СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, более конкретно к клинической онкологии и, в частности, касается способов диагностики злокачественных опухолей человека, которые могут найти применение при массовых профилактических обследованиях населения.

Одной из главных проблем клинической онкологии является диагностика злокачественных опухолей в начальной стадии их развития, когда существующие методы лечения бывают наиболее эффективными. Современная онкологическая наука располагают рядом методов скрининговой диагностики злокачественных новообразований, позволяющих судить о наличии или отсутствии опухоли в момент обследования.

В частности, широкое распространение получила профилактическая маммография, проводимая с целью ранней диагностики злокачественных новообразований молочной железы у женского населения (A. G. Holleb. Review of Breast Cancer Screening Guidelines. Cancer Supplement, 1992; 69, с. 1911 -1912).

Известен также метод цитологического скрининга злокачественных опухолей шейки матки (Guzick DS. Efficacy of screening for cervical cancer. A review. Am. J. Public Heath, 1978; 68, с. 125-134.) Однако использование большинства известных методов скрининговой диагностики направлено на выявление опухоли только одного органа и при проводимом обследовании могут быть пропущены другие злокачественные новообразования.

Поэтому до настоящего времени существует проблема создания универсального способа диагностики злокачественных опухолей, отвечающего требованиям, предъявляемым к скрининговым методикам.

Ряд исследователей считает, что наиболее перспективными в этом направлении являются методы, основанные на определении опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма, в частности в крови.

Известен способ диагностики злокачественных опухолей человека, основанный на выявлении в крови обследуемого белковых фракций, специфичных для злокачественного роста (Короткоручко В. П. Осадочная реакция на рак при диагностике опухолевой болезни. Киев, "Наукова думка". 1967). Выявление этой белковой фракции осуществляли путем выдерживания сыворотки крови в растворе соляной кислоты с последующим осаждением белка азотной кислотой и дальнейшим растворением его в дистиллированной воде. Образующийся осадок белков сыворотки крови онкологических больных в отличие от здоровых людей не растворялся. Результат реакции, получившей название осадочной реакции на рак (ОРР), учитывали по визуальному определению белкового осадка.

Этот известный способ является универсальным и позволяет выявить различные формы и локализации злокачественных новообразований. Однако он обладает недостаточной специфичностью, т. к. ОРР часто бывает положительной при воспалительных и других неопухолевых заболеваниях. Кроме того, способ довольно трудоемкий (требуется приготовление сыворотки крови обследуемого) и травматичный (кровь для исследования берется из вены). Поэтому для проведения массовых профилактических исследований такой способ будет мало эффективен.

Задача изобретения создание такого способа диагностики злокачественных опухолей человека, в котором путем оригинальной методики выявления в мазке крови, взятой, преимущественно, из пальца обследуемого, определенных белковых фракций (кальций-белковых комплексов), характерных для злокачественного роста, удалось бы повысить специфичность и чувствительность способа одновременно со снижением его трудоемкости и травматичности, что позволяет, в конечном итоге, использовать этот способ для массовых профилактических обследований с целью онкологического скрининга.

Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики злокачественных опухолей человека, основанном на выявлениив крови обследуемого белковых фракций, специфичных для злокачественного роста, согласно изобретению, в процессе анализа готовят мазок крови, взятой, преимущественно, из пальца обследуемого, и последовательно наносят на него раствор комплексона, стандартную сыворотку крови, а затем проявитель кальций-белковых комплексов (КБК) и после экспозиции на свету сравнивают цвет и структуру полученного пятна с цветом и структурой пятна на эталоне, выполненном аналогичным образом на мазке крови здорового человека, и при обнаружении различий диагностируют злокачественную опухоль.

Изобретение позволяет на основе предлагаемой обработки мазка крови визуализировать КБК, обнаружение которых является более достоверным и информативным признаком злокачественного роста. Вероятнее всего, КБК в процессе жизнедеятельности малигнизированных клеток отщепляются от их ДНК и сбрасываются в кровь (shedding effect), затем захватываются лимфоцитами и при определенных условиях обработки, предлагаемых в соответствии с изобретением, могут быть обнаружены в мазке даже периферической крови.

