СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОЗРАСТОСПЕЦИФИЧНЫХ БИФИДОПРЕПАРАТОВ Российский патент 1999 года по МПК A23C9/12 A61K35/74 C12N1/20 

Изобретение относится к медицине, пищевой промышленности и биотехнологии и касается технологии получения лечебно- профилактических препаратов-эубиотиков, содержащих живые бифидобактерии.

Нарушение качественного и количественного состава нормофлоры, называемое дисбактериозом, приводит к заболеваниям органов пищеварения, системы кроветворения, иммунной системы, развитию гипотрофии, анемии. По данным Министерства здравоохранения 90% населения России в той или иной степени страдают дисбактериозами. Широкое распространение дисбактериозов является одним из важнейших факторов, определяющих ныне наблюдаемое увеличение частоты и тяжести острых и хронических заболеваний.

Дисбактериоз лечится применением специфических препаратов-эубиотиков, в которых используются живые микроорганизмы - представители нормальной микрофлоры кишечника человека. Нормофлора кишечника представляет собой симбиоз различного рода микроорганизмов, наиболее значимыми из которых являются бифидо- и лактобактерии. Бифидобактерии, составляя от 80 до 95% нормофлоры кишечника, играют важнейшую роль в жизнедеятельности организма человека, подавляя рост патогенных, гнилостных и газообразующих микроорганизмов, участвуя в обмене веществ и синтезе витаминов, стимулируя иммунную систему.

Учитывая вышеизложенное, наиболее эффективными препаратами для лечения и профилактики дисбактериозов являются бифидосодержащие препараты.

Известен способ получения сухого бифидумбактерина, включающий введение посевной дозы культуры бифидобактерий одного вида - Bifidobacterium bifidum в питательную среду, содержащую панкреатический гидролизат молока, пептон, хлористый натрий, лактозу, цистин солянокислый и агар с последующим выращиванием культуры при температуре (38±1)^oC до получения сгустка, внесение защитной среды, содержащей сахарозу от 0.45 до 0.9% и желатин от 0.05 до 0.1%, фасовку и лиофильную сушку готового продукта (Фармстатья ФС 42-132BC-94). Доза сухого бифидумбактерина содержит 1•10⁷ живых клеток. Препарат применяют у детей с первых дней жизни, а также у взрослых людей. Противопоказаний к применению бифидумбактерина нет, побочных явлений не наблюдается.

Однако клиническая практика показала невысокую эффективность монопрепаратов при лечении глубоких нарушений микробиоценоза кишечника, когда появляются нетипичные формы нескольких видов патогенных микроорганизмов-симбионтов [1] . Сухой бифидумбактерин содержит лиофильно высушенные бактерии только одного вида B.bifidum, которые находятся в состоянии анабиоза и обладают пониженной адгезионной активностью, вследствие чего сухой бифидумбактерин не обладает достаточной клинической эффективностью.

Известен способ получения комплексного препарата "бификол- форте", содержащего лиофильно высушенную смесь совместно выращенных бифидобактерий и кишечной палочки штамма М 17. Способ включает введение посевных доз культур бифидобактерий и кишечной палочки в соотношении 1:1 в питательную среду с последующим выращиванием культур при температуре (38±1)^oC до получения сгустка, внесение защитной среды, содержащей сахарозу от 0.45 до 0.9% и желатин от 0.05 до 0.1%, фасовку и лиофильную сушку готового продукта (Временная Фармстатья ВФС 42-65BC-86).

Однако при применении препарата "Бификол-форте" могут наблюдаться негативные последствия его влияния на организм человека. Это связано с изменчивостью кишечной палочки при ее культивировании и лиофильной сушке препарата, которая может привести к возникновению патогенных форм этого вида бактерий. По мнению ряда ведущих микроэкологов мира, допустимо использовать в препаратах только инактивированные штаммы кишечной палочки [2].

Известен способ получения комплексного препарата "Бифиформ", производства фирмы Ferrosan, включающего введение в питательную среду и культивирование смеси бифидобактерий и энтерококков с последующей лиофильной сушкой полученной биомассы. В готовом препарате содержится бактериальных клеток каждой из названных культур 10⁷ КОЕ в 1 г препарата, расфасованного в капсулы [3].

Однако данный препарат в своем составе имеет один вид бифидобактерий, что в недостаточной степени отвечает физиологическим и возрастным параметрам организма человека, в биоценозах слизистых которого одновременно присутствуют несколько видов бифидобактерий, количественное содержание которых в 10-30 раз выше, чем энтерококков.

Известен способ получения комплексного кисломолочного продукта, включающий введение в стерильное молоко стимуляторов роста и посевной дозы производственной закваски в количестве 5-20 мас.%, находящейся в стадии роста и содержащей бактерии-эубиотики вида Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve или Bifidobacterium infantis. Культивирование проводят до количества бактерий более 10⁸ клеток на мл, после чего продукт охлаждают и фасуют в тару (Заявка ЕПВ N0154614, МПК A 23 C 9/123, опубл. 11.09.85).

