СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК Российский патент 1997 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к прикладной иммунологии и предназначено для диагностики алеутской болезни норок.

Алеутская болезнь норок (АБ) инфекционное вирусное заболевание, наносящее основной ущерб пушному звероводству. Особенностью АБ является неспособность нарабатывающихся антител нейтрализовать вирус. Вакцинация лишь усугубляет патологический процесс и единственным методом борьбы с АБ становится своевременная диагностика и выбраковка больных животных. Существующие в мире способы диагностики АБ технологичны, но обладают не очень высокой чувствительность. Известные высокочувствительные способы трудоемки, дороги, требуют для своего исполнения много времени, которое резко увеличивается при обследовании большого количества зверей. Необходим чувствительный и одновременно высокотехнологичный способ, позволяющий проводить массовое обследование норок на зверофермах.

Известен радиоиммунный способ выявления антител к вирусу алеутской болезни норок [1] включающий следующие основные стадии: сорбцию предварительно очищенных антител на пластиковом планшете, внесение вирусного антигена, внесение меченных 1¹²⁵ противовирусных антител исследуемого образца, проведение конкурентной реакции взаимодействия, счет радиоактивности.

Чувствительность способа составляет 0,01 мкг/мл.

Длительность для первой стадии от 12 ч до недели, для следующих стадий 3-4 ч.

Недостатками данного способа являются его длительность, трудоемкость, требование дорогого оборудования, специальных условий и навыков работы с радиоактивной меткой.

Известен способ выявления антител к вирусу АБ методом встречного иммуноосмоэлектрофореза [2] включающий следующие основные стадии: подготовка стеклянных пластин, покрытых гелем 0,7 агарозы, выбивание лунок в геле и заполнение лунок вирусным антигеном с катодной стороны, исследуемыми сыворотками с анодной стороны, проведение реакции взаимодействия вирусного антигена и антител исследуемой крови под действием электрического поля, регистрация результатов взаимодействия путем просмотра образующихся линий преципитации.

Основными недостатками данного способа являются его недостаточно высокая чувствительность, составляющая 1-10 мкг/мл, необходимость специального оборудования, длительность при массовом обследовании норок на зверофермах.

Наиболее близким к предлагаемому способу является иммуноферментный способ выявления антител к вирусу алеутской болезни норок [3]
Известный способ включает следующие основные стадии:
1. Сорбцию предварительно очищенного вирусного антигена на пластиковый планшет, 12 ч при 4^oC.

2. Внесение сыворотки крови норок и проведение реакции взаимодействия антител исследуемой сыворотки крови и сорбированного антигена, 2 ч при 25^oC.

3. Внесение фосфатазного конъюгата кроличьих антител против иммуноглобулина норок, проведение реакции взаимодействия в течение 2 ч при 25^oC.

4. Внесение субстратного раствора, регистрация результатов взаимодействия по фермент-субстратному окрашиванию.

После 2 и 3 стадий проводят отмывку планшета буфером.

Чувствительность способа составляет 0,1-1 мкг/мл.

Длительность составляет 17 ч, 12 ч для первой стадии, 5 ч для остальных стадий.

Недостатками данного способа является его недостаточно высокая чувствительность, длительность, использование только сыворотки крови в объеме не менее 100 мкл, трудоемкость при массовом исследовании.

Задачей изобретения является упрощение способа, повышение его чувствительности, а также расширение его функциональных возможностей.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Исследуемые образцы любых биологических жидкостей инфицированных норок наносят в виде матрицы микроточек на твердофазный носитель, способный связывать белки, и высушивают при комнатной температуре. Носитель инкубируют в течение 30-60 мин при 37^oC, либо при комнатной температуре в блокирующем растворе, насыщающем свободную активную поверхность носителя. В качестве блокирующего раствора используют любые биологические жидкости, не содержащие исследуемых компонентов (противовирусных антител), способные качественно насытить активную поверхность носителя. Преимущественно используют растворы 0,25-1 желатина, либо растворы желатина с сыворотками крови животных. Реакцию взаимодействия связанных с носителем антител исследуемых образцов с вирусным антигеном проводят при покачивании в течении 30-60 мин при 37^oC в блокирующем растворе, содержащем вирусный антиген, меченный ферментом.

В качестве антигена используют вирус алеутской болезни норок, выделенный из органов и тканей инфицированных норок или из культуры клеток, инфицированной вирусом, адаптированным к росту на данной культуре клеток. Преимущественно используют вирус АБ норок, полученный из культуры клеток почек кошки (CRFK), инфицированной вирусом штамма ADV-G. После инкубации с антигеном тщательно отмывают носитель в буфере, содержащем неионный детергент и проводят регистрацию результатов взаимодействия в фермент-субстратном растворе. Результаты реакции оценивают по появлению окрашенных пятен на месте образцов, содержащих антитела к вирусу алеутской болезни норок.

