СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ В СЫВОРОТКАХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/569 A61K39/395 G01N33/544 

Способ и набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины Рифт в сыворотках животных.

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к способу и набору для обнаружения антител (AT) к вирусу лихорадки долины Рифт (ЛДР) и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и предприятиях биологической промышленности для наработки наборов.

Известно использование иммуноферментного метода (ИФМ) для обнаружения AT (Iahrling P.B. et al., 1985, Ionan A. et al., 1989, Morvan I. et al., 1991).

В доступной литературе не встречали использование авидин-биотинового комплекса для обнаружения AT к вирусу ЛДР. Предложенный Iahrling P.B. et al. (1985) ИФМ для обнаружения AT предусматривает сорбцию на полистирол микротитрационных пластин специфических IgG и только после этого специфический антиген (АГ), вслед за которым поэтапно сорбируют исследуемые образцы сывороток и антивидовые IgG, меченные щелочной фосфатазой.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа и набора для обнаружения AT к вирусу ЛДР в сыворотках крови овец.

Предлагаемый способ позволяет обнаруживать AT к вирусу ЛДР в сыворотках крови путем применения комплекса: антиовечьи IgG + стрептавидин + биотин-бета-галактозидаза при соотношении стрептавидина и биотинилированного фермента 2 мкг/мл соответственно, благодаря этому чувствительность реакции повышается в 125-625 раз.

Предлагаемый набор включает емкости, содержащие специфический антиген; контрольную и специфическую сыворотки; конъюгаты: антиовечий IgG-биотин, биотин-бета-галактозидазу; стрептавидин.

Пример конкретного выполнения. Для обнаружения специфических AT к вирусу ЛДР отбирают исследуемые образцы крови (сывороток) овец. Сенсибилизацию пластин (планшетов) специфическим АГ осуществляют внесением его рабочей дозы в лунки микротитрационных пластин и инкубацией при +37^oC в течение 2 ч или 18 ч при +4^oC.

Контрольные сыворотки (отрицательные и положительные), исследуемые образцы сывороток вносят в лунки микротитрационных пластин, предварительно сенсибилизированные рабочей дозой АГ и отмытые 0,1 М фосфатно-буферным раствором pH 7,4, с 0,05%-ным твин-20 инкубируют при -37^oC 1-2 ч или при температуре +4^oC в течение ночи, далее ведут этапы сорбции при +37^oC по 60 мин антиовечьего биотинилированного IgG и стрептавидина+биотин-бета-галактозидазы с отмывкой лунок пластин от несвязавшихся препаратов между этапами. Оптимальное соотношение количеств стрептавидина и биотинилированной бета-галактозидазы подбирают эмпирически (табл. 1). Данные табл. 1 показывают, что минимальные количества стрептавидина и биотинилированной бета-галактозидазы, позволяющие достичь максимальной чувствительности метода при минимальном фоне, равны 2:1 или 1:1 соответственно.

Реакция по обнаружению AT заканчивается внесением в лунки пластин хромогенного субстрата ортонитрофенил-бета-Д-галактопиранозида (ОНФГ) или флуорогенного субстрата 4-метилумбеллиферил-бета-Д-галактопиранозида (4-МУГ) и учетом реакции через 30 мин визуально или автоматически.

Проведена сравнительная оценка результатов тестирования сывороток овец ИФМ на основе стрептавидин-биотинового комплекса (СБК) и известного ранее метода ингибирования (табл. 2). Данные табл. 2 показывают, что предлагаемый метод в 125-625 раз чувствительнее метода ингибирования.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность метода в 125-625 раз и может быть промышленно применен.

При конструировании набора нарабатывают следующие диагностические препараты.

Специфический антиген (АГ) получают на перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС). Сформировавшийся монослой клеток заражают традиционным методом, разведение 10 - 3 - 10 - 4. Спустя 48-72 ч после заражения, когда цитопатогенный эффект достигает 80%, вирусную суспензию замораживают (-60^oC). Далее оттаивают и осветляют от обломков клеток, подвергают дифференциальному центрифугированию, 100-кратному концентрированию и инактивации бета-пропиолактоном.

Специфическую сыворотку получают из крови овец, иммунизированных вакцинным штаммом вируса ЛДР.

Контрольную сыворотку получают из крови клинически здоровой овцы.

Антивидовой IgG-биотин получают путем конъюгирования (смешивания) антиовечьих иммуноглобулинов (IgG), выделенных путем трехкратного высаливания сульфатом аммония гамма-фракции глобулинов из гипериммунной антиовечьей, сыворотки и последующей гель-фильрацией на ультрагеле АсА-34, и биотин-N-гидроксисукцинимид эфира в соотношении 67:1.

Конъюгат биотин-бета-галактозидаза получают путем конъюгирования (сшивки) фермента бета-галактозидаза (из E.coli) активностью большей или равной 600 ед/мг и биотин-N-гидриксисукцинимид эфира в соотношении 8:1.

Биотинилированные конъюгаты получают в течение 4 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После этого конъюгаты диализуют против 0,1М ФБР pH 7,2, добавляют консервант, стабилизатор.

Стрептавидин коммерческий (Streptomyces avidinii) с биотин-связывающей активностью А ≥ 15,7 ед/мг белка.

Конъюгаты антивидовые IgG-биотин, биотин-бета-галактозидаза и стрептавидин входят в состав стрептавидин биотинового комплекса.

Наработанные диагностические препараты фасуют в ампулы по 0,5 мл, лиофилизируют.

Предлагаемый набор укомплектован шестью емкостями и может быть промышленно применен в необходимых случаях.

Изобретение относится к области вирусологии и предназначено для лабораторной диагностики ЛДР. Способ позволяет обнаружить антитела к вирусу в сыворотках овец путем сорбции специфического антитела на полистирол микротитрационных пластинах. Для диагностики применяют комплекс, включающий антиовечий IgY-биотин+стрептавидин+биотин-β-галактозидазу при соотношении стрептавидин и биотинилированного фермента 2 : 1 или 1 : 1 соответственно. При этом чувствительность реакции повышается в 125 - 625 раз. Набор включает емкости, содержащие специфический антиген; контрольную и специфическую сыворотки; конъюгаты: антиовечий IgY-биотин, биотин-β-галактозидазу; стрептавидин. 2 с. п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ обнаружения антител к вирусу лихорадки долины Рифт в сыворотках животных, включающий постановку реакции и учет твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что проводят твердофазный иммуноферментный анализ на основе стрептавидин-биотинового комплекса, исследуемые сыворотки овец вносят в лунки микротитрационных пластин, предварительно сенсибилизированные рабочей дозой специфического антигена, и сорбируют, далее инкубацию проводят с конъюгатами в виде стрептавидинбиотинового комплекса, включающего антиовечьи IgG - биотин + стрептавидин + биотин-β-галактозидазу в соотношении стрептавидина и биотин-β-галактозидазы 2 : 1 или 1 : 1. 2. Набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины Рифт, содержащий специфический антиген вируса лихорадки долины Рифт, контрольную сыворотку от клинически здоровой овцы, специфическую сыворотку к вирусу ЛДР, глобулиновый конъюгат, отличающийся тем, что набор содержит конъюгат в виде комплекса антиовечьего биотинилированного IgG, стрептавидина и биотинилированной β-галактозидазы.