Известен способ получения лечебно-профилактического препарата кисломолочного продукта "Номофлор", включающий нормализацию, гомогенизацию, термическую обработку исходного молочного сырья, охлаждение до температуры заквашивания, деоксигенацию, внесение закваски, содержащей бифидобактерии, сквашивание, охлаждение, расфасовку. В качестве закваски используют смесь из Bifidobacterium longum В-379 М, Bifidobacterium bifidum 791 и кефирных грибков в соотношении 1: 1:0,5 соответственно (Патент РФ N2100936, МПК⁶ A 23 C 9/127, опубл. 10.01.98).

Однако препараты, приготовленные двумя указанными выше способами, обладают недостаточными лечебно-профилактическими свойствами, т.к. они не учитывают возраст пациентов, употребляющих эти препараты, и требования физиологичности.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения кисломолочного бифидопрепарата "Bifi-life", включающий введение производственной закваски на основе консорциума штаммов бифидобактерий видов Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium adolescentis, содержащихся в соотношении 1:1:1:1:1, в питательную среду на основе обезжиренного восстановленного молока и культивирование консорциума бактерий при температуре (38±1)^oC в течение 5 часов до получения сгустка с биотитром 10⁹ КОЕ/мл, охлаждение продукта с последующей его фасовкой или лиофильной сушкой (патент РФ N2109054, МПК C 12 N 1/20, A 23 C 9/12, A 61 K 35/74, опубл. 20.04.98).

Однако вследствие того, что разные виды бифидобактерий в молоке растут с разной скоростью, наивысшей из которых обладает вид B.adolescentis, чуть медленнее растет вид B.longum, у остальных же скорость роста в молоке существенно меньше, то в получаемом продукте превалируют бифидобактерии вида B. adolescentis, что резко снижает лечебно-профилактические свойства данного продукта. Кроме того, препарат, приготовленный по указанной технологии, не учитывает возраст пациента, употребляющего этот препарат, т.к. содержит штаммы бифидобактерий, содержащиеся в организме людей всех возрастов (от новорожденных до пожилого возраста), вследствие этого он не отвечает требованиям физиологичности. Причем использование такого количества штаммов бифидобактерий в одном препарате значительно усложняет технологию его получения.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такой технологии получения бифидопрепаратов, которые учитывали бы возраст пациентов и содержали бы совокупность нескольких видов бифидобактерий: B.bifidum, B.longum, B.breve, или В. infantis, или B.adolescentis в процентном соотношении, соответствующем видовому составу нормофлоры кишечника здорового человека определенного возраста.

Указанная задача решается тем, что в способе получения возрастоспецифичных бифидопрепаратов, включающем приготовление закваски путем культивирования бифидобактерий видов Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, или Bifidobacterium infantis, или Bifidobacterium adolescentis в питательной среде с последующим внесением в нее защитной среды и лиофильной сушкой или приготовление кисломолочного продукта в жидкой форме путем внесения в пастеризованное молоко посевной дозы полученной закваски в количестве не более 5% от объема питательной среды и повторное культивирование указанных видов бифидобактерий при температуре (38±1)^oC до получения сгустка, охлаждение продукта с последующей его фасовкой, согласно изобретению при получении закваски и кисломолочного продукта в жидкой форме каждый вид бифидобактерий культивируют раздельно до получения биомасс с титром не менее 10⁹ КОЕ/мл и объединяют перед сушкой закваски или перед фасовкой биомассы кисломолочного продукта бифидобактерий с получением продукта в виде смеси указанных видов бифидобактерий, причем при получении препаратов для детей после рождения и до возраста 3-5 лет используют бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve или Bifidobacterium infantis, а при получении препарата для детей старшего возраста и взрослых используют бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium adolescentis, кроме того, соотношение биомасс отдельных видов бифидобактерий в препарате устанавливают соответствующим видовому соотношению их в кишечнике здорового человека определенного возраста, полученному на основе статистического массива данных, обработанных методами математической статистики и регрессионного анализа.

