СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ "ГРУППЫ ОПУХОЛЕВОГО РИСКА" И СКРИНИНГА РАННИХ СТАДИЙ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 1999 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к патогенетическим способам скрининга опухолевых и предопухолевых злокачественных и незлокачественных заболеваний.

Известны различные способы лабораторной диагностики онкозаболеваний. В том числе тест Болена, отражающий степень агрегации эритроцитов [Сергель А. В, Крылова Г.М., Гончарова Т.Н. Применение теста Болена в гинекологической практике// Ж. терапевтический архив. - 1976.- T.XLVIII, N 8. - С.132-135], связанную с изменениями антигенного, фосфолипидного и олигосахаридного состава мембран эритроцитарных и других типов клеток, развивающимися в процессе онкопатогенеза. Тест Короткоручко, определяющий увеличение концентрации иммуноглобулина G [Короткоручко Е.Н. Методическое письмо утв МЗ УССР.- 1975. - 10 с.], косвенно связанную с изменениями антигенного состава мембран клеток при возникновении опухолевых заболеваний. Флуоресцентный тест, указывающий на перестройку в биоэнергетических процессах клетки (преобладание анаэробного гликолиза), влекущую за собой уменьшение концентрации окисленных форм дыхательных коферментов НАДН и НАДФН, а также на развивающуюся при злокачественных заболеваниях диспротеинемию [Черницкий Е.А., Слобожанина Е.И. Спектральный люминесцентный анализ в медицине: Минск. - 1989. - 260 с.].

Недостатком применения описанных методик является то, что предлагалось использовать их в качестве диагностических монотестов для выявления онкологических заболеваний, т.е. диагноз, согласно этим тестам, выставляется по результату одного из перечисленных тестов. Это влечет за собой большой процент ошибок. Применимость каждого в отдельности из данных тестов для диагностики ранних стадий онкопатологии является также недостаточно обоснованной с точки зрения их адекватности патобиохимическому механизму онкопатологии.

Наиболее близким к заявляемому является комплексный способ, включающий реакцию перекисного гемолиза, аспириновый, лингвальный, сульфосалициловый, флуоресцентный тесты, тест "средних молекул", тест Короткоручко и тест Болена для ранней диагностики онкозаболеваний [Григорович Н.А. Проблемы донозоологической диагностики злокачественных новообразований // Актуальные вопросы онкологии и медицинской радиологии.- Минск.- 1986.- N 2.- С. 12-17]. Однако этот метод имеет следующие существенные недостатки: не все из тестов комплекса несут адекватную патогенетическую нагрузку и не равнозначны по своей диагностической ценности; совокупность тестов данного комплекса не отражает все основные биохимические стадии онкопатогенеза. Поэтому данный комплекс дает большой процент ошибок по чувствительности и специфичности.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и специфичности диагностики опухолевых заболеваний на ранних стадиях развития и выявление предопухолевых заболеваний с целью проведения своевременных профилактических мероприятий.

Поставленная задача достигается тем, что в способе выявления "группы опухолевого риска" и скрининга ранних стадий опухолевых заболеваний, включающем несколько индивидуальных тестов, согласно изобретению, во-первых, предлагается комплекс из пяти тестов, наиболее адекватных основным стадиям онкопатогенеза и поэтому наиболее чувствительных и специфичных к опухолевым заболеваниям: Болена, флуоресцентный, Короткоручко, аспириновый и реакция перекисного гемолиза эритроцитов. Во-вторых, вводится дифференциальная оценка результатов каждого из этих тестов, выделяются ключевые ответы для подведения итогов комплекса по сочетанию результатов основных тестов (тесты Болена и флуоресцентный, реакция перекисного гемолиза) и дополнительных (тесты аспириновый и Короткоручко). Окончательный диагноз при подведении итогов выдается по комплексной оценке всех используемых тестов, с учетом диагностической чувствительности и специфичности каждого. В-третьих, предварительные результаты обрабатываются по предлагаемой компьютерной номограмме, что дает возможность получить также ориентировочные данные по локализации и характеру опухоли (доброкачественный или злокачественный, если таковая диагностируется).

Предлагаемый комплекс методов скрининга опухолевых заболеваний основан на современных представлениях о молекулярных механизмах онкопатогенеза, согласно которым онкотрансформация клетки сопровождается переходом обмена веществ в ней на эмбриональный тип развития. Каждый из данных тестов основан на определенных стадиях онкопатогенеза, их комплексное использование для скрининга опухолевых заболеваний отражает все его ключевые стадии. Причем три из них (тест Болена, реакция перекисного гемолиза и флуоресцентный тест) являются достаточно специфичными для онкологических заболеваний, поскольку в их основе лежат начальные стадии возникновения и развития клонов опухолевых клеток.

