1050
3000
30000
10000
0
30
170
30
1900
1800
0
0
40
15
15000
40
80
30
180
80
30
120
0
0
30
70
300
30
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
F-HN
Lip(DMPC)-HN (нейтральная)
Lip(DMPC/DMPG)-HN (анионная)
Lip(DC-Chol:DOPE)-HN
Lip(DSTAP:Chol)-HN
Lip(DDAB:Chol)-HN
Lip(DOTAP:Chol)-HN
Lip(DMTAP:Chol)-HN
Lip(CCS:Chol)-HN
F-HN+CT (1 мкг)
1400
4200
4000
4900
2300
3100
8000
7800
10200
5200
Как показано в таблицах 2А-2С, свободный антиген, а также нейтральная и анионная Lip-HN были практически неэффективными в качестве вакцины для слизистой. И, наоборот, катионная Lip-HN, в особенности такие вакцины, как DOTAP-HN, DMTAP-HN и CCS-HN, провоцируют жесткий системный и гуморальный ответ слизистой с продуцированием высоких уровней антител IgG1, IgG2a IgA, а именно: вызывают смешанную Th1-Th2 реакцию. Антител IgE не обнаруживаются. Катионные липосомальные вакцины, включающие DOTAP-HN, DMTAP-HN и CCS-HN, также индуцируют высокий уровень IFNγ (но не IL-4) в клетках селезенки, стимулированных антигеном. Ответы, вызываемые CCS-HN, выражены еще сильнее, чем ответы, индуцированные F-HN, с добавкой CT в качестве адъюванта. Основываясь на полученных результатах, далее используют только катионные липосомальные композиции: DOTAP-HN, DMTAP-HN и CCS-HN.
Во втором эксперименте определяют действие различных массовых соотношений липид/HN на иммуногенность HN-содержащих катионных липосом и предварительно сформированных липосом путем простого перемешивания с растворимым антигеном. Данные, приведенные в таблицах 3А-3С, указывают на то, что все три композиции индуцируют мощные ответы системного (сыворотка) и локального (легкое) характера, тогда как снижение массового соотношения липид/HN ниже 100/1 сказывается на резком снижении иммунной реакции.
3
4
5
6
100/1
30/1
10/1
3/1
196±119(100)
36±50(80)
28±18(60)
0
5000
1000
600
20
280
200
30
0
0
0
0
0
8
9
10
11
100/1
50/1
30/1
10/1
208±107(100)
130±118(80)
48±71(40)
24±35(40)
2200
850
450
120
600
150
0
0
0
0
0
0
13
14
15
16
100/1
50/1
30/1
10/1
752±504(100)
272±156(100)
112±125(80)
52±68(40)
6500
1900
650
275
6000
700
400
440
0
0
0
0
18
19
20
F-HN+Lip(DOTAP)
F-HN+Lip(DMTAP)
F-HN+Lip(CCS)
300/1
300/1
300/1
864±446(100)
320±226(100)
704±525(100)
5000
1900
30000
1500
400
5000
0
0
500
3
4
5
6
100/1
30/1
10/1
3/1
40
30
20
10
500
250
250
20
20
35
0
0
0
0
0
0
8
9
10
11
100/1
50/1
30/1
10/1
0
0
0
0
7000
4500
1500
500
350
250
110
0
0
0
0
0
13
14
15
16
100/1
50/1
30/1
10/1
80
40
0
0
7000
5500
1500
500
5500
900
200
200
65000
20000
0
0
18
19
20
F-НN+Lip(DOTAP)
F-HN+Lip(DMTAP)
F-HN+Lip(CCS)
300/1
300/1
300/1
0
0
80
6000
3750
35000
500
225
3000
1200
1500
80000
липид/HN
IFNγ (пг/мл)
3
4
5
6
100/1
30/1
10/1
3/1
42220
20440
20400
27780
8
9
10
11
100/1
50/1
30/1
10/1
13
14
15
16
100/1
50/1
30/1
10/1
18
19
20
F-HN+Lip(DOTAP)
F-HN+Lip(DMTAP)
F-HN+Lip(CCS)
300/1
300/1
300/1
В этом случае также отмечается преимущество вакцины Lip-CCS-HN в сравнении с другими вакцинными композициями, определяемое более высокими уровнями антител IgG2a и IgA в сыворотке крови и в легком (группы 12-16). Интересно отметить, что простое перемешивание растворимого антигена с предварительно сформированными липосомами приводит к получению очень эффективных вакцин (группы 18-20), которые эквивалентны липосомам с инкапсулированным антигеном. Это дает основание полагать, что реальное инкапсулирование антигена не всегда обязательно для достижения адъювантности катионных объединенных структур/липосом.
В другом эксперименте исследуют влияние холестерина на иммуногенность липосом, нагруженных HN. В таблицах 4А-4С приведены результаты данного эксперимента, которые показывают, что добавление Chol несколько снижает системный HI ответ на DОTAP-HN в молярных соотношениях 2/1 и 4/1 (группы 4, 5), но не в молярном соотношении 1/1 (группа 3), а также умеренно повышает общий ответ на DMTAP-HN при всех соотношениях (группы 7-9) и локальный ответ (в легком) на CCS-HN в соотношении 1/1 (группа 11).