При получении препарата для детей после рождения и возраста 3-5 лет устанавливают следующее соотношение биомасс отдельных видов бифидобактерий в препарате, мас.%:
Bifidobacterium longum - 38,0-52,0
Bifidobacterium bifidum - 30,0-42,0
Bifidobacterium breve или Bifidobacterium infantis - остальное до 100%
При получении препарата для детей старшего возраста и взрослых устанавливают следующее соотношение биомасс отдельных видов бифидобактерий в препарате, мас.%:
Bifidobacterium longum - 32,0-42,0
Bifidobacterium bifidum - 29,0-39,0
Bifidobacterium adolescentis - остальное до 100%
При получении закваски питательная среда содержит восстановленное обезжиренное молоко, имеет сухой остаток 12-13%, панкреатический гидролизат молока, автолизат пекарских дрожжей и аскорбиновую кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.%:
панкреатический гидролизат молока - 4.5-5.0%,
автолизат пекарских дрожжей - 0.5-1.5%,
аскорбиновая кислота - 0.003-0.005%,
восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12-13% - до 100%
Более высокий % содержания сухого остатка молока в питательной среде 12-13% вместо рекомендованных 8-9% позволит добиться повышения сроков выживаемости бифидобактерий при хранении препаратов и кисломолочной продукции. Кроме того, высокий % содержания сухого остатка молока позволяет повысить биологическую ценность заквасок, поскольку общая сбалансированность веществ молока характеризуется антисклеротической направленностью и содержит дефицитную арахидоновую кислоту и белково-лецетиновый комплекс.

Для создания эффективных рецептур лекарственных бифидопрепаратов и лечебно-диетических кисломолочных продуктов используется зависимость, полученная математической обработкой данных клинических исследований по видовому составу бифидофлоры кишечника в зависимости от возраста пациентов.

У детей первого года жизни 85-95% всего микробиоценоза толстой кишки составляет бифидофлора - содержание бифидобактерий в 1 г фекалий достигает десятков миллиардов (lg10). Бактероиды несвойственны детям первого полугодия жизни. Количественное содержание лактобацилл, энтерококков, молочнокислых стрептококков и кишечных палочек (аэробная микрофлора) не превышает 10%. Для эубиоза взрослого человека также характерно доминирование бифидобактерий (80-90% или lg8-10) в общем составе нормофлоры. Лактобациллы, молочнокислые стрептококки, энтерококки и кишечная палочка выделяются примерно в равных количествах (lg6.6-7). Таким образом, среди представителей нормальной микрофлоры кишечника доминируют представители рода Bifidobacterium, включающего 11 видов бифидобактерий. Именно бифидобактерии играют определяющую роль в регуляции и стабильности биоценоза желудочно-кишечного тракта и слизистых.

Осуществляя полезную для организма физиологическую роль, бифидофлора повышает его сопротивляемость заболеваниям. При создании бифидосодержащих препаратов из штаммов различных видов требуется понимание механизмов их действия на организм и знаний биологии самих бактерий рода Bifidobacterium.

Ниже приведены этапы конструирования возрастоспецифичных бифидопрепаратов.

Этап 1. Методика математической обработки статистических данных, касающихся видового состава и количественного содержания бактерий-эубиотиков в организме человека, с последующим их использованием при конструировании препаратов.

При изучении видовой структуры бифидобактерий, выделенных от детей грудного возраста и взрослых (см. табл. 1), было установлено [4], что для новорожденных и младенцев, находящихся на грудном вскармливании, характерны виды B. bifidum и B. longum, частота обнаружения которых колеблется в пределах 40-60%. Вид B.adolescentis ни разу не обнаруживался у детей, находящихся на грудном вскармливании. Данный вид встречается только у недоношенных, находящихся на искусственном вскармливании и у страдающих гнойно-септическими заболеваниями. У таких детей снижена частота обнаружения B.bifidum, который наиболее физиологичен организму ребенка. В биоценозе кишечника здоровых взрослых людей выделялись три вида бифидобактерий: B.bifidum, B.longum и B. adolescentis. Все виды бактерий встречались в ассоциации друг с другом, как правило, это - B.bifidum и В. longum в сочетании с другими штаммами [4].

Клиническими исследованиями [4-9] было установлено, что видовой состав бифидофлоры неодинаков и претерпевает изменения в зависимости от возраста, характера питания и ряда других физиологических факторов. Бифидофлора здорового грудного ребенка, вскармливаемого материнским молоком, представлена видами: B.bifidum - от 35 до 39 %, B.longum - около 42-45 %, B.breve - от 14 до 17%, B.infantis - до 12% и B.adolescentis - до 1.5% или не обнаруживается совсем [5,7,8,9]. У детей, находящихся на искусственном вскармливании, частота обнаружения в кишечнике B.adolescentis достигает от 22% до 48% при снижении и даже вытеснении других видов бифидобактерий. Некоторые исследователи рассматривают это состояние, как предвестник развивающегося дисбактериоза [9] . К 7 годам из кишечника ребенка исчезают виды B.breve и B.infantis. У детей старшего возраста и у взрослых в кишечнике встречаются преимущественно B.bifidum, B.longum и B.adolescentis, последний после 35 лет начинает превалировать, достигая 60-85% в пожилом возрасте [8,9].

В процессе поиска перспективных пробиотиков многими исследователями было установлено, что оптимальным клиническим эффектом обладают препараты, по своему составу приближенные к физиологическим параметрам кишечника и изготовленные на основе нескольких видов бифидобактерий, дополняющих друг друга по функциональному значению. В процессе исследований проведена статистическая обработка литературных данных [2, 4, 6-9] о видовом составе бифидофлоры в зависимости от возраста человека с уровнем достоверности 90%, в том предположении, что имеющаяся выборка отражает генеральную совокупность, распределенную нормально. Это означает, что при равенстве интеграла вероятности величине 0.9
(1)
квантиль x, который используется для определения границ доверительного интервала, согласно таблице интеграла вероятности равен 1.64 [10].