Ключевые этапы онкопатогенеза [5-8], лежащие в основе выбранных методик, отражены на схеме 1 (см. в конце текста).

Способ проведения скрининга следующий. Утром натощак берется 0,6 мл капиллярной крови в 0,15 мл раствора антикоагулянта в центифужную пробирку и одновременно берутся капли крови на обезжиренное стекло для теста Болена. Работают как с полученной из крови плазмой, так и с эритроцитарным осадком. Исследования флуоресценции плазмы выполняются на спектрофлуориметре любого производства. Средние нормальные значения для тестов и изменения значений при онкопатологии представлены в таблице 1.

Отделяют плазму путем центрифугирования 15-20 минут при 1,5 тыс. об. /мин, отбирают ее.

Реакция перекисного гемолиза. В оставшуюся в пробирке, после удаления плазмы, эритроцитарную массу приливают 2 мл 1,5% перекиси водорода, приготовленной на 0,9% физиологическом растворе. Осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Добавляют 2 мл дистиллированной воды, еще раз перемешивают и центрифугируют при 1,5 тыс. об./мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость колориметрируют в кювете N 3 при 540 нм против дистиллированной воды. Определяют оптическую плотность исследуемого раствора.

Тест показывает устойчивость мембран эритроцитов к перекисному окислению липидов. Этот показатель связан с фосфолипидным и олигосахаридным составом мембран красных кровяных телец.

Аспириновый тест. 0,1 мл полученной плазмы заливают 1 мл 0,1% раствора аспирина, приготовленного на 0,9% физиологическом растворе. Смесь оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Колориметрируют в кювете N 3 при длине волны 756 нм против воды. Параллельно колориметрируют контрольный раствор - смесь 0,1 мл плазмы с 1 мл 0,9% физраствора.

Результат определяется по формуле: X = (D₁ - D₀) • 100, где D₁ - показатель оптической плотности опытного раствора; D₀ - показатель оптической плотности контрольного раствора.

Данным методом количественно определяется изменение в концентрации иммуноглобулинов G, A, E (что косвенно отражает антигенный состав мембран клеток) и медиаторов воспаления (доминирование анаэробного гликолиза).

Тест Короткоручко. 0,1 мл полученной плазмы обрабатывают 1,5% раствором соляной кислоты, перемешивают, через 30 секунд добавляют 0,2 мл 10% раствора азотной кислоты и вновь перемешивают. Через 20 секунд приливают 1,5 мл дистиллированной воды. Колориметрируют через 50-60 секунд в кювете N 3 при длине волны 315 нм против дистиллированной воды.

Результат определяется по формуле: X = D • 100 ед, где D - оптическая плотность опытного раствора.

Данной методикой определяется концентрация иммуноглобулина G, что косвенно связано с изменением в антигенном составе клеток при возникновении опухолевых заболеваний.

Флуоресцентный тест. 0,1 мл плазмы разводят дистиллированной водой в соотношении 1:20. Флуоресцентную кривую снимают в диапазоне 325 - 600 нм на спектрофлуориметре. Волна возбуждения 317 нм. Кривая должна иметь два пика. Первый - в области 340-350 нм, второй - в области 450-460 нм (флуоресценция белков и коферментов НАДН, НАДФН). Результаты получают по соотношению высот пиков по формуле:
X = h₃₆₀/h₄₆₀;
где h₃₆₀ - высота пика флуоресценции при 360 нм, в см (белковый пик);
h₄₆₀ - высота пика флуоресценции при 460 нм, в см (флуоресценция коферментов НАДН и НАДФН).

Тест указывает на доминирование в биоэнергетических процессах клетки анаэробного гликолиза, что влечет за собой уменьшение концентрации окисленных форм дыхательных коферментов НАДН и НАДФН.

Тест Болена. При заборе крови первые ее капли берут на чистое, обезжиренное стекло. Высушивают при комнатной температуре. Рассматривают под микроскопом при увеличении 7х8. Результат определяется визуально по рисунку пятна фиг.1.

Тест отражает изменения антигенного, фосфолипидного и олигосахаридного состава мембран клеток, в том числе и эритроцитарных, развивающиеся в процессе онкопатогенеза.