3
Lip(DOTAP:Chol)-HN
1/1
496±295(100)
15000
450
0
5
4/1
195±111(100)
15000
250
0
7
Lip(DМTAP:Chol)-HN
1/1
672±419(100)
30000
300
0
9
4/1
608±382(100)
30000
600
0
11
Lip(CCS:Chol)-HN
1/1
2368±1805(100)
30000
9000
100
3
4
5
Lip(DOTAP:Chol)-HN
1/1
2/1
4/1
40
40
60
600
680
720
80
180
50
30
22
60
7
8
9
Lip(DМTAP:Chol)-HN
1/1
2/1
4/1
120
160
80
3000
2500
4000
30
160
100
15
200
150
11
12
Lip(CCS:Chol)-HN
F-HN+CT (1 мкг)
3/2
-
1280
20
30000
10000
1900
1800
15000
1000
3
4
5
Lip(DOTAP:Chol)-HN
1/1
2/1
4/1
9780
12870
9330
7
8
9
Lip(DМTAP:Chol)-HN
1/1
2/1
4/1
10900
8560
7490
11
12
Lip(CCS:Chol)-HN
F-HN+CT (1 мкг)
3/2
-
13780
11110
Оценивают также иммуногенность вакцины CCS-HN у зрелых (18 месяцев) мышей C57BL/6 после внутримышечного (один раз, в день 0) или интраназального (дважды, в день 0 и 7) введения 1 и 2 мкг соответственно субъединичной вакцины (HN) (полученной из вируса A/Panama [H3N2]). Липидные объединенные структуры состоят из CCS/холестерина (молярное соотношение 3:2) и соотношение липида/HN составляет 200:1 (мас./мас.). В отличие от нулевой активности коммерческой вакцины, вакцина CCS-HN провоцирует образование в сыворотке высоких уровней антител HI и IgG2a (при исследовании через 4 недели после вакцинации) и антител IgG2a и IgA в легком (при исследовании через 6 недель после вакцинации), как показано в таблицах 5А и 5В (приведенные данные представляют собой среднее значение титров).
2
3
4
F-HN, в/м × 1
F-HN, и/н × 2
Lip(CCS)-HN, и/н × 2
0
0
80
15
0
130
0
0
350
2
3
4
F-HN, в/м × 1
F-HN, и/н × 2
CCS-HN, и/н × 2
0
0
0
0
0
180
0
0
840
Кроме того, исследуют также индукцию клеточных ответов различными вакцинными композициями. В частности, молодых мышей иммунизируют и/н введением различных катионных липосомальных композиций и через 6 недель после вакцинации оценивают клеточные ответы спленоцитов: цитотоксичность, пролиферацию и продукцию IFNγ. В эксперименте, результаты которого приведены в таблице 6, было проведено сравнение результатов применения липосом, содержащих HN (группами 3-10), и свободного антигена (F-HN), который вводят либо в отдельности (группа 2), либо в смеси с предварительно сформированными пустыми липосомами (группы 11-13). Определяют также иммуногенность Lip(DMTAP-HN) и Lip(CCS)-HN, полученных при варьировании мас./мас. соотношения липид/HN (30/1-300/1).
Наиболее выраженная токсичность против исследуемых клеток-мишеней (пульсовое воздействие Р815 с пептидом из вируса гриппа) достигается только при использовании CCS-HN с соотношением липид/HN (мас./мас.) 100/1 (группа 8) и при использовании всех трех предварительно сформированных липосом (DOTAP, DMTAP и CCS), которые вводят вместе со свободным антигеном. Максимальный пролиферативный ответ наблюдается при введении DMTAP-HN с мас./мас. соотношениями липид/HN, равными 50/1 и 30/1, и при использовании CCS-HN в соотношениях 300/1, 100/1 и 50/1. Пролиферативные и цитотоксические ответы, проявляемые наиболее эффективными липосомальными композициями, в 2-3 раза превышают ответы, которые индуцирует свободный антиген.
Приведенные результаты позволяют полагать, что в сравнении с гуморальным ответом (таблица 3), где наибольшие уровни всех типов исследуемых антител наблюдаются при соотношениях (мас./мас.) липид/HN в диапазоне 100/1-300/1, в данном случае для достижения клеточных ответов могут быть оптимальными сниженные соотношения (например, в диапазоне 30/1-100/1). Кроме того, в то время как DMTAP-HN вызывает выраженный гуморальный ответ, данная композиция является слабым индуктором цитотоксической активности в сравнении с CCS-HN. Интересно отметить, что вакцинация с использованием смеси свободного антигена с предварительно сформированными катионными липосомами (все три композиции) в суспензии вызывает подходящие клеточные ответы, которые аналогичны по степени выраженности ответам, индуцируемым инкапсулированным антигеном. Таким образом, простое смешивание свободного антигена с предварительно сформированными катионными липосомами может быть достаточным для индукции как выраженного гуморального (таблицы 3А-3С), так и клеточного (таблица 6) ответов.
В еще одном эксперименте, результаты которого приведены в таблицах 7А-7С, было проведено сравнение между введением 1 в/м дозы, 1 или 2 и/н доз и 2 пероральных доз моновалентных катионных HN-содержащих липосом, включающих DOTAP, DMTAP и CCS, по иммуногенности и способности индуцировать защитный иммунитет при провокации живым вирусом. В данном эксперименте соотношение липид/HN (мас./мас.) равно 300/1, а соотношение катионный липид/Chol составляет 1/1 в случае систем с DOTAP и DMTAP и 3/2 в случае системы CCS. Из трех указанных способов и/н введение вызывает в два раза более сильный гуморальный и клеточный ответ и защитный иммунитет. Если сравнивать 3 указанных композиции, то CCS индуцирует наиболее сильный ответ, в особенности в том, что касается продукции антител IgG2a и IgA.
В эксперименте, описанном в таблицах 8-10, исследуют коммерческую трехвалентную вакцину и сравнивают результаты введения одной дозы вакцины на основе CCS (при использовании 2 или 4 мкг антигена [HN] каждого из вирусных штаммов) и двух доз вакцины (2 мкг/штамм/доза), вводимых с интервалами 3, 7 или 14 дней между дозировками. Липидные объединенные структуры состоят из CCS/Chol (холестерин) в молярном соотношении 3/2 и во всех композициях соблюдается соотношение (мас./мас.) липид/HN, равное 100/1. В качестве контролей вводят стандартную трехвалентную коммерческую вакцину (HN) либо одну, либо в сочетании с 1 мкг холерного токсина (СТ), используемого в качестве адъюванта для введения в слизистую. Через 5-6 недель после введения первой дозы вакцины в сыворотке, гомогенатах легкого и промывных жидкостях из носа определяют уровни НI антител (таблица 8), а также антигенспецифичных антител IgG1, IgG2a, IgA и IgЕ (таблица 9). Кроме того, у 5 мышей в выбранных группах проводят и/н провокацию живым вирусом (с использованием адаптированного для мышей штамма вируса Х-127) и через 4 дня оценивают количественно титр вируса в легком (таблица 10).