Операции по вычислению границ доверительных интервалов при определении средних значений процентного соотношения видов бифидобактерий в биоценозах заключались в следующем:
1) вычислялись средние величины показателей в определенном временном интервале согласно
(2)
где n - число данных, принятых для расчета;
2) вычислялись среднеквадратические отклонения для каждого случая согласно
(3)
3) вычислялись границы доверительных интервалов случайных погрешностей, в котором x = 1.64, согласно (1)
(4)
Далее по статистически обработанным данным для каждого из видов бифидобактерий B. bifidum, B.longum, B.adolescentis, B.breve и B.infantis проводились вычисления значений функции f{% (P), возраст (x)}, т.е. выполнялась операция интерполяции методом Ньютона, согласно [11]:
1) При двух известных значениях P₀=f(x₀) и P₁=f(x₀+h) получается интерполяционный многочлен первой степени, описывающий наклонную прямую
(5)
2) Соответствующее приближенное значение интеграла дает суммарное изменение % содержания определенного вида бифидобактерий в биоценозе ЖКТ за промежуток h лет
(6)
3) При 3 известных значениях P₀=f(x₀), P₁=f(x₀)+h) и P₂=f(x₀+2h) получается интерполяционный множитель 2 степени, описывающий параболу
(7)
4) Данные рассуждения можно обобщить на произвольное число равноотстоящих значений x - при 4 известных значениях получается многочлен
(8)
Таким образом составлялись интерполяционные многочлены, которые были обсчитаны методом Ньютона для нелинейных задач в Microsoft Exel при следующих параметрах поиска решения: 1) число итераций - 100, 2) автоматическое нормирование параметров, качественно различающихся по величине, 3) точность расчетов - 0.001.

Далее, для того, чтобы сгладить случайные флуктуации, яснее представить модель и проследить характер изменения данных, была использована полиноминальная аппроксимация этих данных по методу наименьших квадратов в соответствии с уравнением
p = b +c₁x+c₂x²+c₃x³+... +c₆x⁶ (9)
где b, c₁, c₂...c₆ -являются константами
Аппроксимация интерполированных данных в Microsoft Exel. Обработанные таким образом данные отражают частоту обнаружения определенного вида бифидобактерий в биоценозе кишечника у детей и взрослых различного возраста. Поскольку все эти виды встречаются, как правило, в ассоциации друг с другом, то логично предположить, что если отнормировать частоту обнаружения всех видов бифидобактерий к 1 (или 100%), то нормированная частота обнаружения будет отражать среднестатистическое соотношение различных видов бифидобактерий в биоценозе кишечника. Условия нормирования
(10)
где
i - индекс возраста,
A_i...F_i - аппроксимированная частота обнаружения видов бифидобактерий B. bifidum, B.longum, B.adolescentis, В.breve и B.infantis,
a_i. . . f_i - среднестатистическое содержание соответствующих видов бифидобактерий в биоценозе кишечника
Таким образом были найдены данные о видовом соотношении B.bifidum, B.longum, B.adolescentis, B.breve и B.infantis для возрастов в 1, 7, 15, 30, 50 и 70 лет, которые приведены в табл. 2. Относительные погрешности расчетных данных составили 5%, 5%, 6%, 8% и 8% для соответствующих видов.

Завершающим этапом работы явилось построение линий трендов для каждого вида бифидобактерий при помощи Microsoft Exel. Величины погрешностей для этих линий трендов рассчитывались в соответствии с критерием R² согласно
(11)
Построенные таким образом линии тренда - графические зависимости приведены на фиг. 1 и представляют собой распределение видов бифидобактерий в биоценозе кишечника в зависимости от возраста.

Полученные зависимости позволяют обоснованно конструировать рецептуру эубиотиков в зависимости от назначения и возраста пациента. Как видно из фиг. 1, видовой состав бифидофлоры взрослых и детей (особенно младшего возраста) существенно различается. Поэтому при конструировании комплексных бифидосодержащих препаратов для детей или взрослых необходимо учитывать возрастные изменения флоры кишечника. Соответственно должны различаться разрабатываемые рецептуры лекарственных бифидопрепаратов и лечебно-диетических кисломолочных продуктов и соответствовать видовому распределению бифидобактерий в биоценозах кишечника в зависимости от возраста.

Например, для детей в возрасте до 3-х лет желательно, чтобы лечебно-профилактические пищевые добавки содержали бифидобактерии B.bifidum 36±6%, B.longum 45±7% и B.breve 12±3% и B.infantis 7±2%.