Таким образом, способ согласно изобретению позволяет проводить обследования, используя мазок крови из пальца, что практически не приводит к развитию осложнений и значительно снижает трудоемкость. Указанный выше патогенез злокачественного роста характерен для опухолей любых локализаций и различного гистогенеза. С учетом вышеуказанного, можно утверждать, что предлагаемый способ является универсальным, простым в исполнении, не травматичным, достаточно специфичным и, следовательно, его можно использовать при массовых профилактических обследованиях населениях с целью онкологического скрининга.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения целесообразно, чтобы концентрация раствора комплексона была выбрана в пределах 1 25 Было установлено, что при концентрации раствора комплексона менее 1 значительно удлиняется время реакции, а при концентрации свыше 25 структура (зернистость) пятна определяется менее четко.

Кроме того, желательно также, чтобы в качестве проявителя КБК был использован раствор азотно-кислого серебра концентрацией 0,1 0,5
Раствор азотно-кислого серебра является наиболее эффективным проявителем, причем, если концентрация этого раствора будет выбрана менее 0,1 продолжительность реакции увеличивается, пятно недостаточно прокрашивается и слабо проявляется зернистость. Более высокие концентрации этого раствора, а именно свыше 0,5 вызывают закрашивание очертания зернистости и затрудняют учет реакции.

Важным моментом постановки реакции является соблюдение количественного соотношения используемых реагентов. Согласно одному из вариантов осуществления данного способа, предпочтительно выбирать соотношения раствора комплексона и проявителя равными (1,5 3) 1.

Выбор в данном соотношении раствора комплексона менее 1,5 приводит к недостаточному прокрашиванию пятна, а более 3 к полному закрашиванию получаемого изображения.

Согласно еще одному из аспектов изобретения оптимальным может быть выбор времени экспозиции. Так, при экспозиции на свету более 4 ч в пятне наблюдается закрашивание структуры, а менее 2 ч недостаточная проработка и соответственно снижение информативности результата. Сущность предлагаемого способа станет более понятной из приведенных ниже подробного описания лучшего варианта его осуществления и конкретных примеров производимой в соответствии с этим способом диагностики.

Предлагаемый способ заключается в следующем: на мазок крови, взятой из пальца обследуемого и равномерно размазанной по предметному стеклу, наносят раствор комплексона, например 0,5 мл 5 раствора, затем через некоторое время, приблизительно 5 10 мин, на этот же участок наносят 0,1 мл стандартной сыворотки крови любой группы, после чего добавляют 0,3 мл реактива -проявителя КБК (преимущественно раствор азотно-кислого серебра). В качестве комплексона, как правило, используют раствор этиленгликоля-бис (β-аминоэтилэфир)-N, N- тетраацетата (ЭГТА) или раствор двунатриевой соли этилендиамин-N,N,N, N-тетраацетат (ЭДТА). Добавление всех выше указанных реагентов производится на свету с последующей экспозицией в течение 2 4 ч.

Результат учитывают по разнице в цвете и структуре полученного пятна после реакции на мазке обследуемого и на мазке эталоне. Последний представляет собой мазок крови из пальца пациента, признанного практически здоровым, и приготавливается аналогично мазку обследуемого. Многочисленные опыты с мазками крови практически здоровых людей в исследованиях по предлагаемому способу позволили определить признаки, характерные для эталона: желтую или желто-коричневую окраску краевой зоны пятна, наличие зернистости светло-коричневого цвета с четкими очертаниями в средней и центральной зонах пятна.

Если цвет и структура пятна на мазке крови обследуемого пациента совпадают с эталоном, то это свидетельствует об отсутствии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса.

Если краевая зона пятна на мазке крови обследуемого имеет светло-коричневый или коричневый цвет, а в средней и в центральной зонах определяется зернистость темно-коричневого или буро-коричневого цвета с размытыми очертаниями, то полученный результат свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественной опухоли.

