СПОСОБЫ ОДНОВРЕМЕННОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ОБОИХ КОМПОНЕНТОВ СВЯЗЫВАЮЩЕЙСЯ ПАРЫ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/543 G01N33/52 

Область техники

Изобретение относится к способам одновременного выявления обоих компонентов связывающейся пары в биологическом образце.

Предпосылка изобретения

Продукты крови, используемые для переливания и переноса компонентов крови, регулярно должны подвергаться проверке на наличие инфекционных агентов, таких как вирус иммунодефицита человека (HIV), вирусы гепатита, Т-лимфоцитотропный вирус человека и цитомегаловирус. Такие агенты обычно выявляют либо благодаря идентификации вирусных антигенов, либо посредством выявления иммунного ответа на вирус (т.е. производимых в организме хозяина антивирусных антител), используя иммунноферментный анализ (ИФА) или радиоиммуноанализ (РИА). Способы иммуноанализа ограничены по своим возможностям выявлять наличие вирусной контаминации на ранних стадиях инфекции, при этом промежуточный период времени между инфицированием вирусом и выявлением способами иммуноанализа варьирует от двух до четырех недель для HIV и вплоть до 10 недель для вируса гепатита С (HCV). Такие способы, как полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) или анализ разветвленных цепей ДНК, могут уменьшить период времени между инфекцией и регистрацией, но имеют чрезвычайно высокую стоимость при использовании в качестве основы для анализов у отдельных доноров и не исключают промежуточного периода времени.

Сущность изобретения

Изобретение основано на быстром и чувствительном способе одновременного выявления обоих компонентов связывающейся пары, таких как лиганд и рецептор или антиген и антитело хозяина, из биологического образца. Способы изобретения могут, например, увеличить возможность выявления инфекции на ранней стадии, приводя к более раннему лечению инфекции.

В изобретении представлен способ одновременного измерения обоих компонентов А и В связывающейся пары в биологическом образце. Биологический образец выбран из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки, мочи, спинномозговой жидкости, мокроты, слезной жидкости, амниотической жидкости, стекловидного тела, слюны и супернатантов культур клеток. Способ включает в себя подготовку твердофазного реагента, который содержит частицу, покрытую захватывающими антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентом А связывающейся пары, и осуществление контактирования биологического образца с твердофазным реагентом в условиях, при которых компонент А, если он присутствует, оказывается связанным с частицей, образуя первую прореагировавшую частицу. Захватывающими антителами могут быть моноклональные антитела. Обеспечивают контактирование первой прореагировавшей частицы с первыми антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентом А, при этом первые антитела мечены первой меткой, и со вторыми антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентом В связывающейся пары, при этом вторые антитела мечены второй меткой, чтобы образовать вторую прореагировавшую частицу. Первые и вторые антитела могут быть моноклональными. На второй прореагировавшей частице измеряют первую и вторую метки (например, флуорофоры), используя проточную цитометрию.

В некоторых вариантах в основном все захватывающие антитела ориентированы на частице таким образом, что антигенсвязывающие области захватывающих антител доступны для связывания компонента А связывающейся пары.

Компонентом А связывающейся пары, например, может быть антиген, а компонентом В может быть антитело хозяина. Антигеном может быть вирусный антиген, такой как антиген гепатита С, антиген гепатита В или антиген вируса иммунодефицита человека, или аутоантиген, такой как декарбоксилаза глутаминовой кислоты. Компонентом А связывающейся пары также может быть лиганд, такой как цитокин, а компонентом В может быть рецептор, такой как рецептор цитокина. Кроме того, компонентом А может быть фермент, а компонентом В может быть субстрат. Например, ферментом может быть каспаза-3 или каспаза-1, а субстратом может быть поли(АДФ-рибоза)полимераза или проинтерлейкин-1 соответственно.

В изобретении также представлен набор для одновременного измерения обоих компонентов А и В связывающейся пары в биологическом образце. Набор содержит твердофазный реагент, который включает в себя частицу, покрытую захватывающими антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентом А связывающейся пары; первые антитела, обладающие специфичной аффинностью связывания компонента А связывающейся пары, при этом первые антитела мечены первой меткой; и вторые антитела, обладающие специфичной аффинностью связывания компонента В связывающейся пары, при этом вторые антитела мечены второй меткой. В основном все захватывающие антитела ориентированы на частице таким образом, что антигенсвязывающие области захватывающих антител доступны для связывания компонента А связывающейся пары. Набор, кроме того, может содержать наклейку или вкладыш в упаковку, в которых указано, что твердофазный реагент, меченые первые антитела и меченые вторые антитела можно использовать для одновременного измерения обоих компонентов А и В связывающейся пары в биологическом образце посредством проточной цитометрии.