В отличие от коммерческой противогриппозной вакцины (HN), которая демонстрирует слабую иммуногенность или ее отсутствие (группы 2-6), вакцина CCS/Chol-flu индуцирует высокие титры всех типов исследованных антител (за исключением IgЕ, который не обнаруживался), особенно против двух штаммов вируса А (группы 8-11; таблицы 8, 9). При этом следует полагать, что режим введения двух доз с интервалом одна неделя является оптимальным (группа 10). В случае однократного режима введения антиген в количестве 4 мкг, но не 2 мкг (группа 8 в сравнении с группой 7), индуцирует высокие титры сывороточных антител HI, IgG1 и IgG2a и антител IgG1 в легком. Однако в сравнении с вариантом введения двух доз однократный режим не приводит к выработке антител IgG2a и IgA ни в легком, ни в носовых ходах (таблица 9).
В тесте на выявление защитной реакции (таблица 10) противогриппозная вакцина CCS-flu, вводимая и/н в однократном (4 мкг) или двукратном (2 мкг/дозу) режиме, создает полную защиту против вирусной инфекции (снижение титра вируса в легком на 6 log), тогда как стандартная вакцина снижает титр вируса только на 0,5-1 log. Таким образом, несмотря на то, что противогриппозная вакцина CCS-flu дает худшие результаты при однократном введении, чем в случае введения двух доз, по некоторым изотипам антител, оба режима обеспечивают аналогичный уровень защиты.
В данном эксперименте авторы также сравнивали варианты введения CCS в отдельности и CCS/Chol в качестве вакцинного носителя и не выявили разницы по иммуногенности между двумя композициями (данные не приведены). Другая модификация композиции включала снижение размера липидных структур СCS/Chol (диаметр 0,05-5 мкм) путем экструзии (диаметр ≤0,02 мкм). Титры антител, индуцируемые экструдированной вакциной, были на 50-80% ниже, чем титры, вызываемые неэкструдированной вакциной (данные не приведены). Таким образом, необработанные CCS липидные структуры при наличии или в отсутствие холестерина высоко эффективны как вакцинные носители для их применения в трехвалентной противогриппозной вакцине.
b - Титр HI в сыворотке определяют у каждой отдельной мыши через 35 дней после введения первой дозы вакцины. Титр HI в легких (при объединении) определяют на 42 день.
В скобках приведен процент мышей, у которых титр HI ≥40 и 0 обозначает титр HI <20.
(log 10)b
2
3
4
5
6
F-HN, 4 мкг × 1
F-HN, 2 мкг × 2
Lip(CCS/Chol)-HN, 4 мкг × 1
Lip(CCS/Chol)-HN, 2 мкг × 2
F-HN, 2 мкг+СТ (1 мкг) × 2
0
0, 7
0
0, 7
0, 7
5,5
5
0
0
0
b - Мышей инфицируют интраназально через 42 дня после введения первой дозы вакцины с использованием ~106 50% инфицирующей дозы для куриного эмбриона (EID 50), адаптированного к мышам химерного вируса X-127 (A/Bejing/262/95 [H1N1] × X-31 [A/Hong Kong/1/68 × A/PR/8/34]. Легкие отбирают через 4 дня, гомогенизируют, проводят серийное разбавление и инъецируют в аллантоис 10-дневных оплодотворенных куриных яиц. После инкубации в течение 48 часов при температуре 37°С и в течение 16 часов при температуре 4°С отбирают 0,1 мл аллантоиновой жидкости и проверяют наличие вируса по реакции гемагглютинации.
В эксперименте, описанном в таблицах 11 и 12, трехвалентную противогриппозную вакцину получают при использовании CCS/Chol объединенных липидных структур с использованием варьирующих количеств HN антигенов и липида. В данном эксперименте вакцины получают с использованием (а) варьирующих количеств антигена (0,25-2 мкг на штамм вируса) и липида (0,075-0,6 мг), поддерживая соотношение (мас./мас.) липид/HN постоянным на уровне 100/1; (b) повышающихся количеств антигена (0,25-2 мкг) и постоянного количества липида (0,6 мг), что приводит к варьированию соотношения (мас./мас.) липид/HN от 100/1 до 800/1. Как можно видеть из данных, приведенных в таблице 11 (титр HI) и таблице 12 (изотипные титры), вакцины, полученные при соотношении (мас./мас.) липид/HN, равном 100/1, с использованием 2 или 1 мкг антигена каждого штамма и 0,6 или 0,3 мг липида соответственно, создают высокие и близкие по значению уровни антител против 3 вирусных штаммов (группы 2, 3). При использовании более низких доз антигена (0,5, 0,25 мкг/штамм) и липида (0,15, 0,075 мг) ответ заметно снижается (группы 4, 5), особенно ответ слизистых оболочек (легкое/нос) (таблица 12). В случае использования постоянной дозы липида (0,6 мг), достигаются высокие уровни антител даже при использовании двух сниженных доз антигена (0,25, 0,5 мкг/штамм) (группы 6-8). Таким образом, количество CCS липида является решающим, и при выборе соответствующей дозы липида доза антигена может быть снижена в 4-8 раз (с 1-2 мкг до 0,25-0,5 мкг).
В еще одном эксперименте субъединичную противогриппозную вакцину либо в свободной форме (HN), либо в ассоциации с CCS/Chol объединенными липидными структурами (LipHN) исследуют на ее способность индуцировать перекрестную реакцию HI антител с различными подштаммами вирусов гриппа А и В, которые не включены в вакцину. Данные, приведенные в таблице 13, показывают, что интраназальная (и/н) и внутримышечная (в/м) вакцинации при однократном или двукратном проведении с использованием моновалентной или трехвалентной CCS-содержащей противогриппозной вакцины приводит к проявлению высоких сывороточных титров HI антител, направленных против штаммов, использованных для иммунизации, а также к перекрестной реакции HI антител с несколькими штаммами A/H1N1, A/H3N2 и B, которые циркулировали в 1986-1999 годах и не были включены в вакцину. Несколько более низкие титры HI были обнаружены после однократного и/н введения дозы вакцины (группа 6 против группы 7). Титры HI в гомогенате легкого (группа 4, 8) были ниже, чем соответствующие титры в сыворотке. Таким образом, парентеральная или интраназальная вакцинация с использованием CCS-содержащей вакцины может привести к созданию защиты против широкого спектра штаммов вируса А и B. Такие антигенные варианты могут возникать во время эпидемии/пандемии гриппа в результате антигенного дрейфа. И, наоборот, стандартная коммерческая вакцина, вводимая и/н (группы 1, 5), была полностью неэффективна в плане индукции антител против как гомологичных, так и гетерологичных штаммов.