Для лекарственных форм бифидопрепаратов желательно, чтобы соотношение B. bifidum и B.longum соответствовало видовому составу кишечника здорового человека в возрасте 18-23 лет. С клинико-физиологической точки зрения препарат такого состава будет универсален для взрослых и детей старшего возраста.

Этап 2. Технология приготовления возрастоспецифичных бифидопрепаратов с использованием графика, представленного на фиг. 1.

Пример 1.

Для приготовления сухого комплексного препарата для детей от рождения до младшего возраста (до 3-5 лет) соотношение видов бифидобактерий соответствует количественному составу нормофлоры ребенка в возрасте до 1 года. Пользуясь графиком на фиг. 1, в препарате устанавливают следующие виды бифидобактерий и их количественное соотношение: B.longum - 49%, B.bifidum - 39%, B.breve - 12%.

Флаконы, содержащие лиофильно высушенные бифидобактерий видов B.bifidum, B. longum и B.breve, вскрывают стерильно, разводят 5 миллилитрами 0.9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси переносят стерильно (каждую отдельно) в пробирки со стерильной модифицированной печеночной средой Блаурокка и инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч. Полученные таким образом культуры бактерий первой генерации раздельно вводят в количестве 3-5% (от объема питательной среды) в стеклянные бутылки с питательной средой следующего состава:
панкреатический гидролизат молока - 4.5-5.0%,
автолизат пекарских дрожжей - 0.5-1.5%,
аскорбиновая кислота - 0.003-0.005%,
восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12-13% - до 100%
Посевные дозы каждого вида бифидобактерий инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч до образования сгустка с биотитром не менее 10⁹ КОЕ/мл и кислотностью не более 120-160^oT.

Содержимое бутылей каждого вида бифидобактерий стерильно смешивают в указанных выше пропорциях (B.longum - 49%, B.bifidum -39%, B.breve - 12%), корректируют pH до значения 7.0 при помощи 5% раствора аммиака, вносят сахарозу от 0.45 до 0.9% и желатин от 0.05 до 0.1%, разливают мерно по 2-3 мл в пенфлаконы емкостью 10 мл и подвергают лиофильному высушиванию. Таким образом, получают комплексный сухой бифидопрепарат для детей от рождения до возраста 3-5 лет.

Пример 2.

Для приготовления сухого комплексного препарата для детей от рождения до младшего возраста (до 3-5 лет), пользуясь графиком на фиг. 1, устанавливают следующие виды бифидобактерий и их количественное соотношение в препарате: B.longum - 50%, B.bifidum - 41%, B.infantis - 9%.

Флаконы, содержащие лиофильно высушенные бифидобактерии видов B.bifidum, B.longum и B.infantis, вскрывают стерильно, разводят 5 миллилитрами 0.9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси переносят стерильно (каждую отдельно) в пробирки со стерильной модифицированной печеночной средой Блаурокка и инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч. Получаемые таким образом культуры первой генерации раздельно вводят в количестве 3-5% (от объема питательной среды) в стеклянные бутылки с питательной средой следующего состава:
панкреатический гидролизат молока - 4.5-5.0%,
автолизат пекарских дрожжей - 0.5-1.5%,
аскорбиновая кислота - 0.003-0.005%,
восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12-13% - до 100%
Посевные дозы каждого вида бифидобактерий инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч до образования сгустка с биотитром не менее 10⁹ КОЕ/мл и кислотностью не более 120-160^oT.

Содержимое бутылей каждого вида бифидобактерий стерильно смешивают в указанных выше пропорциях (B. longum - 50%, B.bifidum - 41%, B.infantis - 9%), корректируют pH до значения 7.0 при помощи 5% раствора аммиака, вносят сахарозу от 0.45 до 0.9% и желатин от 0.05 до 0.1%, разливают мерно по 2-3 мл в пенфлаконы емкостью 10 мл и подвергают лиофильному высушиванию. Таким образом получают второй комплексный сухой бифидопрепарат для детей от рождения до возраста 3-5 лет.

Пример 3.

Для приготовления сухого комплексного препарата для взрослых и детей в возрасте старше 5 лет соотношение различных видов бифидобактерий соответствует количественному составу нормофлоры кишечника молодого здорового человека 18-23-летнего возраста. Именно в этот период организм уже закончил свое формирование и менее подвержен различным заболеваниям, как соматическим, так и инфекционным. Пользуясь графиком на фиг. 1, в препарате устанавливают следующие виды бифидобактерий и их количественное соотношение: B. longum - 41%, B.bifidum - 33%, B.adolescentis 26%.