Если не оговорено особо, все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно имеется в виду специалистом в данной области, к которой данное изобретение относится. Несмотря на то, что при осуществлении изобретения на практике могут быть использованы способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие упоминаемые здесь ссылки включены в виде ссылок в полном объеме. В случае противоречия данная спецификация, включая определения, будет подвергнута проверке. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Другие особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание рисунков

Фигура 1 является схематичным представлением анализа для выявления компонента А и антитела хозяина против компонента А (компонента В).

Фигуры 2А-2Н представляют собой скаттерграммы, которые показывают одновременное выявление поверхностного антигена вируса гепатита В (HBV), антитела хозяина против HBV, коровьего антигена HCV и антитела хозяина против HCV проточной цитометрией. На фигуре 2А представлен антиген HBV и антитело в нормальном образце. На фигуре 2В представлен антиген HCV и антитело в нормальном образце. На фигуре 2С представлен антиген HBV и антитело в HBV-позитивном образце. На фигуре 2D представлен антиген HCV и антитело в HBV-позитивном образце. На фигуре 2Е представлен антиген HBV и антитело в HCV-позитивном образце. На фигуре 2F представлен антиген HCV и антитело в HCV-позитивном образце. На фигуре 2G представлен антиген HBV и антитело в НВV-позитивном/НСV-позитивном образце. На фигуре 2Н представлен антиген HCV и антитело в НВV-позитивном/НСV-позитивном образце.

Подробное описание

Вид иммуноанализа

В общем, в изобретении используется способ иммуноанализа типа “сэндвич” для одновременного выявления обоих компонентов связывающейся пары в биологическом образце. Связывающиеся пары включают любую комбинацию молекул, которые образуют комплекс, включая пары, состоящие из нуклеиновых кислот, белков или малой молекулы и белка. Парами нуклеиновых кислот могут быть пары ДНК:РНК или пары ДНК:ДНК. Например, в качестве системы регистрации продукта ПЦР можно использовать такую связывающуюся пару ДНК/РНК, как пара однонитевой (он)ДНК и мРНК. Такую связывающуюся пару ДНК/ДНК, как пару онДНК и вирусной ДНК, можно использовать в конкурентном анализе для количественного определения вируса в амплифированной ДНК.

Не ограничивающие примеры связывающихся пар белков или малой молекулы и белка включают гормон, цитокин, пептид, лекарственное средство, вирусный белок или другой антиген и родственный рецептор или антитело хозяина. Связывающимися парами вирусного белка/рецептора могут быть, например, gp120 HIV и растворимый CD4. Связывающимися парами лекарственного средства и рецептора лекарственного средства могут быть, например, кокаин и допаминовый рецептор. Связывающимися парами пептида и рецептора пептида могут быть, например, ацетилхолин и мускариновый рецептор или допамин и допаминовый рецептор. Связывающимися парами гормона и рецептора гормона могут быть, например, инсулин и рецептор инсулина. Связывающимися парами цитокина и рецептора цитокина могут быть, например, фактор некроза опухолей (TNF) и рецептор TNF типа 1 или типа 2 или интерлейкин 2 (IL-2) и рецептор IL-2. Связывающимися парами антигена и антитела могут быть, например, вирусный белок и антитело хозяина против вирусного белка или аутоантиген и антитело хозяина против аутоантигена. р24 HIV/антитело человека против HIV, gр120 HIV/антитело человека против gp120 HIV, поверхностный антиген HBV/антитело человека против поверхностного антигена HBV и коровий белок HCV/антитело человека против кора HCV являются примерами связывающихся пар вирусного белка и антитела хозяина. Связывающимися парами аутоантигена и антитела хозяина против аутоантигена могут быть, например, декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD) и антитело хозяина против GAD.

Другими связывающимися парами белков, которые можно обнаружить, являются связывающиеся пары фермента и субстрата фермента. Например, фермент/субстратной парой может быть каспаза-3/поли(АДФ-рибоза)полимераза или каспаза-1/проинтерлейкин -1.