Биологическое распределение анионных и катионных липосом, нагруженных HN и вводимых интраназально
В эксперименте по изучению биологического распределения вводят интраназально (200 мкг липида, 2 мкг антигена на мышь) мышам BALB/c 3 препарата объединенных липидных структур: DMPC/DMPG (анионные), DOTAP/Chol (катионные) и CCS/Chol (катионные), которые являются либо пустыми, либо содержащими HN антигены гриппа. Далее в гомогенатах различных тканей в течение 24 часов (в точках 1, 5 и 24 часа после введения) отслеживают флуоресцентно меченый липид.
Как показано в приведенной ниже таблице 14 и на фиг. 2A-2F, через 1 и 5 часов выявляют 75-100% введенного липида для всех трех исследуемых композиций. Однако уровень такого восстановления резко снижается в точке 24 часа для всех композиций, за исключением CCS-содержащей композиции. Данная CCS-композиция, содержащая HN антигены, характеризуется наибольшим временем удерживания (>24 часов) в 3 органах-мишенях (нос, легкие, ЖКТ), при этом не наблюдается накопления липида в мозге, а также значительного накопления в других исследованных органах (печень, почки, сердце, селезенка).
Биологическое распределение 125I-меченого HN при его введении похоже на распределение, показанное для флуоресцентного липида (данные не приведены). Длительное удерживание CCS вакцинных компонентов в дыхательных путях и желудочно-кишечном тракте можно объяснить, по крайнем мере частично, его более высокой иммуногенностью в сравнении с другими липосомальными композициями. Такой же результат был получен в приведенном ниже исследовании, в котором отслеживали антигенный компонент вакцины. HN белки метят 125I и вводят интраназально, либо в свободной форме, либо в ассоциации с одной из липидных композиций, используемых в экспериментах по исследованию биологического распределения флуоресцентной метки. Через 1, 5 и 24 часа после инстилляции определяют радиоактивность разных тканей.
В таблице 15 показано, что уровень восстановления антигена в данном эксперименте также высокий. Как показано на фиг. 3A-3D, картина биологического распределения 125I-меченого HN аналогична таковой для липида (фиг.2A-2F), а также следует, что (а) действительно имеется ассоциация in vivo между HN белками и объединенными липидными структурами и (b) пролонгированное удерживание антигена в носу при ассоциации с катионными объединенными липидными структурами может быть связана именно с катионными объединенными липидными структурами и не является свойством, присущим HN белкам, поскольку не отмечается такого удерживания HN, если вводят только один белок в растворимой форме.
Данный эксперимент также показывает, что накопление HN белка в мозге отсутствует при его введении как в отдельности, так и в ассоциации с объединенными липидными структурами (основной аспект безопасности касается интраназальной вакцинации). Поскольку метод отслеживания радиоактивной метки чувствительнее флуоресцентного метода, данный результат заслуживает большего доверия.
С целью определения, удерживается ли белок и липид и/или выводится из организма по механизму, характеризующемуся одинаковой или разной кинетикой в разных тканях, был проведен другой анализ полученных данных, где определяли соотношение между % удерживания антигена (от общей введенной дозы) и % удерживания липида в различных тканях в разные временные точки. Если указанное соотношение не меняется и примерно равно 1, это должно означать, что оба компонента удерживаются на близком уровне в одном и том же органе, тогда как если данный коэффициент больше или меньше 1, то это будет свидетельствовать о том, что кинетика клиренса компонентов отличается и один компонент может выводиться быстрее, чем другой.
Как можно видеть из приведенной ниже таблицы 16, единственным коэффициентом, который остается постоянным с течением времени, является коэффициент, определяющий соотношение CCS/Chol-HN в носовых путях (коэффициент соотношения=~0,45). Это дает основания полагать, что (а) высокий уровень удерживания антигена в носу при использовании CCS и DOTAP коррелирует с уровнем ассоциации и определяется связыванием данных композиций в слизистой носа, в отличие от DMPC/DMPG; и (b) в отличие от других композиций, компоненты которых распадаются в организме и выводятся с различными скоростями, композиция на основе CCS-HN остается стабильной, особенно в носовых путях, что может вносить вклад в более высокую иммуногенность, отмечаемую при использовании CCS-содержащих вакцин.
Предварительные исследования безопасности интраназальной противогриппозной вакцины
Токсичность (местная, системная) является основной проблемой как в случае в/м, так и и/н введения вакцин, в связи с чем было проведено соответствующее пилотное исследование токсичности. Катионные липидные композиции (на основе DMTAP, DOTAP и CCS), содержащие гриппозные антигены гемагглютинин+нейраминидазу (HN), вводят и/н (дважды, с интервалом в 1 неделю) мышам (n=4/группу) и через 72 часа проводят подсчет числа клеток крови (общий анализ крови, дифференциальный анализ крови), проводят химический анализ крови и гистологическое исследование (срезы из носа, легкого). У мышей не отмечается явных признаков токсичности. Результаты подсчета числа клеток крови и химического анализа укладываются в диапазон нормальных значений и, как ожидается, у мышей, которым вводятся катионные композиции, может наблюдаться воспалительная реакция в слизистой носа и легких, выраженная в степени от минимальной до слабой. У некоторых мышей, которым вводили солевой раствор в отдельности или с неинкапсулированным антигеном, отмечается аналогичная по характеру, но выраженная в меньшей степени воспалительная реакция.
