СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИФИДУМБАКТЕРИНА КОНЦЕНТРИРОВАННОГО Российский патент 1997 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и применяется:
для комплексного лечения желудочно-кишечных заболеваний, пневмонии, сепсиса и других гнойно-инфекционных заболеваний;
для лечения недоношенных детей;
для беременных женщин и кормящих матерей;
при заболеваниях коклюшем, рахитом, анемией, диатезом;
при дисбактериозе кишечника, возникшем как следствие длительной антибактериальной, гармональной, лучевой химиотерапии;
при стрессовых ситуациях и пребывании в экстремальных условиях.

Известен способ получения бифидумбактерина, выбранный в качестве прототипа заявляемого решения, при котором для получения маточной культуры ампулу или флакон с лиофилицированным штаммом B.bifidum 791 разводят изотоническим раствором хлорида натрия. Полученную взвесь переносят в два 0,5-литровых флакона, содержащих по 0,3 л модифицированной печеночной среды Блаурокка.

Посевы выдерживают в термостате при температуре 38^o ±1^oC в течение 48 ч. Культуру из флаконов пересевают в 5- литровую бутыль с 5 л печеночной среды.

Посевы инкубируют при температуре 38^oC ±1^oC в течение 24 ч. Культуру из бутыли через вмонтированный в ней сифон засевают в десять бутылей с печеночной или гидролизатно-молочной средой. Посевы инкубируют в течение 18 ч при температуре 38^o±1^oC. По истечении срока инкубации осадок из бутыли отсасывают в бутыль емкостью 18-20 л через сифон.

После отстаивания микробной взвеси в большой бутыли в течение 30-40 мин производят повторный отсос осадка в другую бутыль такой же емкости (для разлива), куда затем добавляют среду высушивания: 80%-ный раствор сахарозы, 8% -ный раствор желатина и обезжиренное молоко.

Затем культура разливается во флаконы 2-5 мл (1 мл 1 доза), замораживается при 40-45^oC не менее 48 ч и переносится в аппарат для лиофильной сушки, при этом длительность процесса высушивания составляет 50-60 ч. (См. Регламент производства бифидумбактерина сухого N 214-81. Утвержден начальником Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Министерства здравоохраненияСССР, Москва, 1981г. с.5-12).

Недостатками технического решения, принятого за прототип, являются:
культура выращивается без корректировки рН, что препятствует полному использованию питательной среды и получению максимального количества биомассы;
микробные клетки высушиваются в среде выращивания вместе с продуктами метаболизма (уксусная кислота, молочная, янтарная), которые отрицательно действуют на клеточную оболочку микробной клетки, что сказывается на ее жизнеспособности;
производство бифидумбактерина по данному способу требует больших затрат электроэнергии, сырья для приготовления среды высушивания.

Предлагаемый способ получения бифидумбактерина концентрированного направлен на улучшение качества получаемого изделия, а именно, изготавливаемый этим способом препарат стабилен по показателю жизнеспособности. Предлагаемый способ по сравнению с известным более экономичен (уменьшается расход реактивов, посуды, упаковки).

Для решения данного вопроса в известный способ вводят раститровку лиофилизированной культуры из ампулы методом десятикратных разведений и производят отбор отдельных типичных изолированных колоний, что повышает жизнеспособность, активность кислотообразования, антагонистическую активность и исключает возможность контаминации посторонней микрофлорой при пересеве лиофилизированной культуры из ампулы во флаконы.

Таким образом, предлагаемый способ получения бифидумбактерина концентрированного соответствует критерию "новизна".

Использование в заявленном способе для концентрирования биомассы метода центрифугирования позволяет сократить время концентрирования, обеспечить полную стерильность и достичь наименьшего механического повреждения микробных клеток. При этом, за счет сокращения времени замораживания и лифильной сушки препарата значительно сокращается потребление электроэнергии.

Вышеуказанное позволяет утверждать, что предполагаемое решение удовлетворяет требованию изобретательского уровня.

Заявляемый способ получения бифидумбактерина концентрированного заключается в том, что лиофилизированную культуру штамма из ампулы раститровывают до отдельных типичных колоний, производят наращивание биомассы, центрифугируют, добавляют среду высушивания и микробную суспензию разливают. Далее препарат замораживают и осуществляют его лиофильную сушку.

Заявляемый способ реализуется следующим образом. Ампулу с лиофилизированным штаммом вскрывают стерильно и вносят 1,5 мл среды Блаурокка. Полученную взвесь титруют в ряду десятикратных разведений до 10^-7 - 10^-8 разведения, чтобы получить изолированные колонии. Посевы выдерживают в термостате при температуре 38^o ± 1^oС в течение 24 ч.

После инкубации отбирают пробирки с отдельными типичными колониями и пересевают 45-50 колоний во флакон с 300 мл среды Блаурокка. Посевы выдерживают при температуре 38^o ± 1^oС в течение 18-22 ч.

Затем культуру из флакона используют для засева в бутыль с 3,5 л среды ГМ. Культуру инкубируют при температуре 38^o ± 1^oС в течение 5-6 ч и пересевают в ферментер с 22 л ГМ среды. Процесс выращивания в ферментере идет при постоянном перемешивании с корректировкой рН в пределах 6,5 7,0 с подкормкой глюкозой при температуре 38^o ± 1^oС. Конец процесса культивирования устанавливается по оптической плотности. По окончании выращивания рН в культуре устанавливают 7,2-7,4. Длительность наращивания биомассы в ферменте составляет 14-16 ч.

По окончании процесса выращивания биомассу стерильно перекачивают в 0,5 л стеклянные флаконы по 400 мл. Флаконы закрывают резиновыми пробками и передают на центрифугирование. Флаконы с биомассой вставляют в алюминиевые стаканы для центрифугирования. В стакан наливают дистиллированную воду до уровня культуры во флаконе. Стаканы уравновешивают между собой на весах при помощи воды и устанавливают в центрифугу. Центрифугирование проходит при 2,5 тыс. об/мин в течение 15 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость при помощи сифонных трубок и перистальтического насоса отсасывают, осадок из всех флаконов при помощи перистальтического насоса собирают в стерильную бутыль, куда добавляют обрат молока и концентрированную сахарозомелатиновую среду. Все тщательно перемешивают. Среду высушивания добавляют в таком количестве, чтобы в конечной суспензии было 15-25% обрата молока, не менее 1% желатина; не менее 7% сахарозы.

Из 25 л суспензии выходит концентрированной биомассы со средой высушивания 2,5-2,8 л.

Микробную массу разливают во флаконы марки ФО 10 по 1-1,2 мл, что составляет 10 доз, при помощи разливочной машины.

Препарат замораживают в течение 4-6 ч при температуре -50^oC, и переносят в аппарат для лиофильной сушки. Процесс высушивания продолжают в течение 24-30 ч.

Изобретение относится к медицине.

Сущность изобретения сводится к тому, что лиофилизированная культура бифидумбактерина, штамма из ампулы, раститровывается до отдельных типичных колоний. Производится наращивание биомассы и ее концентрирование методом центрифугирования, добавляется среда высушивания и микробная суспензия разливается, затем препарат замораживается и подвергается лиофильной сушке.

Способ получения бифидумбактерина концентрированного путем посева лиофилизированной культуры штамма из ампул на печеночную среду во флаконы, добавления к нативной микробной взвеси среды высушивания, разлива микробной суспензии и лиофильной сушки препарата, отличающийся тем, что лиофилизированную культуру штамма из ампулы раститровывают до отдельных типичных колоний и биомассу перед заморозкой и лиофильной сушкой концентрируют методом центрифугирования.