Компонент А, который может быть любым компонентом связывающейся пары, захватывают твердофазным реагентом, который представляет собой частицу, покрытую захватывающими антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания по отношению к компоненту А. Например, если связывающейся парой, которую необходимо одновременно выявить, является gр120 HIV/антитело хозяина против gр120 HIV, частицу можно покрыть антителами, обладающими специфичной аффинностью по отношению к gр120 HIV или антителами против иммуноглобулина (Ig) хозяина.

Компонент А захватывается при контакте биологического образца с частицей, покрытой захватывающими антителами. В используемом здесь смысле, подходящие биологические образцы содержат клетки или клеточный материал и включают, например, кровь, плазму, сыворотку, мочу, слюну, мокроту, слезную жидкость, амниотическую жидкость, стекловидное тело и спинномозговую жидкость. Другие примеры in vitro/супернатанты могут включать среду культуры ткани. Биологические образцы можно обрабатывать неионным детергентом, таким как 0,5% тритон Х-100 или Nonidet P40 (Sigma Chemical Company, St. Louis, МО), чтобы обнажить коровые антигены патогена.

Контакт твердофазного реагента и биологического образца обеспечивают в условиях, которые способствуют связыванию компонента А, если он присутствует, с частицей, чтобы образовать первую прореагировавшую частицу. Такие условия могут включать применение буфера, содержащего 1% фетальную сыворотку теленка (FBS) и 0,1% азид натрия в фосфатно-солевом буфере (PBS) при комнатной температуре, или применение любой биологической жидкости при физиологических значениях рН. Затем осуществляют контакт первой прореагировавшей частицы с двумя наборами меченых антител (т.е. репортерных антител), чтобы образовать вторую прореагировавшую частицу. Первые антитела обладают специфичной аффинностью связывания с компонентом А и мечены первой меткой. Первое антитело способно связываться с компонентом А, в то время как компонент А связан с захватывающими антителами. Таким образом, захватывающие антитела и первые антитела должны работать в паре. Вторые антитела обладают специфичной аффинностью связывания с компонентом В связывающейся пары и мечены второй меткой. В частности, в указанном способе пригодны флуоресцентно меченные антитела.

Фигура 1 представляет схему анализа для выявления компонента А и антитела хозяина против компонента А. В указанном варианте биотинилированные захватывающие антитела обладают специфичной аффинностью связывания компонента А и связаны с шариками, захватывающими антигены, посредством авидина. Первые антитела обладают специфичной аффинностью связывания с компонентом А и мечены фикоэритрином (первая метка). Вторые антитела мечены цианинфикоэритрином (вторая метка) и обладают специфичной аффинностью связывания с Ig хозяина (компонент В).

Первая прореагировавшая частица включает в себя компонент А, антитела хозяина против компонента А, захватывающие антитела и твердофазный реагент (например, шарики, захватывающие антиген), тогда как вторая прореагировавшая частица включает в себя первую прореагировавшую частицу и два меченых антитела.

Для того чтобы измерить количество метки во второй прореагировавшей частице, можно использовать проточную цитометрию. В используемом здесь смысле термин “измерение” относится к качественным и количественных измерениям. Другими словами, термин “измерение” включает в себя получение сведений о наличии или отсутствии метки во второй прореагировавшей частице, а также определение количества присутствующей метки. Проточные цитометры позволяют измерять, по меньшей мере, три отдельные области длин волн флуоресцентной эмиссии посредством использования оптических фильтров для того, чтобы разделить сигналы флуоресцентной эмиссии, и отдельные электронные фотоумножители для усиления сигналов эмиссии. Интенсивность флуоресцентной эмиссии, связанная с частицами, прямо пропорциональна концентрации анализируемого вещества, присутствующего в биологическом образце. Таким образом, применение различных красителей с разным спектром эмиссии, при котором каждый краситель связан с разным антителом, позволяет анализировать разнообразные анализируемые вещества в популяции частиц. С помощью проточной цитометрии также можно отличить частицы разных размеров, а именно, например, частицу диаметром примерно 7 мкм можно отличить от частицы диаметром примерно 10 мкм. Поэтому, используя комбинацию разных флуоресцентных красителей и две или три популяции частиц разного среднего размера, можно выявлять дополнительные компоненты.