Иммуномодулирующая активность CCS-содержащей противогриппозной вакцины применительно к мышам
В описываемых ниже экспериментах мышам инъецируют в/б разные липосомальные композиции (состоящие из DMPC, DMPC/DMPG, DOTAP/Chol, CCS/Chol), 0,5-1 мг липида, при наличии или в отсутствие HN антигенов. Мышей либо оставляют без дальнейшего воздействия, либо подвергают в/б инъекции тиогликолята (TG, для повышения продукции макрофагов) за 2 дня до инъекции липосомальных композиций. Перитонеальные клетки отбирают через 24-48 часов после введения липосом и используют в качестве таковых или после 4-часовой адсорбции при 37°С на пластиковых планшетах с последующим удалением неприлипших клеток. В других экспериментах перитонеальные клетки, взятые у TG-обработанных мышей, инкубируют с липосомальными композициями в течение 24-48 часов. Клетки также исследуют методом проточной цитометрии для оценки экспрессии главной системы тканевой совместимости MHC II, а также CD40 и B7 молекул, оказывающих совместное стимулирующее воздействие. Супернатанты исследуют на наличие цитокинов: интерферона γ (IFNγ), фактора некроза опухолевых клеток α (TNF α) и интерлейкина 12 (IL-12) и на наличие оксида азота (NO).
Все катионные композиции (CCS/Chol, DOTAP/Chol, DMTAP/Chol) оказывают положительную регуляцию экспрессии B7 и CD40, в большей степени, чем другие композиции (DMPC [нейтральная композиция], DMPC/DMPG [анионная композиция]), и индуцируют высокие уровни IFNγ и IL-12. В некоторых случаях CCS/Chol композиция оказывает более сильный эффект, чем другие катионные композиции. Ни одна из композиций не индуцирует значительных уровней TNFα и NO. Повышенная экспрессия молекул, оказывающих совместный стимулирующий эффект на антиген-презентирующие клетки, и индукция IL-12 и IFNγ при использовании катионных композиций, могут быть частично объяснены большей адъювантной активностью таких композиций. Приведенные результаты в сочетании с фактом длительного удерживания CCS-противогриппозной вакцины в дыхательных путях (фиг.2C и 2F, и фиг.3A-3D) после интраназального введения могут объяснить, почему CCS является таким эффективным носителем/адъювантом, применяемым в вакцинах, вносимых на слизистую.
Вирус гепатита А (HAV)
Способность CCS-содержащих объединенных липидных структур усиливать иммунный ответ исследовали с использованием, кроме противогриппозной вакцины, также HAV-вакцины, вводимой интраназально (и/н) и интраректально (и/р).
HAV вакцину (Аventis Pasteur) в количестве 10 МЕ (~1,5 мкг белка) вводят дважды с двухнедельным интервалом и через 3 недели после введения второй дозы исследуют ответ по методике иммуноферментного спот-анализа (ИФСА (ELISPOT)). CpG-OДН, используемый в качестве адъюванта для слизистой, вводят в количестве 10 мкг/дозу. HAV-CCS объединенные липидные структуры получают по методике, описанной выше применительно к противогриппозной вакцине (таблица 1).
Данные, приведенные в таблице 17, показывают, что тогда как коммерческая вакцина не способна индуцировать ответ по типу IgA в обеих исследуемых тканях (собственная пластинка (lamina propria) и пейеровы бляшки) и при использовании разных режимов введения (и/н и и/р), вакцина, полученная с использованием CCS или CpG-OДН, в большинстве случаев вызывает выраженный ответ. Сочетание объединенных липидных структур HAV-CCS и CpG-OДН приводит во всех случаях к синергическому ответу. Таким образом, CCS-содержащие объединенные липидные структуры как в отдельности, так и в особенности в сочетании с CpG-OДН, также эффективны в качестве носителя/адъюванта для вакцины против HAV, вводимой на слизистую.
HAV-CCS
HAV+CpG-OДН
HAV-CCS+CpG-OДН
12
16
139
27
22
68
0
0
28
1
14
23
C. BOTULINUM
В другом эксперименте мышей иммунизируют и/н дозой 0,4 мкг коммерческого анатоксина C. botulinum (в качестве модели для изучения биотеррористического агента, Uruguay, без алюма) и определяют титр антител методом ИФТФА через 4 недели после введения второй дозы вакцины.
Результаты эксперимента с использованием анатоксина C. botulinum обобщены в таблице 18, которая демонстрирует улучшенные свойства CCS-анатоксиновой композиции в сравнении со стандартной вакциной в случае и/н инстиляции, в особенности в том, что касается уровней IgA в тонком кишечнике и фекалиях. Ожидается, что такие антитела будут нейтрализовать токсин при пероральном введении. У мышей, иммунизированных и/н введением одной такой вакцины, не образуется IgA.
CCS-CBT
400
24
1600
0
1800
1800
МАТЕРИАЛЫ
Химический аспект
Синтез N-пальмитоил-D-эритросфингозил-1-карбамоилспермина (CCS)
(i) N-пальмитоилсфингозин (1,61 г, 3 ммоль) растворяют в безводном ТГФ (100 мл) при нагревании. Прозрачный раствор доводят до комнатной температуры и добавляют N,N'-дисукцинимидилкарбонат (1,92 г, 7,5 ммоль). Добавляют при перемешивании DMAP (0,81 г, 7,5 ммоль) и реакционную смесь перемешивают далее в течение 16 часов. Растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток рекристаллизуют из н-гептана с получением 1,3 г (68%) дисукцинимидилцерамидилкарбоната в виде белого порошка, Т.пл. 73-76°С.
(ii) Спермин (0,5 г, 25 ммоль) и дисукцинимидилцерамидилкарбонат (0,39 г, 0,5 ммоль) растворяют в безводном дихлорметане при перемешивании и далее обрабатывают каталитическим количеством 4-диметиламинопиридина (ДМАП). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов, растворитель выпаривают и остаток обрабатывают водой, фильтруют и сушат в вакууме с получением 0,4 г (82%) неочищенного материала, который дальше очищают колоночной хроматографией на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси бутанол:AcOH:H2O (60:20:20).
(iii) Для получения соединения на основе четвертичного амина продукт на стадии (ii) может быть подвергнут метилированию ДМС или CH3I.
Структуру CCS подтверждают с помощью 1H- и 13C-ЯМР спектрометрии (данные не представлены). Детальное описание анализа приведено в совместно рассматриваемой заявке на международный патент No_____.
Другие методы синтеза
Следующие процедуры также могут использоваться, как и описанная выше процедура:
Синтез линейного монозамещенного церамид-сперминового конъюгата, показанного на фиг.1А
Эквивалент церамида повергают реакции с 2,5 эквивалентами дисукцинимидилкарбоната в присутствии ДМАП с получением соответствующего 1,3-ди-О-сукцинимидильного производного.