Флаконы, содержащие лиофильно высушенные бифидобактерии видов B.bifidum, B.longun и B.adolescentis, вскрывают стерильно, разводят 5 миллилитрами 0.9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси переносят стерильно (каждую отдельно) в пробирки со стерильной модифицированной печеночной средой Блаурокка и инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч. Получаемые таким образом культуры первой генерации раздельно вводят в количестве 3-5% (от объема питательной среды) в стеклянные бутылки с питательной средой следующего состава:
панкреатический гидролизат молока - 4.5-5.0%,
автолизат пекарских дрожжей - 0.5-1.5%,
аскорбиновая кислота - 0.003-0.005%,
восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12-13% - до 100%
Посевные дозы каждого вида бифидобактерий инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч до образования сгустка с биотитром не менее 10⁹ КОЕ/мл и кислотностью не более 120-160^oT.

Содержимое бутылей каждого вида бифидобактерий стерильно смешивают в указанных выше пропорциях (B.longum - 41%, B.bifidum - 33%, B.adolescentis - 26%), корректируют pH до значения 7.0 при помощи 5% раствора аммиака, вносят сахарозу от 0.45 до 0.9% и желатин от 0.05 до 0.1%, разливают мерно по 2-3 мл в пенфлаконы емкостью 10 мл и подвергают лиофильному высушиванию. Таким образом получают комплексный сухой бифидопрепарат для взрослых и детей возраста старше 5 лет.

Пример 4.

Для приготовления комплексного кисломолочного препарата в жидкой форме для детей от рождения до младшего возраста (до 3-5 лет) соотношение различных видов бифидобактерий соответствует количественному составу нормофлоры ребенка в возрасте до 1 года. Пользуясь графиком на фиг. 1, в препарате устанавливают следующие виды бифидобактерий и их количественное соотношение: B. longum - 48%, B.bifidum - 37%, B.breve - 15%.

Флаконы, содержащие лиофильно высушенные бифидобактерии видов B.bifidum, B. longum и В. breve, вскрывают стерильно, разводят 5 миллилитрами 0.9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси переносят стерильно (каждую отдельно) в пробирки со стерильной модифицированной печеночной средой Блаурокка и инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч. Полученные таким образом культуры бактерий первой генерации раздельно вводят в количестве 3-5% (от объема питательной среды) в стеклянные бутылки с питательной средой следующего состава:
панкреатический гидролизат молока - 4.5-5.0%,
автолизат пекарских дрожжей - 0.5-1.5%,
аскорбиновая кислота - 0.003-0.005%,
восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12-13% - до 100%
Посевные дозы каждого вида бифидобактерий инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч до образования сгустка с биотитром не менее 10⁹ КОЕ/мл и кислотностью не более 120-160^oT (вторая генерация).

Далее в емкости с мешалками, содержащими пастеризованное (стерилизованное), охлажденное до (38±2)^oC обезжиренное и восстановленное молоко, вносят 5% биомассы каждого вида бифидобактерий второй генерации (каждую биомассу в отдельную емкость). Смеси в емкостях перемешивают в течение 15 мин и проводят сквашивание молока в течение 16-18 ч по достижении кислотности продукта (80-110)^oT и титром 10⁷ КОЕ/мл.

Содержимое емкостей каждого вида бифидобактерий стерильно смешивают в одной емкости в указанных выше пропорциях (B.longum - 48%, B.bifidum - 37%, B. breve - 15%). Готовый продукт захолаживают до температуры (8±2)^oC и разливают в потребительскую тару.

Пример 5.

Для приготовления комплексного кисломолочного препарата для детей от рождения до младшего возраста (до 3-5 лет) в жидкой форме, пользуясь графиком на фиг. 1, устанавливают следующие виды бифидобактерий и их количественное соотношение в препарате: B.longum - 52%, B.bifidum - 43%, B.infantis - 5%.

Флаконы, содержащие лиофильно высушенные бифидобактерии видов B.bifidum, B.longum и B.infantis, вскрывают стерильно, разводят 5 миллилитрами 0.9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси переносят стерильно (каждую отдельно) в пробирки со стерильной модифицированной печеночной средой Блаурокка и инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч. Получаемые таким образом культуры первой генерации раздельно вводят в количестве 3-5% (от объема питательной среды) в стеклянные бутылки с питательной средой следующего состава:
панкреатический гидролизат молока - 4.5-5.0%,
автолизат пекарских дрожжей - 0.5-1.5%,
аскорбиновая кислота - 0.003-0.005%,
восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12-13% - до 100%
Посевные дозы каждого вида бифидобактерий инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч до образования сгустка с биотитром не менее 10⁹ КОЕ/мл и кислотностью не более 120-160^oT (вторая генерация).

Далее в емкости с мешалками, содержащими пастеризованное (стерилизованное), охлажденное до (38±2)^oC обезжиренное и восстановленное молоко, вносят 5% биомассы каждого вида бифидобактерий второй генерации (каждую биомассу в отдельную емкость). Смеси в емкостях перемешивают в течение 15 мин и проводят сквашивание молока в течение 16-18 ч по достижении кислотности продукта (80-110)^oT и титром 10⁷ КОЕ/мл.