Отрицательный результат (до 5 ед.) - тонкая капля крови высыхает и дает упорядоченную, неразорванную структуру фибриновой сети. Между нитями фибрина аккуратно, без разрывов уложены красные клетки крови. Цвет пятна в середине темнее, в центре имеется "ядро" из фибриновых нитей. По краям цвет пятна бледнее, пятно тоньше.

Положительный результат (10 и выше ед.) - высохшее пятно крови имеет разорванную структуру. Нити фибрина расположены беспорядочно, эритроциты местами агглютинированы, в результате чего в пятне появляются пустоты. "Ядро" в центре пятна невыражено. Цвет пятна чаще всего получается равномерным - либо ярким по всему пятну, либо равномерно бледным.

Методы несложны в исполнении, что позволяет проводить массовые обследования предложенным комплексом с целью выявления "групп опухолевого риска". Эти группы по результатам обследований должны включать больных предопухолевыми заболеваниями, а также больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями. Дальнейшая обработка результатов с помощью компьютерной номограммы позволяет уточнить диагностическое предположение.

Компьютерная номограмма. При проведении широкомасштабных испытаний предлагаемого способа в клинической практике было обследовано около 1500 пациентов. Это позволило установить следующие количественные характеристики чувствительности и специфичности данных тестов: тест Болена - диагностическая чувствительность (ДЧ) = 89%, диагностическая специфичность (ДС) = 79%, реакция перекисного гемолиза - ДЧ=86%, ДС=80,5%, аспириновый тест - ДЧ=73%, ДС=63%, флуоресцентный тест - ДЧ=88%, ДС=72,7%.

Тест Короткоручко является наиболее чувствительным к злокачественным образованиям легких, желудка и женской половой сферы (ДЧ=71% при ДС=51%), но не обладает большой чувствительностью для скрининга доброкачественных опухолевых заболеваний и злокачественных новообразований других органов (ДЧ=38%). Поэтому его можно применять для ориентировочного определения локализации заболевания.

Исходя из полученных значений ДЧ и ДС была построена компьютерная номограмма для четырех тестов комплекса - двух эритроцитарных (тест Болена и реакция перекисного гемолиза) и двух плазменных (аспиринового теста и теста Короткоручко в качестве уточняющего локализацию). Данные флуоресцентного теста не были включены в компьютерную номограмму, так как оборудование для его проведения является малодоступным для большинства клинико-диагностических лабораторий России.

В результате обработки данных, получаемых при обследовании пациента, выдается три варианта ответа: здоров, сомнительный ответ с необходимостью контроля через 3-6 месяцев, диагностируемое заболевание. Первая группа снимается с дальнейшего обследования, вторая - ставится на учет и делаются контрольные пробы через определенный срок. Результаты анализов третьей группы пациентов еще раз подвергаются компьютерному анализу с целью определения вероятного характера и места локализации патологии. Иными словами, получают ответы относительно вероятности наличия и локализации опухоли, является ли она доброкачественной или злокачественной (либо туберкулез, в случае заболеваний легких).

Некоторые примеры компьютерных моделей, получаемых при обработке результатов, представлены на фиг. 2. Схема компьютерной номограммы приводится на фиг. 3.

Способ не требует сложной лабораторной аппаратуры, технически прост и быстр в исполнении, поэтому позволяет проводить массовые профилактические медосмотры на базе обычных биохимических и клинико-диагностических лабораторий в широкой поликлинической сети.

Пример 1. Больная М., 1929 г.р. Направлена на анализы через 10 месяцев после операции по поводу рака молочной железы II стадии. Проведено послеоперационное лечение, больная поставлена на учет. Результаты: тест Болена - 10 ед. , реакция перекисного гемолиза - 0,27; аспириновый тест - 3,5 ед., тест Короткоручко - 7,5 ед. Наблюдаются отклонения в результатах трех тестов.

Заключение: большая вероятность опухолевого заболевания злокачественного характера. Окончательный диагноз: рак второй молочной железы 1-2 стадии.

Больная была прооперирована, пролечена. Наблюдалась длительное время (в течение 4 лет). Последние результаты комплекса таковы: тест Болена - 2,5 ед. , реакция перекисного гемолиза - 0,69; аспириновый тест - 20 ед., тест Короткоручко - 5,5 ед. Наблюдаются отклонения только в результатах аспиринового теста. Заключение: новообразований нет, имеется воспалительный очаг. Окончательный диагноз: новообразований нет.