Получение антител

Антитела, обладающие специфичной аффинностью связывания с компонентом А или компонентом В, можно получить стандартными способами. В альтернативном случае антитела могут быть доступны из коммерческих источников, например из BiosPacific (Emeryville, CA), Coulter (Hialeah, FL), Maine Biotechnology Service (Portland, ME) или Biodesign International (Kennebunk, ME). В используемом здесь смысле термины “антитело” и “антитела” включают интактные молекулы, а также их фрагменты, которые способны связываться с эпитопной детерминантой компонента А или компонента В. Термин “эпитоп” относится к антигенной детерминанте на антигене, с которой связывается паратоп антитела. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты и боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфичные трехмерные структурные особенности, а также специфичные характеристики заряда. Эпитопы обычно имеют, по меньшей мере, пять непрерывно следующих друг за другом аминокислот. Таким образом, термины “антитело” и “антитела” включают поликлональные антитела, моноклональные антитела, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные Fv-фрагменты антител, Fab-фрагменты и F(ab)₂-фрагменты. Особенно пригодными являются моноклональные антитела.

В общем, представляющий интерес белок получают рекомбинантным способом, химическим синтезом или очисткой нативного белка и затем используют для иммунизации животных. Разных животных-хозяев, включая, например, кроликов, цыплят, мышей, морских свинок и крыс, можно иммунизировать посредством инъекции представляющего интерес белка. Можно использовать адъюванты для того, чтобы усилить иммунологический ответ, в зависимости от вида хозяина, адъюванты включают адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы Pluronic, полианиноны, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин морского блюдечка “замочная скважина” (KLH) и динитрофенол. Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, которые специфичны для конкретного антигена, которые содержатся в сыворотке иммунизированных животных. Моноклональные антитела, которые представляют собой гомогенные популяции антител к конкретному эпитопу, имеющемуся в антигене, можно получать, используя стандартную технологию гибридом. В частности, моноклональные антитела можно получить любым способом, который предусматривает получение молекул антител постоянными линиями клеток в культуре, таким как описан Kohler, G. еt al. Nature, 1975, 256: 495, способом на основе гибридом В-клеток человека (Kosbor et al. Immunology Today, 1983, 4:72; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80:2026) и способом на основе EBV-гибридом (Cole et al. "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., 1983, pp.77-96). Такие антитела могут быть антителами любого класса иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и их подклассы. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела согласно изобретению, можно культивировать in vitro или in vivo.

Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части получены от разных видов животных, такие как антитела, имеющие вариабельный участок, полученный из мышиного моноклонального антитела, и константный участок иммуноглобулина человека. Химерные антитела можно получать стандартными способами.

Фрагменты антител, которые обладают специфичной аффинностью связывания с компонентом А или В, можно получить известными способами. Например, такие фрагменты включают, но не ограничены этим, F (ab')₂-фрагменты, которые можно получить расщеплением молекулы антитела пепсином, и Fab-фрагменты, которые можно получить восстановлением дисульфидных мостиков F(ab')₂-фрагментов. В альтернативном случае могут быть сконструированы библиотеки, экспрессирующие Fab. Смотри, например, Huse et аl., 1989, Science, 246:1275. Одноцепочечные фрагменты Fv антител образуют связыванием фрагментов тяжелой и легкой цепи участка Fv посредством аминокислотного мостика (например, от 15 до 18 аминокислот), получая в результате одноцепочечный полипептид. Одноцепочечные фрагменты Fv антител можно получить стандартными способами. Смотри, например, патент США №4946778.

После получения антител или их фрагментов их тестируют в отношении распознавания компонента А или компонента В стандартными способами иммуноанализа, включая, например, способы ELISA или РИА. Смотри, Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 11, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, Edited by Ausubel, F.M. et al., 1992. Подходящие антитела предпочтительно обладают одинаковой аффинностью связывания рекомбинантных и нативных белков.

Альтернативно антитела можно оценить по их способности формировать связывающиеся пары при флуоресцентном “сэндвич”-анализе следующим образом. Шарики можно покрыть биотинилированными антителами, например антителами против вирусных белков, затем инкубировать примерно в течение 30 минут с 2 нг/мл соответствующего белка, например рекомбинантного вирусного белка, в объеме 100 мкл. После промывки шариков два раза 2 мл буфера, содержащего 1% FBS и 0,1% азида натрия в PBS, шарики инкубируют примерно с 0,5 мкг антитела, меченного фикоэритрином. Пары антител, которые дают сильный флуоресцентный сигнал, пригодны для применения в анализах согласно изобретению.