Содержимое емкостей каждого вида бифидобактерий стерильно смешивают в одной емкости в указанных выше пропорциях (B.longum - 52%, B.bifidum - 43%, B.breve - 5%). Готовый продукт захолаживают до температуры (8±2)^oC и разливают в потребительскую тару.

Таким образом, получают второй комплексный кисломолочный бифидопрепарат в жидкой форме для детей от рождения до возраста 3-5 лет.

Пример 6.

Для приготовления комплексного кисломолочного препарата в жидкой форме для взрослых и детей в возрасте старше 5 лет соотношение различных видов бифидобактерий соответствует, как указывалось выше, количественному составу нормофлоры кишечника молодого здорового человека 18-23-летнего возраста. Пользуясь графиком на фиг. 1, в препарате устанавливают следующие виды бифидобактерий и их количественное соотношение: B.longum - 42%, B.bifidum - 39%, B.adolescentis 29%.

Флаконы, содержащие лиофильно высушенные бифидобактерии видов B.bifidum, B.longum и B.adolescentis, вскрывают стерильно, разводят 5 миллилитрами 0.9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси переносят стерильно (каждую отдельно) в пробирки со стерильной модифицированной печеночной средой Блаурокка и инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч. Получаемые таким образом культуры первой генерации раздельно вводят в количестве 3-5% (от объема питательной среды) в стеклянные бутылки с питательной средой следующего состава:
панкреатический гидролизат молока - 4.5-5.0%,
автолизат пекарских дрожжей - 0.5-1.5%,
аскорбиновая кислота - 0.003-0.005%,
восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12-13% - до 100%
Посевные дозы каждого вида бифидобактерий инкубируют при (38±1)^oC в течение 18-20 ч до образования сгустка с биотитром не менее 10⁹ КОЕ/мл и кислотностью не более 120-160^oT (вторая генерация).

Далее в емкости с мешалками, содержащими пастеризованное (стерилизованное), охлажденное до (38±2)^oC обезжиренное и восстановленное молоко, вносят 5% биомассы каждого вида бифидобактерий второй генерации (каждую биомассу в отдельную емкость). Смеси в емкостях перемешивают в течение 15 мин и проводят сквашивание молока в течение 16-18 ч по достижении кислотности продукта (80-110)^oT и титром 10⁷ КОЕ/мл.

Содержимое емкостей каждого вида бифидобактерий стерильно смешивают в одной емкости в указанных выше пропорциях (B.longmn - 42%, B.bifidum - 39%, B. adolescentis - 29%). Готовый комплексный кисломолочный бифидопрепарат в жидкой форме для взрослых и детей возраста старше 5 лет захолаживают до температуры (8±2)^oC и разливают в потребительскую тару.

Таким образом, предлагаемая технология предусматривает использование совокупности нескольких видов бифидобактерий (B.bifidum, B.longum, B.breve, или В. infantis, или B.adolescentis) в процентном соотношении, соответствующем видовому составу нормофлоры кишечника здорового человека. Сочетанное использование в препаратах трех штаммов бифидобактерий в определенном процентном соотношении, соответствующем возрасту пациента, обеспечивает высокий лечебно-профилактический эффект, повышение совместимости препарата с кишечной нормофлорой человека. Предлагаемый способ основан на более простой и технологичной схеме производства препаратов за счет снижения (оптимизации) количества используемых в препаратах видов бифидобактерий.

Используемая научно-техническая информация
1. Абрамов Н. А. Технологические проблемы обеспечения эубиотиками нужд здравоохранения России. Тезисы докладов Всероссийской конференции "Дисбактериозы и эубиотики", М., 1996, с. 1.

2. Гончарова Г.И., Дорофейчук В.Г., Смолянская А.З., Соколова К.Я. Микробная экология кишечника внорме и при патологии // ж. Антибиотики и химиотерапия, т.34, N 6, 1989.

3. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. М.: АстраФармСервис, 1998, Б-91.

Лянная А.М., Интизаров М.М., Донских Е.Е. Биологические и экологические особенности микробов рода Bifidobacterium.// Сб. под ред. Никитина "Бифидобактерии и их использование в клинике, медицине и пр.", МНИИЭМ им. Габричевского, М.: 1986.

4. Jacobs J.P., Magrath D.J., Garret A.I. et al. J.Biol. Stand. 1981, N 3, p. 331.

5. А. М. Лянная, H.A. Сильченко, C.A. Лисунова и др. Биолого-технологические характеристики штаммов бифидобактерий видов В. breve и В. infantis. // Сб. Проблемы медицинской биотехнологии и иммунологии инфекционных болезней. Московский НИИЭМ им. Габричевского. М., 1996.

6. Л. Н. Евтухова, И. Г. Скорикова и др. Новые штаммы бифидобактерий, предлагаемые для бактериотерапии. // Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. МНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. М., 1987.