Пример 1. Доставлен мазок крови пациента А. взятой из пальца при профилактическом обследовании. Во время врачебного осмотра пациент жалоб не предъявлял. На мазок нанесено 0,5 мл 15 раствора (ЭГТА), через 10 мин добавлено 0,1 мл стандартной сыворотки крови, а затем 0,3 мл 0,2 раствора азотно-кислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 2,5 ч.

При этом на мазке пациента А определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются выраженные различия в окраске зернистости, что свидетельствуют о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Комплекс клинико-рентгенологических и эндоскопических методов обследования позволил обнаружить у пациента рак желудка второй стадии.

Гистологическое заключение железистый рак.

Пример 2. Доставлен мазок крови пациента Н. взятой из пальца с подозрением на рак легкого.

На мазок нанесено 0,5 мл 5 раствора ЭГТА, в то же место добавлено 0,2 мл стандартной сыворотки крови и еще через некоторое время 0,3 мл 0,2 раствора азотно-кислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивали через 2 ч.

При этом на мазке крови пациента Н. в зоне реакции обнаружена краевая желто-коричневая окраска, в центре пятна коричневая зернистость с четкими очертаниями. При сравнении цвета и структуры пятна с эталоном картина полностью совпадает, что свидетельствует об отсутствии злокачественного опухолевого процесса. Поставленный диагноз подтвержден при морфологическом изучении операционного материала в препаратах обнаружена туберкулома - казеома.

Пример 3. Доставлен мазок крови пациента М. который обратился к терапевту с жалобами на увеличение лимфатических узлов шеи. От пункционной биопсии больной категорически отказался. На мазок нанесено 0,3 мл 15 раствора ЭДТА, через некоторое время в то же место добавлено 0,1 мл стандартной сыворотки крови а затем 0,1 мл 0,1 раствора азотно-кислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивали через 4 ч.

При этом на мазке пациента М. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются выраженные различия в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. В дальнейшем результат подтвержден при морфологическом исследовании (лимфосаркома).

Пример 4. Доставлен мазок крови ребенка К. родственники которого обратились в поликлинику по месту жительства с целью обследования ребенка в связи с потерей им массы тела и общим недомоганием.

На мазок нанесено 0,2 мл 20 раствора ЭДТА в то же место добавлено 0,1 мл стандартной сыворотки крови и через некоторое время 0,1 мл 0,4 раствора азотно-кислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету.

Результаты оценивали через 2 ч.

При этом на мазке ребенка К. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Ребенок был госпитализирован в онкологическое учреждение, где после тщательного обследования установлен диагноз опухоль Вильмса справа. При морфологическом исследовании удаленного препарата обнаружена эмбриональная нефробластома.

Пример 5. Доставлен мазок крови пациентки С. взятой у нее из пальца во время операции на молочной железе (секторальной резекции).

На мазок нанесено 0,25 мл 10 раствора ЭГТА, добавлено 0,3 мл стандартной сыворотки крови и еще через некоторое время 0,1 мл 0,2 раствора азотно-кислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 3 ч.

При этом на мазке пациентки С. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдается выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемой злокачественного опухолевого процесса. Результат совпал с данными гистологического исследования (аденокарцинома).

Пример 6. Доставлен мазок крови из пальца пациентки Ц. с подозрением на злокачественную опухоль толстой кишки.

На мазок нанесено 0,2 мл 25 раствора ЭГТА, добавлено 0,1 мл стандартной сыворотки крови а затем 0,1 мл 0,5 раствора азотно-кислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 2 ч.

При этом на мазке пациентки Ц. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдается выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемой злокачественного опухолевого процесса. При ректороманоскопии обнаружена опухоль верхне-ампулярного отдела прямой кишки.

Гистологическое заключение аденокарцинома.

Пример 7. Доставлен мазок крови пациента Д. обратившегося к врачам по поводу темно-вишневого опухолевого образования на коже спины.