Твердофазные реагенты

Подходящие частицы (например, шарики) имеют средний диаметр примерно от 2 мкм до 15 мкм и могут быть полистироловыми, ферромагнитными или парамагнитными. Например, частицы могут иметь средний диаметр примерно от 4 до 11 мкм. Обычные средние диаметры частиц составляют 4-5 мкм, 7-8 мкм и 10-11 мкм. Частицы доступны из коммерческих источников, например из Spherotech Inc., Libertyville, IL. Частицы могут быть покрыты захватывающими антителами известными способами. Например, парамагнитные шарики, покрытые авидином или стрептавидином, можно покрыть биотинилированными захватывающими антителами. В общем, шарики, покрытые авидином или стрептавидином, ресуспендируют в солевом растворе, таком как PBS, смешивают с биотинилированными антителами в условиях насыщения (примерно 40 мкг белка на 3,9×10⁷ шариков диаметром 7 мкм) и инкубируют при комнатной температуре.

После завершения связывания шарики промывают и блокируют, например, буфером, содержащим 1% FBS и 0,1% азида натрия в PBS.

Шарики, покрытые авидином или стрептавидином, можно связать с биотинилированными нуклеиновыми кислотами в том случае, когда измеряют связывающиеся пары нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты можно метить биотином при включении биотин-11-dUTP в стандартные реакции ник-трансляции.

В конкретных вариантах в основном все захватывающие антитела ориентированы на частице так, что антигенсвязывающие участки доступны для связывания с компонентом А, увеличивая общую чувствительность анализа. Термин “в основном все” показывает, что, по меньшей мере, 80% и предпочтительно, по меньшей мере, 90% (например, 95% или 99%) антител ориентированы таким образом. Процент ориентации можно оценить качественно, измеряя флуоресценцию, ассоциированную со связыванием меченного фикоэритрином козьего антитела против Ig мыши, и сравнивая стандартизованные флуоресцентные частицы. Антигенсвязывающие участки антител доступны для связывания компонента А в том случае, когда антитело в основном биотинилировано по аминокислотным остаткам вне участка связывания антигена. Таким образом, во время биотинилирования антител используют молярное отношение биотин: антитело, равное примерно от 5:1 до примерно 10:1, и другие стандартные условия реакции. Например, можно использовать сложный эфир биотин-N-гидроксисукцинимидил или сложный эфир биотинсукцинимидил при рН около 8,1. Альтернативно можно использовать гидразид биотина при рН 4,5-5,0.

Чувствительность анализа также повышена благодаря тому, что захват компонента А из биологического образца не ограничен объемами реакций, равными 200 мкл или меньше, как в случае традиционных анализов. Частицы легко собирать из больших объемов биологического образца либо магнитным разделением, либо центрифугированием. Кроме того, каждая частица содержит в среднем примерно от 180000 до 240000 сайтов связывания антител и примерно от 300000 до 350000 биотинилированных антигенсвязывающих сайтов на частицу. Таким образом, каждая частица обладает высокой связывающей способностью и широкими эффективными пределами анализа в отношении концентрации антигена.

Регистрируемые метки

Каждое меченое антитело можно визуально четко распознавать благодаря мечению флуорофором, который испускает свет такого цвета, который отличается от других флуорофоров. Например, можно использовать комбинацию следующих флуорофоров: 7-амино-4-метилкумарин-3-уксусная кислота (ДМСА), Texas Red™ (Molecular Probes, Inc./Eugene, OR), 5-(и-6)-карбокси-Х-родамин, лис-самин-родамин В, 5-(и-6-)-карбоксифлуоресцеин, флуоресцеин-5-изотиоцианат (ФИТЦ), 7-диэтиламинокумарин-3-карбоновая кислота, тетраметилродамин-5-(и-6-)-изотиоцианат, 5-(и-6)-карбокситетраметилродамин, 7-гидроксикумарин-3-карбоновая кислота, 6-[флуоресцеин-5(и-6)-карбоксамидо]гексановая кислота, N-(4,4-дифтор-5/7-диметил-4-бор-3а,4а-диаза-3-индаценпропионовая кислота, эозин-5-изотиоцианат, эритрозин-5-изотиоцианат, фикоэритрин (В-, R- или цианин-), аллофикоцианин, Oregon Green™ и ацетилазид Cascade™ Blue (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).

