СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВИРУСНОЙ И ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине и касается способа получения вещества, обладающего противовирусной и иммуностимулирующей активностью.

Известен способ получения биологически активного вещества, выделенного из маиса (Zea mays Linne) экстракцией водой в щелочных условиях, экстракцией гидрофобным растворителем, ультрафильтрацией и выделения активного вещества с молекулярной массой более 300000 дальтон. Полученное в результате биологически активное вещество обладает противоопухолевой, иммуностимулирующей, противовирусной и противоаллергической активностью.

Однако предложенный способ является довольно трудоемким, технологичным, а также обладает нешироким спектром противовирусного действия, и использованием пищевого сырья.

Технический результат изобретения заключается в разработке простого, технологичного способа получения малотоксичного средства растительного происхождения из доступного сырья, обладающего противовирусной и иммуностимулирующей активностью.

Поставленная цель достигается тем, что высушенную до воздушно-сухого состояния надземную часть растения лапчатки кустарниковой экстрагируют разбавленным 75% -ным спиртом до обеспечивания последнего, сгущают полученный экстракт до объема 20% от массы взятого сырья (до полного удаления остатков спирта. Полученный водный раствор обрабатывают 3 раза хлороформом в соотношении 1: 3 для удаления смолистых сопутствующих веществ и упаривают в вакуум-сушильном шкафу. Осадок сушат до сыпучего состояния и исследуют на противовирусную и иммуностимулирующую активность.

Пример 1. 1 кг надземной части лапчатки кустарниковой экстрагируют 75% разбавленным спиртом в соотношении 1:10 до бесцветного состояния спирта. Экстракт сгущают на ротационном испарителе до объема 20% от массы взятого сырья (до полного удаления остатков спирта). Если при сгущении экстракта оставшийся водный раствор составляет меньше 20% от массы взятого сырья, то добавляют дистиллированную воду до получения указанного объема. Водный раствор очищают 3 раза хлороформом в соотношении 1:3, очищенный экстракт сгущают под вакуумом до получения осадка. Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и сушат в вакуум-сушильном шкафу при 50^o C до сыпучего состояния. Выход порошка 12%
Предлагаемое вещество малотоксично. Белые крысы при внутрижелудочном введении его переносят дозу до 4 г/кг в один прием без видимых признаков токсичного действия и гибели животных на протяжении 4 сут (табл. 1).

Испытывают противовирусную активность.

Противовирусную активность изучали по следующим методикам.

1. Определение токсичности испытуемого соединения (ИС) проводили в культуре перевиваемых клеток Л-41, для чего к питательной среде Игла добавляли различные количества ИС, начиная с 1000 мкг/мл и менее. Наблюдение за культурой клеток вели на протяжении 4 сут с ежедневным просмотром.

За максимальную переносимую дозу (МПД) ИС принимали его наибольшее количество, которое не вызывало дегенерации клеток Л-41.

2. Пpотивовирусную активность ИС определяли по отношению к следующим тест-вирусам:
а) РНК-содержащим КА 13 (Flores), КВ 3 (Nancy), ECHO II (Upsala), BBC (Indiana).

б) ДНК-содержащему ВПГ-1 / Л-2.

Изучение противовирусной активности включало:
а) определение влияния ИС на репродукцию вирусов методом скрининга. Тест-вирус в дозе 100 ТПД₅₀/ 0,1 мл вносили в культуру клеток Л-41 и инкубировали 1 ч при 37^o C. Непосредственно после адсорбции вирусосодержащую жидкость сливали и в культуру клеток Л-41 вносили среду Игла, содержащую различные концентрации ИС. Отсутствие цитопатического действия (ПДП) вируса в опыте; при срабатывании его в контроле, позволяло считать ИС в данной концентрации активным. Наблюдения вели на протяжении 72 ч.

б) В том случае, если при исследовании методом скрининга соединение проявляло слабую активность, анализ активности был продолжен следующим методом: определяли влияние предварительного контакта ИС с культурой клеток Л-41 на протяжении 24 ч при 37^o C с последующим внесением 100 ТЦД₅₀/0,1 мл тест-вируса и наблюдением в течение 20 ч (одноцикловая репродукция).

Учет противовирусной активности в этом случае производили, как выше описано.

В итоге того и другого исследований определили величину химиотерапевтического индекса (ХТИ) по формуле: ХТИ=МПДМИД где МПД - максимальная переносимая доза, МИД минимальная ингибирующая доза ИС по отношению к каждому тест-вирусу.