Пример 2. Больной А. 1946 г.р. Направлен на обследование после операции по поводу рака легкого 2-3 стадии. Проведена химиотерапия, прошло 6 месяцев. Чувствует себя плохо. При обследовании ничего не найдено. Результаты комплекса: тест Болена - 12,5 ед., реакция перекисного гемолиза - 0,37; аспириновый тест - 51 ед., тест Короткоручко - 13 ед. Наблюдается отклонение по четырем тестам из пяти. Заключение: имеется новообразование с большей степенью вероятности злокачественное, локализация в легких. Окончательный диагноз: рецидив рака легкого.

Пример 3. Больная Д, 1959 г.р. Жалоб нет, самочувствие нормальное. Тесты выполнялись во время медосмотра на работе. Результаты: тест Болена - 7,5 ед. , реакция перекисного гемолиза - 0,90; аспириновый тест - 15 ед., тест Короткоручко - 6 ед. Наблюдаются небольшие отклонения. Заключение: вероятность доброкачественного опухолевого новообразования.

Окончательный диагноз: Проведенное позже обследование ничего не выявило, но спустя год обнаружена быстрорастущая миома.

Пример 4. Пациент Т, 1960 г.р. Жалоб нет, самочувствие нормальное. Тесты выполнялись во время профосмотра по месту работы. Результаты: тест Болена - 5 ед. , реакция перекисного гемолиза - 0,75 ед.; аспириновый тест - 27 ед., тест Короткоручко - 6,5 ед. Наблюдаются отклонения в двух тестах. Заключение: новообразований нет. Имеется воспалительное заболевание. Окончательный диагноз: опухолевого заболевания нет. По результатам УЗИ - мочекаменная болезнь.

Пример 5. Пациент С., 1970 г.р. Жалоб нет, самочувствие хорошее. Тесты выполнялись во время медосмотра. Результаты: тест Болена - 2,5 ед., реакция перекисного гемолиза - 0,60 ед.; аспириновый тест - 5 ед., тест Короткоручко - 4 ед. Заключение: отклонений в результатах маркеров не наблюдается. Окончательный диагноз: здоров.

Таким образом, предложенный комплексный способ обоснован с точки зрения онкопатогенеза и позволяет, в сочетании с компьютерной обработкой результатов, учитывающей диагностическую специфичность и чувствительность каждого теста, повысить диагностическую эффективность проводимого скрининга от 66 до 96%, в зависимости от локализации опухоли, а также выявлять "группы опухолевого риска".

Кроме того, появляется возможность проводить профилактические мероприятия по выявлению предопухолевых заболеваний и коррекции таких состояний под безопасным лабораторным контролем с помощью данного комплекса, а также проводить диспансерное наблюдение онкологических больных, получивших определенное лечение.

Указанные особенности изобретения представляют его отличия от прототипа и обуславливают новизну предложения. Эти отличия являются существенными, поскольку именно они обеспечивают достижение положительного эффекта, отраженного в задаче предложения, и отсутствуют известные способы выявления "группы опухолевого риска" и скрининга предопухолевых заболеваний с таким же положительным эффектом.

Изобретение относится к медицине. Способ характеризуется тем, что вводят в комплекс только обоснованные с точки зрения онкопатогенеза тесты (тесты Болена, Короткоручко, флуоресцентный, аспириновый и реакция перекисного гемолиза эритроцитов). Оценку вклада каждого из тестов в общий результат комплекса проводят дифференцированно с учетом диагностической чувствительности и специфичности каждого теста на основе компьютерной номограммы обработки получаемых результатов и при результатах по тесту Болена > 10 ед., ПГЭ < 0,5 ед. или > 0,8 ед., по аспириновому тесту > 15 ед., по тесту Короткорученко > 7 ед., по флуоресцентному тесту > 0,91 ед., выявляют "группу опухолевого риска" и проводят скрининг ранних стадий опухолевых заболеваний. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа. 1 табл., 3 ил.

Способ выявления "группы опухолевого риска" и скрининга ранних стадий опухолевых заболеваний, включающий комплекс биохимических методик, отличающийся тем, что из комплекса методик выбирают тест Болена, реакцию перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ), аспириновый тест, тест Короткоручко, флуоресцентный тест и при значении результатов по тесту Болена > 10 ед., ПГЭ < 0,5 или >0,8 ед., по аспириновому тесту > 15 ед., по тесту Короткоручко > 7 ед., по флуоресцентному тесту > 0,91 ед. выявляют "группу опухолевого риска" и проводят скрининг ранних стадий опухолевых заболеваний.