Полученное таким образом дисукцинимидильное производное подвергают реакции с эквивалентом спермина при комнатной температуре с использованием каталитического количества ДМАП, получая 3-монозамещенный церамин-сперминовый конъюгат, показанный на фиг.1В.
Синтез линейного двузамещенного церамид-сперминового конъюгата, показанного на фиг.1В
Эквивалент 1,3-ди-О-сукцинимидилсфингоидного производного, полученного по описанной выше методике, подвергают реакции с 2,5 эквивалентами спермина при температуре 80°С в присутствии каталитических количеств ДМАП. При этом образуется 1,3-двузамещенный CCS.
Синтез конъюгата линейного двузамещенного церамида-разветвленного спермина, показанного на фиг.1С
Эквивалент 1,3-ди-О-сукцинимидилцерамидного производного, полученного по описанной выше методике, подвергают реакции с 2,5 эквивалентами альфа-омега-двузамещенного спермина при температуре 80°С в присутствии каталитических количеств ДМАП.
Защитную группу удаляют, получая 1,3-«разветвленный» двузамещенный церамид-сперминовый конъюгат.
Синтез конъюгата линейного двузамещенного церамида-циклического спермина, показанного на фиг.1D
Эквивалент 1,3-ди-О-сукцинимидилцерамидного производного, полученного по описанной выше методике, подвергают реакции с 0,75 эквивалентами спермина при температуре 80°С в присутствии каталитических количеств ДМАП.
Антигены гриппа
Препарат моновалентного субъединичного антигена, полученный из штамма гриппа A/New Caledonia/20/99-подобного (H1N1), был любезно предоставлен докторами Gluck и Zurbriggen, Berna Biotech, Берн, Швейцария. Данный препарат (обозначенный как HN) включает 80-90% гемагглютинина, 5-10 мас.% нейраминидазы и следовые количества NP и M1 белков. Коммерческая трехвалентная субъединичная вакцина (Fluvirin®) для применения в сезон 2003/2004 годов, содержащая HN из A/New Caledоnia/20/99 (H1N1), A/Panama/2007/99 (H3N2) и B/Shangdong/7/97, была получена от компании Evans Vaccines Ltd. (Liverpool, UK). Данную вакцину перед инкапсулированием концентрируют ~x8 (концентратор Эппендорфа 5301 (Eppendorf Concentrator 5301, Еppendorf AG, Hamburg, Germany)). Полный инактивированный вирус используют в некоторых экспериментах для стимуляции in vitro.
Липиды
Фосфолипиды (ФЛ) димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) и диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE) получают от компании Липоид ГмбХ (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany). Кроме липосом DMPC (нейтральные) и DMPC/DMPG (молярный коэффициент 9/1, анионные) готовят 6 композиций катионных липосом/объединенных липидных структур. Монокатионные липиды диметиламиноэтанкарбамоилхолестерин (DC-Chol), 1,2-дистеароил-3-триметиламмоний-пропан (хлоридная соль) (DSTAP), диолеил-3-триметиламмоний-пропан (хлоридная соль) (DOTAP) и димиристоил-3-триметиламмоний-пропан (хлоридная соль) (DMTAP) получают от компании Аванти Полар Липидс (Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)). Монокатионный липид диметилдиоктадециламмоний-бромид (DDAB) и холестерин (Chol) получают от компании Сигма (Sigma). Новый запатентованный поликатионный сфинголипид N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермин (ацетатная соль) (церамидкарбамоилспермин, CCS) получают от компании Биолаб Лтд. (Biolab Ltd., Jerusalem, Israel). Там, где это указано, используют хелперные липиды (DOPE, Chol) в молярном соотношении липид/хелпер, равном 1/1-4/1.
Мыши
В эксперименте были использованы особые беспатогенные (SPF) самки 6-8-недельных мышей BALB/c и 18-месячных мышей C57BL/6 (5-10 животных в группе). Животных поддерживают в условиях, способствующих сохранению SPF.
СПОСОБЫ
Инкапсулирование гриппозного антигена в липосомы/объединенные липидные структуры
HN антигены (см. выше) инкапсулируют в крупные (средний диаметр 0,1-5 мкм) гетерогенные (не сортированные) везикулы. Для получения всех вакцинных композиций обычно используют указанную ниже процедуру. Липиды (10-30 мг) растворяют в 1 мл третичного бутанола и затем стерилизуют фильтрованием (GF92, Glasforser, Vorfilter no. 421051, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany). Стерильный липидный раствор замораживают при температуре -70°С и далее лиофилизируют в течение 24 часов до полного высушивания. Высушенные липиды могут храниться при температуре 4°С в течение >2 лет без существенной (<5%) деградации липида или потери способности к «инкапсуляции». При необходимости липидный порошок гидратируют раствором антигена (в ФБР, pH 7,2) с использованием соотношения (мас./мас.) липид:антиген (белок) от 3/1 до 800/1. Раствор антигена добавляют ступенчато, каждый раз повышая добавляемое количество на 20-50 мкл и энергично перемешивают в вихревой мешалке после каждого добавления, доводя общий конечный объем до 0,5-1 мл. В некоторых экспериментах высушенные липиды гидратируют с использованием ФБР, и такие предварительно сформированные «пустые» объединенные липидные структуры смешивают с раствором антигена. Смесь перемешивают в вихревой мешалке в течение 1-2 минут и используют в течение 30-60 минут.
Для определения эффективности «инкапсуляции», в зависимости от вида композиции, могут быть использованы две процедуры, которые позволяют достичь ≥80% разделения свободного антигена и антигена, ассоциированного с липидом. В случае всех вакцинных композиций, за исключением CCS, используют приведенную ниже методику разделения. Объединенные липидные структуры (1-30 мг липида), содержащие HN антиген (50-100 мкг белка), суспендируют в 0,5 мл ФБР и осторожно наслаивают на 0,5 мл D2O (99,9%, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA). Затем указанный образец центрифугируют в течение 1 часа при температуре 30°С со скоростью 45000 об/мин. Свободный неинкапсулированный HN осаждается, тогда как входящий в состав структур (липосом) HN и безбелковые объединенные структуры/липосомы остаются в супернатанте. Собирают весь супернатант и объединенные структуры/липосомы растворяют при добавлении 0,2 мл теплого 10% Тритона X-100 к фракциям супернатанта и осадка. В обеих фракциях определяют концентрации белка по модифицированной методике Лоури. В случае CCS композиции CCS-HN суспендируют в 0,5 мл PBS-D2O (1 объем ФБР X10 + 9 объемов D2O), после чего смешивают с 0,5 мл ФБР. Далее смесь центрифугируют в течение 10 минут при 20°С со скоростью 10000 об/мин. CCS+/- антиген осаждается, тогда как свободный HN остается в супернатанте. Растворение липида и определение белка в обеих фракциях проводят по описанной выше методике. При использовании обеих методик разделения общий уровень восстановления HN антигенов достигает >95%.