В качестве исследуемого образца используют любые биологические жидкости, потенциально содержащие антитела к вирусу кровь, сыворотку крови, слюну, мочу, гомогенаты органов и тканей норок, преимущественно используют кровь, разбавленную в 2-10 раз. В качестве твердофазного носителя используют твердофазные пористые носители, способные связывать белки лавсан, поливинилендифторид, преимущественно используют носители на основе нитроцеллюлозы. Носитель используют в форме листа, разлинованного в виде сетки. Нанесение индивидуальных образцов осуществляют в квадраты сетки, получая при этом матрицу пространственно разобщенных микроточек. В качестве фермента используют пероксидазу, фосфатазу, галактозидазу, которые либо непосредственно связаны с вирусным антигеном, либо опосредованно через различные лиганды в виде комплексов с антителами, биотин-стрептавидиновых комплексов. Преимущественно используют вирусный антиген в виде антиген-биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса.

Чувствительность способа составляет 0,01-0,07 мкг/мл.

Длительность способа для 100 образцов 2 ч 15 мин.

Длительность способа для 1000 образцов 2 ч 15 мин плюс время нанесения 1000 образцов.

На фиг. 1 представлена ксерокопия мембраны, где видно, что носитель 45х45 мм имеет маркированную сетку для исследования 100 образцов. Нанесение образцов осуществляют точками в квадраты сетки. Обработка носителя предложенным способом выявила положительные пробы 43, 53, 78 (фиг. 2 и 3). Использование 10 таких носителей позволяет одновременно исследовать 1000 образцов, при этом, если на 1 носитель необходимо 1-2 мл рабочего раствора, то для 10 таких носителей нужно по 10-20 мл.

Существенными отличительными признаками предлагаемого способа являются:
1. Исследуемые образцы непосредственно наносят на твердофазный носитель, способный связывать белки. Нанесение осуществляют точками по 0,2-0,5 мкл в квадраты сетки на поверхности носителя. При этом возможно нанесение большого количества проб на небольшой по размерам носитель. Одновременная обработка нескольких таких носителей позволяет упростить способ за счет возможности одновременного исследования от 50 до 5 тыс. проб. Прямое нанесение исследуемых образцов по 0,2-0,5 мкл на поверхность носителя позволяет расширить функциональные возможности способа за счет использования любых биологических жидкостей, потенциально содержащих антитела к вирусу АБ.

Использование в качестве носителя любого твердофазного пористого носителя, способного связывать белки, позволяет расширить функциональные возможности способа. Использование именно пористых носителей оправдано в связи с большей активной поверхностью твердофазных пористых носителей по сравнению с просто твердофазными.

Носители на основе нитроцеллюлозы или ее смеси с другими целлюлозными эфирами удобны за счет достаточно высокой емкости и простоты обращения с ними.

Преимущественное использование крови, разбавленной в 2-10 раз, позволяет получить дополнительный положительный эффект за счет сокращения расхода исследуемой пробы, а также увеличить разрешающую способность способа. Причем этот эффект тем значительнее, чем меньше свободных антител в исследуемом образце крови.

На фиг. 2 и 3 представлены фотографии нитроцеллюлозных мембран с нанесенными образцами. На первой фотографии (фиг. 2) кровь предварительно разбавлена фосфатно-солевым буфером в 10 раз, на второй фотографии (фиг. 3) осуществляли нанесение цельной крови. Из фиг. 2,3 видно, что при нанесении разбавленной крови разрешающая способность способа выше, пятна положительной реакции ярче и четче очерчены.

2. Проводят реакцию прямого взаимодействия сорбированных на носителе антител исследуемого образца с вирусным антигеном, меченным ферментом, что позволяет упростить способ за счет сокращения количества специфичных стадий, необходимых для его осуществления.

Мечение вируса ферментом опосредованно через различные лиганды позволяет получить дополнительный положительный эффект за счет повышения чувствительности способа, так как при этом на конечной стадии анализа образуется иммунохимический комплекс, в котором на одну молекулу антитела приходится несколько десятков молекул фермента.

Использование в качестве вирусного антигена, меченного ферментом, антигена в виде биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса позволяет повысить чувствительность способа с 0,1 мкг/мл (прямое мечение пероксидазой) до 0,01 мкг/мл (мечение биотином и образование комплекса антиген-биотин-стрептавидин-фермент). Мечение вируса биотином позволяет расширить функциональные возможности способа за счет универсальности данного вещества, так как в качестве конъюгата можно использовать любой авидин- или стрептавидин-ферментный конъюгат.

Для получения антиген-биотин-стрептавидин-ферментного комплекса на стадии взаимодействия антиген-антитело в рабочий раствор добавляют биотинилированный антиген в концентрации, равной или превышающей концентрацию конъюгата. Оптимально использовать стрептавидин-ферментный конъюгат в концентрации 0,002-0,004 мг/мл.

В качестве лиганда можно также использовать моноклональные антитела, что позволяет дополнительно повысить чувствительность способа, во-первых, за счет увеличения количества ферментной матки, во-вторых, за счет снижения неспецифического связывания (по сравнению с использованием поликлональных антител).