7. Г.И. Гончарова, А.М. Лянная, Л.П. Семенова и др. Лечение и профилактика дисбактериоза кишечника бифидумпрепаратами. // Сб. Бактерийные биологические препараты. МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. М., 1989.

8. Э.П. Козлова, Н.А. Курносова, Л.В. Феклисова. Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. // Сб. под ред. Никитина "Бифидобактерии и их использование в клинике, медицине и пр.", МНИИЭМ им. Габричевского, М.: 1986.

9. Зельдович Я.Б., Мышкис А.Д. Элементы прикладной математики. М.: Наука, 1967, 645 с.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в технологии производства препаратов-эубиотиков. Способ позволяет повысить лечебно-профилактические свойства бифидопрепаратов с учетом возраста пациентов и включает приготовление закваски путем культивирования бифидобактерий видов Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, или Bifidobacterium adolescentis в питательной среде с последующим внесением в нее защитной среды и лиофильной сушкой или приготовлением кисломолочного продукта в жидкой форме путем внесения в пастеризованное молоко посевной дозы полученной закваски в количестве не более 5% от объема питательной среды и повторное культивирование указанных видов бифидобактерий при температуре (38±1)°С до получения сгустка, охлаждение продукта и его фасовку. При получении закваски и кисломолочного продукта в жидкой форме каждый вид бифидобактерий культивируют раздельно до получения биомасс с титром не менее 10⁹ КОЕ/мл и объединяют перед сушкой закваски или перед фасовкой биомассы кисломолочного продукта бифидобактерий с получением продукта в виде смеси указанных видов бифидобактерий, причем при получении препаратов для детей после рождения и до возраста 3-5 лет используют бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve или Bifidobacterium infantis, а при получении препарата для детей старшего возраста и взрослых используют бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium adolescentis. Кроме того, соотношение биомасс отдельных видов бифидобактерий в препарате устанавливают соответствующим видовому соотношению их в кишечнике здорового человека определенного возраста, полученному на основе статистического массива данных, обработанных методами математической статистики и регрессионного анализа. Способ позволяет повысить лечебно-профилактические свойства бифидопрепаратов с учетом возраста пациентов, повышает совместимость препаратов с кишечной нормофлорой человека. Упрощается технология производства за счет оптимизации используемых видов бифидобактерий в препарате. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ получения возрастоспецифичных бифидопрепаратов, включающий приготовление закваски путем культивирования бифидобактерий видов Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, или Bifidobacterium infantis, или Bifidobacterium adolescentis в питательной среде с последующим внесением в нее защитной среды и лиофильной сушкой или приготовлением кисломолочного продукта в жидкой форме путем внесения в пастеризованное молоко посевной дозы полученной закваски в количестве не более 5% от объема питательной среды и повторное культивирование указанных видов бифидобактерий при температуре (38±1)^oC до получения сгустка, охлаждение продукта и его фасовку, отличающийся тем, что при получении закваски и кисломолочного продукта в жидкой форме каждый вид бифидобактерий культивируют раздельно до получения биомасс с титром не менее 10⁹ КОЕ/мл в закваске и с титром не более 10⁷ КОЕ/мл в кисломолочном продукте и объединяют перед сушкой закваски или перед фасовкой биомассы кисломолочного продукта бифидобактерий с получением продукта в виде смеси указанных видов бифидобактерий, причем при получении препаратов для детей после рождения и до возраста 3 - 5 лет используют бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve или Bifidobacterium infantis, а при получении препарата для детей старшего возраста и взрослых используют бифидобактерии вида Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium adolescentis, соотношение биомасс отдельных видов бифидобактерий в препарате устанавливают соответствующим видовому соотношению их в кишечнике здорового человека определенного возраста, полученному на основе статистического массива данных, обработанных методами математической статистики и регрессионного анализа. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении препарата для детей после рождения и возраста 3 - 5 лет устанавливают следующее соотношение биомасс отдельных видов бифидобактерий в препарате, мас.%:
Bifidobacterium longum - 38,0 - 52,0
Bifidobacterium bifidum - 30,0 - 42,0
Bifidobacterium breve или Bifidobacterium infantis - Остальное до 100%
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении препарата для детей старшего возраста и взрослых устанавливают следующее соотношение биомасс отдельных видов бифидобактерий в препарате, мас.%:
Bifidobacterium longum - 32,0 - 42,0
Bifidobacterium bifidum - 29,0 - 39,0
Bifidobacterium adolescentis - Остальное до 100%
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении закваски питательная среда содержит восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12 - 13%, панкреатический гидролизат молока, автолизат пекарских дрожжей и аскорбиновую кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Панкреатический гидролизат молока - 4,5 - 5,0
Автолизат пекарских дрожжей - 0,5 - 1,5
Аскорбиновая кислота - 0,003 - 0,005
Восстановленное обезжиренное молоко с сухим остатком 12 - 13% - До 100