Антитела также можно метить полупроводниковыми нанокристаллами. Водорастворимые нанокристаллы состоят из нанокристаллов разного размера в виде ядра из селенида кадмия, покрытого оболочкой из сульфида кадмия, заключенных в оболочку диоксида кремния, или нанокристаллов селенида кадмия/сульфида цинка, солюбилизированных в меркаптоуксусной кислоте. Такие водорастворимые нанокристаллы обладают узким, перестраиваемым симметричным спектром эмиссии и фотометрически стабильны. Смотри Bruchez Jr. et al. Science, 1998, 281: 2013-2016 и Chan et al. Science, 1998, 281: 2016-2018.

Регистрация множественных антигенов и антитела хозяина

Комбинацию меток, таких как Oregon Green™ (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), фикоэритрин и цианинфикоэритрин, можно использовать для выявления в числе прочего двух антигенов и антитела хозяина. Например, HCV, поверхностный антиген HBV, антитело хозяина против HCV и антитело хозяина против поверхностного антигена HBV можно одновременно регистрировать, используя меченные фикоэритрином антитела, обладающие специфичной аффинностью связывания с HCV, меченные Oregon Green™ антитела, обладающие специфичной аффинностью связывания с поверхностным антигеном HBV и меченные цианинфикоэритрином антитела против Ig хозяина. Использование трех разных меток и двух популяций частиц, имеющих разные размеры (например, средние диаметры 7-8 мкм и 10-11 мкм), позволяет одновременно выявлять до 6 разных вирусных антигенов и антител хозяина. Применение третьей популяции частиц другого среднего диаметра позволяет регистрировать до 9 разных вирусных антигенов и антител хозяина.

Выявление вирусных антигенов в образцах плазмы может быть затруднено после сероконверсии у индивидуума (т.е. выработки антител хозяина), поскольку связывающие сайты для захватывающих или репортерных антител на вирусной частице блокированы антителом хозяина. Данное изобретение преодолевает эту трудность благодаря повышенной чувствительности анализа по сравнению с традиционными формами иммуноанализа. Таким образом, вирусный антиген можно обнаружить с применением данных способов в ситуациях, при которых традиционные формы иммуноанализа не могут этого сделать. Как здесь описано, вирусные антигены могут быть захвачены при использовании частиц, покрытых моноклональными антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с вирусным белком, и их присутствие у серопозитивных индивидуумов можно выявить с помощью репортерных моноклональных антител, направленных против вирусного белка. Одновременно можно выявить антитело хозяина, направленное против вирусного белка, посредством меченых козьих антител против Ig человека. Выявление вирусного белка без антитела хозяина свидетельствует о том, что хозяин был инфицирован недавно и сероконверсия не произошла, в то время как выявление вирусного белка и антитела хозяина свидетельствует о наличии инфекции, а также о сероконверсии. В некоторых образцах можно выявить антитело хозяина, но вирусный белок не выявляется в том случае, например, когда связывающие сайты для первого антитела не доступны. Хотя в данном случае вирусные белки не измеряют непосредственно, вирусные белки еще присутствуют в образце, так как покрытый антителами захватывающий шарик, направленный против вирусного белка, захватывает иммунный комплекс вирусного антигена и антитела хозяина.

Далее изобретение будет описано на следующих примерах, которые не ограничивают рамки изобретения, описанные в формуле изобретения.

Примеры

Пример 1 - Биотинилирование белков:

Антитела конъюгировали при концентрации 5 мг/мл; вирусные антигены конъюгировали при концентрации 1 мг/мл. Чтобы пометить биотином антитела против вирусных белков и вирусные антигены, белки переводили в 100 мМ буфер на основе КН₂СО₃ (рН 8,3), используя фильтр Centricon (Amicon) соответствующего размера.