На мазок нанесено 0,15 мл 3 раствора ЭДТА, затем в то же место добавлено 0,2 мл стандартной сыворотки крови, после чего еще 0,1 мл 0,4 раствора азотно-кислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету.

Результаты оценивались через 2 ч.

При этом на мазке пациента Д. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдается выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемого злокачественного опухолевого процесса. Больному было произведено широкое иссечение опухоли в пределах здоровых тканей. Гистологическое заключение меланома.

Пример 8. Доставлен мазок крови пациентки Л. обратившейся к гинекологу с жалобами на кровянистые выделения из влагалища.

На мазок нанесено 0,3 мл 15 раствора ЭГТА, затем в то же место добавлено 0,3 мл стандартной сыворотки крови и еще через некоторое время 0,2 мл 0,5 раствора азотно-кислого серебра. Процесс нанесения реагентов проводился на свету. Результаты оценивались через 4 ч.

При этом на мазке пациентки Л. определяется пятно, имеющее светло-коричневую краевую зону. Зернистость пятна темно-коричневого цвета с размытыми очертаниями, сливается в средних и центральных зонах, образуя гомогенный участок с неправильными контурами. При сравнении полученной картины с эталоном наблюдаются выраженные различия в окраске и зернистости, что свидетельствует о наличии в организме обследуемой злокачественного опухолевого процесса. Больной произведено диагностическое выскабливание. При гистологическом исследовании обнаружен плоскоклеточный рак шейки матки.

Оценка диагностической эффективности способа проводилась в соответствии с рекомендациями Комитета экспертов Международной федерации клинической химии по референтным величинам.

С целью определения диагностической чувствительности и диагностической специфичности, были изучены результаты применения способа у 50 практически здоровых лиц (доноров) и больных раком легких, пищевода, желудка, прямой кишки, молочной железы, матки и лимфатической системы (по 50 пациентов в каждой группе).

Чувствительность и специфичность определялась по общепринятой методике. Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2.

Разработанный способ диагностики злокачественных опухолей человека не травматичен, высоко информативен, прост в проведении.

Этот способ может быть использован для диагностики всех форм злокачественных новообразований. Высокая диагностическая чувствительность 89,4 и специфичность 86 позволяют считать перспективным его применение для скрининга злокачественных опухолей при массовых профилактических обследованиях населения.

Использование: в медицине, а именно в клинической онкологии, и предназначено для диагностики злокачественных опухолей человека. Сущность изобретения: на мазок крови, взятой из пальца обследуемого, наносят раствор комплексона, затем добавляют стандартную сыворотку крови с последующим нанесением проявителя кальций-белковых комплексов и спустя некоторое время сравнивают цвет и структуру образующегося пятна с полученным аналогичным способом эталоном на мазке крови здорового человека и при обнаружении различий диагностируют злокачественную опухоль в организме обследуемого. Согласно изобретению, предлагаются различные оптимальные отношения реагентов, позволяющие получать более достоверные результаты. Способ прост в исполнении, не травматичен, высоко информативен. 4 з. п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ диагностики злокачественных опухолей человека путем выявления при анализе крови обследуемого белковых фракций, специфичных для злокачественного роста, отличающийся тем, что в процессе анализа готовят мазок крови, взятой преимущественно из пальца обследуемого, и последовательно наносят на него раствор комплексона, стандартную сыворотку крови, а затем проявитель кальций-белковых комплексов, и после экспозиции на свету сравнивают цвет и структуру полученного пятна с цветом и структурой пятна на эталоне, приготовленном аналогичным образом на мазке крови здорового человека, и при обнаружении различий диагностируют злокачественную опухоль. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор комплексона используют в концентрации предпочтительно 20%
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве раствора проявителя кальций-белковых комплексов используют раствор азотнокислого серебра с концентрацией предпочтительно 0,3%
4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что используют раствор комплексона и проявителя в соотношении предпочтительно 2 1. 5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что время экспозиции на свету составляет предпочтительно 3 ч.