Иммунизация
Вакцины со свободным HN (F-HN) и с HN, включенным в объединенные структуры/липосомы (Lip-HN), содержащие 0,25-4 мкг антигена/штамм/дозу и 0,075-1,2 мг липида/дозу, вводят либо один раз внутримышечно (в/м, в количестве 30 мкл), либо один или два раза интраназально (и/н, по 5-50 мкл в одну ноздрю) с интервалом 3, 7 и 14 дней, либо два раза перорально (в количестве 50 мкл) с интервалом 1 неделя. Во всех случаях мышей подвергают легкой анестезии с использованием 0,15 мл 4% хлоралгидрата в ФБР путем внутрибрюшинного введения. При пероральной вакцинации мышам дают в рот 0,5 мл антацидного раствора (8 частей сбалансированного раствора Хенка + 2 части 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия) за 30 минут до вакцинации. Холерный токсин (CT, Sigmа, USA) в количестве 1 мкг/дозу используют во всех экспериментах в качестве стандартного адъюванта для слизистой, для целей сравнительного анализа. В двух экспериментах используют в количестве 10 мкг/дозу в качестве адъюванта CpG-OДН (OДН 1018, любезно предоставленный д-ром E. Raz, Калифорнийский Университет, Сан Диего, Калифорния, США), в свободном виде и в виде липосом.
Оценка гуморальных ответов
Через 4-6 недель после вакцинации исследуют сыворотку, гомогенаты легкого и промывные жидкости из носовых ходов, анализируя образцы по отдельности или в объединенном виде, начиная с разбавления образца 1/10 или 1/20. Антитела, ингибирующие гемагглютинацию, определяют по стандартной методике ингибирования гемагглютинации (HI), начиная с разбавления образца 1/10. Мышей с титром HI ≥40 (который считается защитным титром для людей), рассматривают как способных к сероконверсии. Количества антигенспецифичных антител IgG1, IgG2a, IgA и IgE определяют по методу ИФТФА. Наивысшее разбавление образца, дающее поглощение на 0,2 ОП выше контроля (антиген + сыворотка от нормальной мыши, ОП <0,1), рассматривается как титр антитела при ИФТФА.
Оценка клеточных ответов
Спленоциты получают через 5-6 недель после вакцинации и исследуют на пролиферативную активность, продукцию IFNγ и IL-4, а также на цитотоксическую активность после антигенной стимуляции in vitro. Культуры выращивают при температуре 37°C в обогащенной среде RPMI 1640 или DMEM с добавкой 5% (для оценки пролиферации, продукции цитокинов) или 10% (для оценки цитотоксичности) фетальной сыворотки теленка (ФСТ) с содержанием 5×10-5M 2-меркаптоэтанола (для оценки цитотоксичности) или без него. Клеточные культуры обрабатывают следующим образом: (i) для оценки пролиферации клетки инкубируют в U-образных 96-ячеечных планшетах в количестве 0,5×106 клеток/ячейку, в тройном повторе, при наличии или в отсутствие антигена (0,5-5 мкг на ячейку) в конечном объеме 0,2 мл. Через 72-96 часов культуры подвергают пульсовой обработке
1 мкCi 3H-тимидина в течение 16 часов. Результаты выражают в виде Δимп/мин = (среднее число импульсов в минуту в случае клеток, культивированных с антигеном) - (среднее число импульсов в минуту в случае клеток, культивируемых без антигена). (ii) Для определения уровня цитокинов клетки инкубируют в 24-ячеечных планшетах в количестве 2,5×106 - 5×106 клеток/ячейку, в двойном повторе при наличии или в отсутствие антигена (5-10 мкг на ячейку) в конечном объеме 1 мл. Супернатанты собирают через 48-72 часа и исследуют методом ИФТФА на наличие мышиных IFNγ и IL-4 с использованием набора OptEIA (Pharmingen, USA). (iii) Для оценки цитотоксичности: реактивные спленоциты (2,5×106) инкубируют, как указано в п. (ii) в течение 7 дней вместе с равным количеством стимулирующих спленоцитов BALB/c, которые были инфицированы вирусом гриппа X/127(H1N1) (см. приведенное ниже описание). Используемые для инфекции спленоциты инкубируют при 37°С, изредка перемешивая в течение 3 часов в среде RPMI 1640 (без ФСТ) со спленоцитами, имеющими активность 150 единиц гемагглютинации по вирусу/1×106 спленоцитов, с последующей промывкой. Далее примированные эффекторные клетки подвергают повторной стимуляции в течение 5 дней с использованием инфицированных облученных (3000 рад) спленоцитов при соотношении эффекторных/стимуляторных клеток ј в присутствии 10 МЕ/мл rhIL-2. Цитотоксичность определяют в рамках стандартного 4-часового теста на высвобождение 51Cr при соотношении эффекторных/целевых клеток 100/1. В качестве меченых клеток-мишеней используют немодифицированные Р815 и Р815, подвергнутые пульсовой обработке в течение 90 минут при температуре 37°С 189-199 пептидом HA2 (IYSTVASSLVL, 20 мкг/1×106 клеток).