3. В результате установлено, что МПД ИС (полифенольный комплекс из лапчатки кустарниковой) составляла 62,5 мкг/мл (табл. 2).

Как видно из материалов, представленных в табл.3, ИС обладало активностью по отношению к вирусу ECHO II (ХТИ=2).

Дальнейшие испытания показали (табл. 4) четко выраженный эффект ИС по отношению к вирусу КВ 3 (ХТИ=4).

Отсутствие аналогичных химиопрепаратов, а также растительных препаратов, эффективных в отношении энтеровирусов (КВ 3, ECHO II) не позволило провести сравнение испытуемого соединения с аналогами по действию.

Таким образом, впервые установлена активность полифенольного комплекса из лапчатки кустарниковой (Poten tilla fruticosah) в отношении энтеровирусов ЕСНО II (ХТИ= 2) и Коксаки В 3 (ХТИ=4). Поскольку вирус Коксаки В 3 характеризуется выраженной способностью поражать сердце и поджелудочную железу человека, вирус ЕСНО II известен как возбудитель заболеваний глаз (увеиты и др) у детей младшего возраста, считаем, что заявляемое средство может быть использовано для испытаний терапевтического действия на экспериментальных моделях вирусных инфекций.

Пример 2. Исследуют влияние полифенольного комплекса, полученного описанным в 1 примере способом, на процесс формирования гуморального иммунного ответа к эритроцитам барана (ЭБ). Иммунный ответ оценивался методом определения антителообразующих клеток (АОК).

Исследования проводили на 80 самцах мышей линии F₁ (C57 B16 x DBA2). Животные иммунизировались внутривенно в хвостовую вену ЭБ (5 х 10⁷ клеток на мышь). Величину иммунного ответа оценивали по числу АОК в селезенке мышей на 5 сут после введения антигена. Исследуемый препарат вводили в желудок мышей через мягкий пластиковый зонд 6-кратно с интервалом в 2 сут в дозах 10,50 и 100 мг/кг за 1 ч до иммунизации.

Статистическую обработку проводили методом непараметрического сравнения рядом Вилкоксона-Манна-Уитни.

При всех исследованных дозах препарат обнаруживает достоверноеиммуностимулирующее действие на гуморальный иммунитет на тимус-зависимый антиген ЭБ. Максимальный эффект наблюдается при применении препарата в дозе 50 мг/кг (см. табл. 5).

Таким образом, впервые установлено, что комплекс полифенолов из лапчатки кустарниковой (Poten tilla fruticosah) активизирует антителообразование, увеличивая в селезенке число антителообразующих клеток, секретирующих антитела IG M. Вследствие этого повышаются защитные силы организма и сопротивляемость к различным инфекционным заболевания.

Использование способа получения средства, обладающего противовирусной и иммуностимулирующей активностью по сравнению с другими способам обеспечивает следующий ожидаемый положительный эффект.

1. Позволяет в качестве источника получения вещества использовать лапчатку кустарниковую.

2. Позволяет впервые использовать вещество из лапчатки кустарниковой как противовирусный препарат.

3. Позволяет впервые использовать вещество из лапчатки кустарниковой как иммуностимулирующий препарат.

4. Имеется промышленная разработка выращивания лапчатки кустарниковой.

Ожидаемый годовой экономический эффект от использования заявляемого изобретения и ориентировочную годовую потребность в предлагаемом изобретении подсчитать в настоящее время невозможно.

Для последующей разработки и доведения объекта данного предложения до промышленного освоения предлагается осуществить следующее:
разработать опытно-промышленный регламент и провести доклиническое изучение противовирусной и иммуностимулирующей активности препарата.

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения вещества, обладающего противовирусной и иммуностимулирующей активностью. Сущность способа заключается в экстракции надземной части лапчатки кустарниковой (курильского чая) 75% спиртом, упаривания экстракта до 20% объема, очистке сгущенного экстракта хлороформом, упаривании и высушивании. Технический результат заключается в получении продукта, обладающего сильно выраженным противовирусным и иммуностимулирующим эффектом. 5 табл.

Способ получения вещества, обладающего противовирусной и иммуностимулирующей активностью, включающий экстракцию растительного сырья, удаление растворителя и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют надземную часть лапчатки кустарниковой (курильский чай), экстракцию проводят 75% спиртом, удаление растворителя осуществляют сгущением до объема 20% от массы сырья, а очистку проводят обработкой сгущенного экстракта хлороформом, остаток упаривают и высушивают.