Пример 1. Сыворотку крови 100 норок по 0,5 мкл наносят капилляром точками на поверхность разлинованного на квадраты листа 50x50 мм нитроцеллюлозы. Квадраты имеют порядковые обозначения для удобства нахождения нужной пробы. Лист с нанесенными образцами высушивают при комнатной температуре, а затем инкубируют в течение 45 мин в 2 мл 0,5 раствора желатина, содержащего 20 сыворотки крови барана. Реакцию взаимодействия проводят в 2 мл блокировочного раствора, содержащего биотинилированный вирусный антигел в концентрации 0,005 мг/мл и стрептавидин-пероксидазу в концентрации 0,0025 мг/мл, тритон Х-100 до 0,05 Лист инкубируют в данном растворе 60 мин при 37^oC.

Затем носитель отмывают 5 раз по 4 мин раствором 0,1 М бикарбоната натрия, содержащим 0,1 тритон Х-100. После 2 мин инкубации в субстратном растворе, содержащем 0,01 H₂O₂, 0,05 ДАБ в 0,05 М трис-0,05 М имидазольном буфере рН 7,4, пробы, содержащие антитела к вирусу АБ, окрашиваются в коричневый цвет и проявляются в виде пятна в определенном квадрате.

Чувствительность способа 0,07 мкг/мл.

Длительность способа 2 ч 15 мин.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что в исследование берут 1000 образцов крови норок. На 10 листов размером 50х50 мм по 0,5 мкл наносят исследуемую кровь. Далее одновременно в одних и тех же емкостях проводят необходимые для осуществления способа операции. Концентрации реагентов остаются как в примере 1, а объем увеличивается пропорционально числу носителей. Так для 10 носителей необходимо по 20 мл блокировочного раствора и раствора для проведения реакции взаимодействия.

Чувствительность способа 0,07 мкг/мл.

Длительность способа 3 ч.

Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что в качестве твердофазного носителя используют пористые мембраны на основе поливинилендифторида.

Перед нанесением мембрану смачивают метанолом. В качестве блокировочного раствора используют 0,5 желатин. Реакцию взаимодействия проводят в 0,25 желатине.

Чувствительность способа 0,01 мкг/мл.

Длительность способа для 100 образцов 2 ч 15 мин.

Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что в качестве исследуемой жидкости используют 100 образцов слюны норок.

Чувствительность способа 0,07 мкг/мл, но пятна окрашены слабее.

Длительность способа 2 ч 15 мин.

Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что в качестве конъюгата используют стрептавидин, меченный β-галактозидазой. В блокировочный раствор на стадии взаимодействия антиген-антитело добавляют стрептавидин, меченный b-галактозидазой в концентрации 0,006 мг/мл.

Чувствительность способа 0,01 мкг/мл.

Длительность способа для 100 образцов 4 ч.

Время увеличилось за счет более длительного проявления в субстратном растворе.

Пример 6. Способ осуществляют аналогично примеру 2 за исключением того, что в качестве исследуемой жидкости используют кровь норок, разбавленную водой в 5 раз.

Из фиг. 2 видно, что разрешающая способность способа выше, пятна четче очерчены и ярче.

Чувствительность способа 0,01 мкг/мл.

Длительность способа для 1000 образцов 3 ч.

Использование: ветеринарная иммунология. Сущность изобретения: исследуемые образцы любых биологических жидкостей норок наносят в виде матрицы микроточек на твердофазный пористый носитель, преимущественно нитроцеллюлозу и высушивают при комнатной температуре. Затем носитель инкубируют в течение 30-60 мин в блокирующем растворе, например желатине, а реакцию взаимодействия связанных с носителем антител исследуемых образцов с вирусным антигеном проводят в этом же блокирующем растворе в присутствии вирусного антигена, меченного ферментом. В качестве меченного ферментом антигена используют биотинстрептавидин-пероксидазный конъюгат вируса алеутской болезни норок. После отмывки носителя в буфере проводят регистрацию результатов взаимодействия в фермент-субстратном растворе по появлению окрашенных пятен на месте образцов, содержащих антитела к вирусу алеутской болезни норок. 6 з.п. ф-лы. 3 ил.

1. Способ выявления антител к вирусу алеутской болезни норок, включающий проведение реакции взаимодействия на твердом носителе антител исследуемого образца с вирусным антигеном с последующей регистрацией результатов взаимодействия по субстрат-ферментному окрашиванию, отличающийся тем, что на носитель, способный связывать белки, наносят исследуемый образец и используют антиген, меченный ферментом. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что твердый носитель используют в форме листа, предварительно разлинованного в виде сетки с цифровыми или буквенными обозначениями, а нанесение образца осуществляют точечно в квадраты сетки. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве носителя используют нитроцеллюлозу. 4. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве исследуемого образца используют кровь и/или сыворотку крови. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что кровь используют разбавленной в 2 20 раз. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве меченного ферментом вирусного антигена используют комплекс биотилированного вирусного антигена со стрептавидин-пероксидазным конъюгатом. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве меченного ферментом вирусного антигена используют комплекс вирусного антигена и противовирусных антител, меченных ферментом.