Оценка защитного иммунитета
Мышам под анестезией вводят суспензию живых вирусов по 25 мкл на ноздрю, ~107 EID 50 (50% инфицирующая доза для куриного эмбриона) с использованием химерного вируса Х-127 (A/Beijing/262/95 (H1N1) × Х-31 (A/Hong Kong/1/68 × A/PR/8/34), который является инфекционным для мышей и вступает в перекрестную реакцию с A/New Caledonia. Легкие на 4 день отбирают, промывают три раза холодным ФБР и гомогенизируют в ФБР (1,5 мл в расчете на легкие одной мыши, что рассматривается как разбавление 1/10). Гомогенаты легких из каждой группы животных объединяют, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 минут при температуре 4°С и собирают супернатанты. Проводят серийные 10-кратные разбавления и инъецируют по 0,2 мл каждого разбавления, в двойном повторе, в аллантоис куриных яиц с 11-дневными эмбрионами. После 48-часового выдерживания при температуре 37°С и 16 часов при 4°С отбирают 0,1 мл аллантоиновой жидкости и проверяют на наличие вируса в тесте на гемагглютинацию (в течение 30 минут при комнатной температуре) с использованием эритроцитов цыпленка (0,5 мас.%, 0,1 мл). Титр вируса в легком определяют как наибольшее разбавление гомогената легкого, продуцирующего вирус в аллантоиновой жидкости (позитивная гемагглютинация).
Биологическое распределение и фармакокинетика различных флуоресцентно меченых липидных композиций и радиоактивно меченого антигена HN
Мышей подвергают однократной вакцинации с использованием композиций лиссамин-родамин-меченых липидных структур, либо пустых, либо ассоциированных с трехвалентной субъединичной противогриппозной вакциной (HN), в объеме 20 мкл. Через 1, 5 или 24 часа мышей умерщвляют и отбирают разные органы. Органы хранят при температуре -20°С в течение ночи и на следующее утро гомогенизируют в буфере для лизирования. Далее 0,2 мл гомогената переносят в пробирки Эппендорфа, добавляют 0,8 мл изопропанола и откручивают в течение 15 минут для высвобождения флуоресцентной пробы в супернатант. 50 мкл супернатанта наносят на черные планшеты 384 и определяют уровень флуоресценции (длина волны эмиссии: 545, длина волны возбуждения: 596).
В другом тесте 450 мкг трехвалентной HN-содержащей вакцины (в 5 мл) диализуют против DDW (для обессоливания) и затем концентрируют в 1000 раз до 5 мкл. Затем белок разбавляют 0,1М боратным буфером (pH 8,5) до получения основного раствора, содержащего 450 мкг в 15 мкл. Далее белок метят по 125I с использованием реактива Bolton Hunter в соответствии с инструкциями производителя. Мышам вводят 125I-меченый HN (2 мкг) и через 1, 5 и 24 часа мышей умерщвляют, отбирают во флаконы разные органы (см. фиг.3) и определяют уровень радиоактивности в γ-счетчике, калиброванном на 125I.
Настоящее изобретение определяется приведенной ниже формулой изобретения, содержание которой должно рассматриваться как составная часть настоящего описания.
Изобретение относится к области медицины и касается применения сфингоид-полиалкиламинового конъюгата-N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермина (CCS) в качестве удерживающего средства для биологически активных молекул, таких как антигены. Изобретение также касается способа модуляции иммунного ответа у субъекта. В конкретном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против гриппа, включающую CCS и антигены вируса гриппа гемагглютинин и нейраминидазу. Преимущество изобретения заключается в усилении иммунного ответа. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 18 табл., 3 ил.
1. Фармацевтическая композиция для модуляции иммунного ответа у субъекта, содержащая (1) N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермин (CCS) и (ii), по меньшей мере, одну биологически активную молекулу, где указанная биологически активная молекула представляет собой иммуномодулятор, выбранный из молекулы аминокислоты, молекулы нуклеиновой кислоты или молекулы низкомолекулярного соединения.
2. Композиция по п.1, содержащая, по меньшей мере, один физиологически приемлемый носитель.
3. Композиция по п.1, где указанная модуляция включает стимуляцию или усиление иммунного ответа.
4. Композиция по п.1, где указанная биологически активная молекула при физиологическом значении рН имеет суммарный отрицательный дипольный момент или суммарный отрицательный заряд, или содержит, по меньшей мере, один участок, обладающий суммарным отрицательным зарядом.
5. Композиция по п.1, в которой указанная биологически активная молекула выбрана из антигенного белка, антигенного пептида, антигенного полипептида или углевода.
6. Композиция по п.1, в которой указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой олигодезоксинуклеотид (ОДН).
7. Композиция по п.1, содержащая иммуностимулирующее средство.
8. Композиция по п.1, в которой N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермин (CCS) образует липидные структуры.
9. Композиция по п.8, в которой N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермин (CCS) образует везикулы или мицеллы, или их сочетания.
10. Композиция по п.1 для вакцинации субъекта против вируса гриппа.
11. Композиция по п.10, в которой указанная биологически активная молекула получена из вируса гриппа или она представляет собой аналог молекулы, полученной из вируса гриппа.
12. Композиция по п.11, в которой указанная биологически активная молекула представляет собой сочетание гемагглютинина и нейраминидазы (HN).
13. Композиция по любому из пп.1-12 в дозированной форме, пригодной для интраназального или внутримышечного введения.
14. Способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.1-13.
15. Способ по п.14, включающий интраназальное или внутримышечное введение указанной фармацевтической композиции.
16. Способ по п.14, включающий введение иммуностимулирующего средства одновременно или в течение определенного интервала времени перед введением или после введения указанной фармацевтической композиции.
17. Способ по п.16, включающий интраназальное или внутримышечное введение указанных иммуностимулирующего средства и фармацевтической композиции.
18. Вакцина против гриппа, содержащая N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермин (CCS) в сочетании с гемагглютинином и нейраминидазой.
19. Способ модуляции у субъекта иммунного ответа на вирус гриппа, включающий введение указанному субъекту N-пальмитоил-D-эритросфингозилкарбамоилспермина (CCS) вместе с антигеном гриппа.
Приоритет по пунктам:
17.06.2004 по пп.7, 16 и 17;
18.06.2003, 25.09.2003, 21.01.2004, 19.02.2004 по пп.1-6, 8-15, 18 и 19.
| ИНФРАЗВУКОВАЯ УСТАНОВКА | 0 |
|
SU394111A1 |
| US 6075012 A, 13.06.2000 | |||
| Прибор, замыкающий сигнальную цепь при повышении температуры | 1918 |
|
SU99A1 |