Сложный эфир биотин-N-гидроксисукцинимидил (Molecular Probes, Eugene, OR) в ДМСО (10 мг/мл, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО, кат. №D8779) готовили непосредственно перед использованием и добавляли к белку, который надо биотинилировать, при молярном соотношении 5:1 или 10:1. Реакции осуществляли при легком встряхивании белкового раствора и добавлении биотина/ДМСО к белковому раствору и тщательном перемешивании. Белок и сложный эфир биотина реагировали в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Конъюгированный белок отделяли от свободного биотина разделением на колонке с гелем сефадекса-25 объемом 10 мл или на центрифужной колонке, используя для элюирования 1 Х PBS. Собирали отдельные фракции объемом 1 мл и измеряли поглощение при А280 нм. Фракции, представляющие начальный пик А280, собирали и объединяли, тогда как оставшиеся фракции, включая фракции, представляющие второй пик А280, отбрасывали.

При использовании центрифужных колонок реакционную смесь поровну распределяли на четыре центрифужных колонки и центрифугировали, используя центрифугу Serofuge при высокой скорости в течение 2 мин. Материал, прошедший через колонку, собирали и колонки промывали, наполняя колонку 1 Х PBS и вращая при высокой скорости в Serofuge в течение 2 мин и повторяя пять раз. Собранный материал снова распределяли поровну на четыре колонки, затем, используя центрифугу Serofuge, центрифугировали при высокой скорости в течение 2 мин. Материал, прошедший через колонку, собирали, объединяли и снова анализировали на А280 и определяли концентрацию. Конъюгированный белок хранили при 4°С.

Пример 2 - получение шариков, захватывающих анализируемое вещество

Шарики, захватывающие анализируемое вещество, готовили посредством полного ресуспендирования покрытых авидином парамагнитных шариков (7 мкм, Spherotech/ VM-60-100) при тщательном перемешивании. Шарики (обычно 3,8×10⁶ шариков) помещали в центрифужные пробирки объемом 50 мл и смешивали с 30 мл 1 Х PBS. После удерживания шариков на стенке пробирки магнитом весь PBS удаляли. Шарики промывали еще два раза PBS.

После окончательной промывки PBS к шарикам добавляли требуемый объем биотинилированного антитела (обычно 40 мкг) и 2 мл 1 Х PBS. Шарики ресупендировали при непрерывном встряхивании в течение минимум 3 часов или при встряхивании в течение одного часа и последующего хранения в течение ночи при 4°С. Шарики, хранившиеся в течение ночи, встряхивали на следующее утро еще 2 часа. Использовали примерно 30 мл буфера, содержащего 1% FBS и 0,1% NаN₃ в PBS, чтобы три раза промыть конъюгированные шарики. Шарики снова суспендировали в 19,25 мл того же буфера и хранили при 4°С вплоть до использования.

Чтобы пометить антитела производным флуоресцеина Oregon Green™ (Molecular Probes, Eugene, OR), антитела переводили в 100 мМ буфер на основе КН₂СО₃ (рН 9,0) при концентрации 5 мг/мл. Oregon Green™ (10 мг/мл в диметилформамиде, DMF) добавляли к антителам при молярном соотношении 25:1 и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Свободный Oregon Green™ отделяли от антитела на колонке с сефадексом G-25. Конъюгаты с R-фикоэритрином (РЕ, Intergen BioDiagnostics, Purchase, NY) и цианинфикоэритрином (Су5РЕ) получали, используя 2-иминотиолан (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) при молярном соотношении 1625:1, чтобы модифицировать флуорохром, и сульфо-SMCC (Pierce) при молярном соотношении 20:1, чтобы модифицировать антитело. Модифицированные флуорохром и антитело инкубировали вместе в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Свободные флуорохром и антитело отделяли от конъюгированного с флуорохромом антитела на колонках с Sephacryl S-300-HR (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО). F(ab')₂ фрагменты козьей антисыворотки против Ig человека (специфичные для тяжелой и легкой цепи), аффинно очищенные и абсорбированные против антител мыши, лошади, быка, крысы и кролика, метили РЕ или Сy5-РЕ. Можно изменять отношения флуорохрома к белку, чтобы оптимизировать сигнал флуоресценции для конкретного антитела или вирусного антигена.

Пример 3 - Выявление вирусных антигенов и антитела хозяина

Образцы плазмы нормальных субъектов и субъектов, позитивных по HCV, HIV или HBV, получали из New York Biologicals (Southampton, NY), Scantibodies Laboratory (Santee, CA) или Intergen BioDiagnostics (Purchase, NY). Образцы плазмы перед тестированием обрабатывали детергентом тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,5%, чтобы лизировать вирусные мембраны и обнажить коровые частицы. Рекомбинантные вирусные антигены, полученные из Е.coli, включая поверхностные и коровые антигены, получали из BiosPacific (Emeryville, CA) или Intergen BioDiagnostics. Антигены добавляли к нормальным непатогенным образцам сыворотки для создания стандартной кривой и для применения при анализах пиков и возвращения к исходному состоянию.

