СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК Российский патент 1994 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарии, а точнее к ветеринарной вирусологии.

Известен способ диагностики алеутской болезни норок, заключающийся в определении антител к вирусу алеутской болезни в сыворотке крови по образованию иммунного комплекса антиген-антитело с меченым радиоактивным изотопом антигеном, отделении и измерении радиоактивности этого комплекса, служающей мерой содержания антител [1].

Недостатком известного способа является его высокая трудоемкость, связанная со сложностью забора анализируемых проб крови.

Цель изобретения - упрощение способа.

Это достигается тем, что согласно способу диагностики алеутской болезни норок, включающему радиоиммунологическое определение вируса алеутской болезни, в качестве анализируемого образца используют пробу coprus, разбавленную буферным раствором и подвергнутую температурной обработке при 56-65^оС в течение 30-60 мин.

Предлагаемый способ диагностики заключается в следующем.

Анализируемую пробу сoprus разбавляют в 5-10 раз буферным раствором с рH 7,4-7,5, прогревают при температуре 56-65^оС в течение 30-60 мин, охлаждают до комнатной температуры, добавляют известные количества антител к вирусу АБ и меченого ¹²⁵J-иодом антигена АБ, смешивают, инкубируют полученную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч, вносят раствор полиэтиленгликоля для осаждения образовавшегося комплекса антиген-антитело, осадок отделяют центрифугированием и радиоактивность осадка, служащую мерой содержания вируса АБ, определяют на автоматическом счетчике γ -излучений. Вирус АБ, вступая в конкурентное взаимодействие с меченым антигеном за ограниченное количество добавленных в систему антител, уменьшает радиоактивность осадка по сравнению с контрольными пробами, содержащими вирус.

Для осуществления заявляемого способа диагностики АБ норок необходим предварительный прогрев образцов coprus для исключения в некоторых случаях неспецифических положительных реакций. Выбор температурного интервала обоснован экспериментально. Нижнее значение температурного интервала (56^оС) является критическим для большинства белков, когда последние из нативного состояния переходят в денатурированное. Верхнее значение (65^оС) для данного метода диагностики является максимальным, т.к. при более высокой температуре начинается потеря вируса АБ антигенных свойств.

П р и м е р 1. Анализируемые образцы готовят растворением 100 мг coprus в 900 мкл фосфатно-буферного раствора, имеющего следующий состав: Na₂ HPO₄ ˙ 2H₂O 10,6 г; натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты ˙2H₂O 3,73 г; бычий сывороточный альбумин 1,0 г, вода дистиллированная до 1 л. Образовавшуюся 10% -ную взвесь coprus осветляют центрифугированием при 3000g в течение 10 мин. 200 мкл надосадочной жидкости вносят в пластиковые или стеклянные пробирки, прогревают в термостате при 56^оС в течение 30 мин, затем охлаждают при комнатной температуре. Предварительно подбирают разведение сывороток экспериментально зараженных или спонтанно больных алеутской болезнью норок или, что предпочтительнее, иммунизированных вирусом АБ кроликов, содержащих антитела к вирусу АБ, либо очищенных хроматографией кроличьих антител, а также разведение меченого антигена для обеспечения оптимальных условий анализа. На основании полученных данных строят кривые связывания меченого антигена, точки перегиба которых соответствуют рабочей концентрации антисывороток в конкурентном радиоиммунологическом анализе. В идеальном случае это то количество антител, которое связывает 50% меченого антигена.

Подготовив анализируемые образцы, антисыворотку и антиген, приступают к выполнению анализа.

В пробирки с анализируемыми образцами вносят антисыворотку, 200 мкл меченого антигена и 1,0 мл 10%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000, смесь тщательно перемешивают и оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Одновременно обрабатывают контрольные пробы, содержащие
контроль неспецифического связывания: 200 мкл буферного раствора + 200 мкл меченого антигена + 1,0 мл ПЭГ;
контроль специфического связывания: 200 мкл буферного раствора + антисыворотка + 200 мкл меченого антигена + 1,0 мл ПЭГ.

После окончания инкубации пробирки центрифугируют при 2000g в течение 15 мин, супернатанты сливают, следя за максимально возможным удалением жидкости, пробирки помещают в автоматический γ -счетчик для определения радиоактивности осадков. Результаты сравнивают с контрольными пробами. Контроль 1 вычитают из результатов всех определений; контроль 2 является мерой связывания меченого антигена в отсутствии конкуренции со стороны немеченого за ограниченное количество антител. Совпадение результатов неизвестных проб с контролем 2 (с учетом ошибки эксперимента) указывает на отсутствие вируса АБ в анализируемых образцах.

Схема анализа представлена в табл.1.

Результаты типичного определения даны в табл.2.

В табл.2 приведены результаты определения вируса АБ у 10 норок. Процент связывания меченого антигена у больных норок может меняться в широких пределах в зависимости от содержания вируса. Эти величины связаны обратной пропорциональной зависимостью, - чем меньше процент связывания метки, тем выше концентрация вируса в исследуемом образце. Таким образом, уменьшение счета образца или процента связывания по сравнению с контролем связывания (В_О), или отношения В_Х/В_О c учетом ошибки определения является признаком присутствия вируса в исследуемом образце.

П р и м е р 2. Определение вируса АБ осуществляют аналогично тому, как описано в примере 1, но прогрев пробы coprus осуществляют при температуре 65^оС в течение 60 мин.

Табл. 3 иллюстрирует влияние температурной обработки анализируемых образцов coprus на радиоиммунологическое определение вируса АБ. Приведены результаты анализа двух образцов, взятых от больной (по данным серологической диагностики) и здоровых норок.

Без тепловой обработки процент связывания меченого антигена здоровых норок не достигал уровня контроля специфического связывания, что затрудняет интерпретацию результатов диагностики. При нагревании образцов при 56-65^оС - температурном интервале, в котором вирус АБ устойчив, результаты определения позволяют четко установить как содержащие, так и не содержащие вирус образцы.

Из данных табл.4 видно, что временно интервал температурной обработки coprus от 30 до 60 мин является оптимальным и достаточно широким, что представляет дополнительные удобства. Увеличение времени температурной обработки до 120 мин приводит к ухудшению результатов из-за образования геля вследствие денатурации белков.

Из данных табл.5 видно, что при одновременном определении у одних и тех же животных антител к вирусу АБ в сыворотке крови методами РИЭОФ и иммунорадиологическим, а в пробах coprus вирусов АБ предлагаемым методом встречаются образцы (N 10 и N 12), когда при отрицательной серологической диагностике животные являются носителями вируса АБ. Таким образом, предлагаемый способ более достоверен, т.к. позволяет выявить зараженных вирусом АБ животных, не диагностируемых серологическими методами из-за отсутствия антител или низкого их содержания.

Изобретение относится к экспериментальной биологии, используется для диагностики алеутской болезни норок. Сущность изобретения: диагностика включает радиоиммунологическое определение вируса, при этом в качестве анализируемого образца используют пробу copros, разбавленную буферным раствором и подвергнутую температурной обработке. 5 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК, включающий радиоиммунологическое определение вируса алеутской болезни, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, при проведении радиоиммунологимческого определения, в качестве анализирующего образца используют пробу copros, разбавленную буферным раствором и подвергнутую температурной обработке при 56 - 65^oС в течение 30 - 60 мин.