Анализ проточной цитометрией выполняли на проточном цитометре Coulter EPICS Profile II, Coulter XL или Partec PAS, используя рассеяние линейно поляризованного света под прямым углом против рассеяния света под малыми углами, чтобы пропустить популяцию шариков. Сигнал флуоресценции усиливали логарифмически. Флуоресцентную эмиссию разделяли на дискретные цвета с помощью оптических фильтров. Фильтр, пропускающий полосу 525 нм, использовали для сбора зеленой флюоресценции (Oregon Green и ФИТЦ), фильтр, пропускающий полосу 565 нм, - для сбора оранжевой флуоресценции (РЕ) и фильтр, пропускающий длинную волну 630 нм, - для сбора красной флуоресценции (Сy5РЕ).

Образцы инкубировали с мечеными РЕ или Сy5РЕ F(ab')₂ козьего антитела против Ig человека (специфичного для тяжелой и легкой цепи). В каждом случае выявляли антивирусные антитела хозяина на шариках с захватывающим антигеном, но не на шариках из нормальных образцов или с несоответствующим вирусом. Поверхностный антиген HBV и антитело против HBV, а также коровый антиген HCV и антитело против HCV выявляли с использованием меченого РЕ антитела, обладающего специфичной аффинностью связывания с коровым антигеном HCV, меченного Oregon Green антитела, обладающего специфичной аффинностью связывания с поверхностным антигеном HBV и меченого Су5РЕ козьего антитела против Ig человека. Как показано на фигурах 2А-2Н, было возможно отдельное и одновременное выявление HCV, HBV и антитела хозяина.

Другие варианты

Следует понимать, что хотя изобретение было описано в связи с его подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения рамок изобретения, которые определены рамками прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в рамки следующей формулы изобретения.

Изобретение относится к области гематологии. Сущность его составляют способы и наборы для одновременного измерения обоих компонентов связывающейся пары, обозначенных как А и В (например, антигена и антитела). Способ включает в себя осуществление контакта биологического образца с твердофазным реагентом, который покрыт захватывающими антителами, обладающими аффинностью связывания с компонентом А, чтобы образовать первую прореагировавшую частицу. Осуществление контакта этой частицы с мечеными антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентами А и В, образует вторую прореагировавшую частицу; затем проводят измерение меток на второй прореагировавшей частице методом проточной цитометрии. Технический результат - расширение арсенала диагностических гематологических методов для ранней стадии выявления инфекций, таких как ВИЧ, гепатит С и другие. 2 н. и 17 з.п.ф-лы, 2 ил.

1. Способ одновременного измерения в биологическом образце компонентов связывающейся пары, обозначенных как А и В, включающий

a) предоставление твердофазного реагента, при этом твердофазный реагент содержит частицу, покрытую захватывающими антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентом А связывающейся пары;

b) осуществление контакта биологического образца с твердофазным реагентом в условиях, при которых компонент А, если он присутствует, оказывается связанным с частицей, чтобы образовать первую прореагировавшую частицу;

c) осуществление контакта первой прореагировавшей частицы с первыми антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентом А, при этом первые антитела мечены первой меткой, и со вторыми антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентом В связывающейся пары, при этом вторые антитела мечены второй меткой, чтобы образовать вторую прореагировавшую частицу, при этом первая и вторая метки являются различными,

d) измерение первой и второй меток на второй прореагировавшей частице.

a) твердофазный реагент, при этом твердофазный реагент содержит частицу, покрытую захватывающими антителами, обладающими специфичной аффинностью связывания с компонентом А связывающейся пары, где в основном все захватывающие антитела на частице ориентированы так, что участки связывания антигена захватывающих антител доступны для связывания с компонентом А связывающейся пары;

b) первые антитела, обладающие специфичной аффинностью связывания с компонентом А связывающейся пары, при этом первые антитела мечены первой меткой;

c) вторые антитела, обладающие специфичной аффинностью связывания с компонентом В связывающейся пары, при этом вторые антитела мечены второй меткой.