СПОСОБ РЕКУЛЬТИВАЦИИ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ Российский патент 1997 года по МПК B09C1/10 C09K3/32 C12N1/20 B09C101/00 C12R1/07 C12N1/20 

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к охране почвенных ресурсов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.

Нефтяная промышленность является одним из основных загрязнителей природной среды (почв, поверхностных водоемов, грунтовых вод и др.). При этом наибольшую опасность для живых организмов представляет загрязнение почв, поскольку благодаря огромной адсорбирующей поверхности загрязняющие вещества могут накапливаться в них в значительных количествах. В ряде исследований показано, что загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами приводит к нарушению естественных биоценозов, ухудшению агрофизических и агрохимических свойств почв, снижению урожайности сельскохозяйственных растений, ухудшению экологической обстановки в районах нефтедобычи. Естественные процессы самоочищения и восстановления почв, загрязненных нефтью, протекают достаточно медленно, особенно при высоких дозах загрязнения. Известно, что при легком механическом составе, например, супесчаных и суглинистых почв легкие фракции нефти и нефтепродуктов могут проникать на глубину 1,5-2,0 м, уничтожая все живое и подавляя биологическую активность почв. Опыт ликвидации нефтяного загрязнения Аляски, где в марте 1983 г. в результате аварии танкера в море и на береговые пляжи попало 11 млн. галлонов сырой нефти, показал, что физические методы очистки при таких масштабах загрязнения нефтью совершенно не эффективны (1, 2).

Показано, что значительному ускорению разложения нефти и нефтепродуктов в лабораторных опытах и in situ способствует применение штаммов нефтеразрушающих микроорганизмов. Однако их рост лимитируется недостатком кислорода, азота и фосфора, что требует периодического внесения извне составов, содержащих названные биогены, а также стимуляторов роста микроорганизмов, что усложняет технологию очистки от нефтяного загрязнения и значительно удорожает ее (3, 4).

Известны также методы, направленные на активизацию жизнедеятельности естественной почвенной микрофлоры, однако они трудоемки и связаны с большими материальными затратами (5).

Большинство известных схем рекультивации включает, как правило, следующие основные этапы: 1) снятие верхнего загрязненного слоя с вывозом за пределы зоны рекультивации с последующим складированием и обезвреживанием; 2) доставка и нанесение вместо удаленного загрязненного слоя почвы плодородного грунта. Применяют также приемы буртования, заключающиеся в сооружении фундамента бурта (земляной насыпи) вокруг загрязненного участка и подготовке почвы к закладке в бурт (рыхление, внесение минеральных питательных веществ, инертных структурообразователей и т.д.). Однако этот метод имеет ограничения, поскольку его нельзя применять в случае тонкодисперсного сложения почв, в присутствии большого количества неорганических соединений и при высокой токсичности почв (6).

Наиболее близким к предлагаемому является способ биологической рекультивации нефтезагрязненных почв с применением бактериального препарата "Путидойл", полученного на основе природного штамма бактерий Pseudomonas putida 36 (7). Опыты, проведенные на загрязненных нефтью лесных почвах Среднего Приобья, показали, что препарат "Путидойл" способствует уменьшению концентрации нефти только в сочетании с механической обработкой почвы (переворотом пластов), при этом эффективность применения бакпрепарата составляла 29,3% Установлено также, что без какой-либо предварительной механической обработки разложение нефти в почве под воздействием препарата "Путидойл" (на 29,8%) происходит только при наличии достаточного увлажнения почвы при недостаточном увлажнении почвы работы по рекультивации с применением бактериального препарата "Путидойл" были неэффективны.

Заявляемый способ устраняет все вышеизложенные недостатки известного технического решения. Предлагаемый способ биологической рекультивации нефтезагрязненных почв позволяет под воздействием микроорганизмов ускорять процесс биодеградации углеводородов нефти, повышать показатели биологической активности и восстанавливать агрофизические свойства почв, нарушенные нефтяным загрязнением.

Это достигается путем применения бактериального препарата "Бациспецин", полученного на основе природного штамма Bacillus sp. 729. Бактериальный препарат "Бациспецин" выпускается Приволжским опытно-промышленным биохимическим заводом и представляет собой сыпучий порошок светло-кремового цвета, хорошо смачивается водой, титр 2,0 х 10^в соленеобразующих единиц/г. Препарат использован из расчета 500 г/м² почвы с титром 8•10⁵ KOE/г.

Бактериальный препарат "Бациспецин" получен на основе природного штамма Bacillus sp. выделенного из почвенного образца серой лесной среднегумусной почвы Башкирского Предуралья и депонирован в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 132 в группе споровых культур. Штамм обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грибов-фитопатогенов, не изменен генетически, соответствует принятым нормам безопасности и не представляет опасности для человека и животных [8]
Штамм Bacillus sp. положенный в основу препарата, обладает высокой приспособляемостью к условиям внешней среды, способностью к росту и развитию в широком диапазоне температур при наличии или отсутствии кислорода, а также способностью использовать в качестве источника питания широкий спектр органических и неорганических соединений.

Из научно-технической и патентной литературы не известно применение бактериального препарата "Бациспецин", полученного на основе природного штамма Bacillus sp. для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Таким образом, предлагаемое изобретение соответствует критерию "существенные отличия".

Примеры конкретного выполнения
Полевые испытания способа биологической рекультивации нефтезагрязненных почв проводились на выщелоченном черноземе с содержанием гумуса в слое 0-20 см в среднем 8,2% общего азота 0,45% валового фосфора 0,12% и рН водной суспензии 6,0. Повторность опытов трехкратная. Для моделирования загрязнения почвы использовали сырую нефть с Сергеевского месторождения Башкирии.

Физико-химическая характеристика нефти:
плотность 0,867 0,913 г/см³;
вязкость при 20^oC 17 20 сCт;
содержание серы 4,2%
смол 15%
асфальтенов 5,6%
парафинов 5,8%
В пахотную почву после дискования на глубину 10 см нефть вносили из расчета 8 и 25 л/м², а затем под вспашку на различных агрофонах (с применением органических и минеральных удобрений) вносили препарат "Бациспецин". Удобрения вносили в почву в соответствии со схемой опыта: 1) без внесения нефти; 2) нефть, 8 л/м²; 3) нефть, 25 л/м² фон; 4) фон + препарат "Бациспецин",5) фон + навоз, 70 т/га + препарат "Бациспецин", 6) фон + зеленая масса трав люцерны и костра безостого, 15 т/га; 10) фон + навоз 70 т/га. Почвенные образцы для анализов отбирали через 3 дня (I срок исследования), 30 дней (II срок), 60 дней (III срок), 90 дней (IV срок) после внесения нефти. Для оценки интенсивности разложения нефти использовали показатели остаточного содержания нефти в почве, скорости продуцирования микроорганизмами CO₂, ферментативной активности и численности микроорганизмов.

Содержание остаточной нефти определяли по методу McGill, Rowell (9), активность дегидрогеназы по методу А.Ш. Галстяна (10), пероксидазы, полифенолоксидазы по методу Л.А. Карягиной, Н.А. Михайловской (11).

Численность основных групп микроорганизмов определяли по общепринятой методике (12): бактерий, усваивающих органический азот на мясопептонном агаре (МПА), бацилл на картофельном агаре, микроскопических грибов (микромицетов) на среде Чапека.

Для измерения скорости образования СО₂ 50 г почвы помещали в стеклянные флаконы объемом 550 мл и закрывали их герметично пробками из самоуплотняющейся резины. Пробы воздуха объемом 0,5 мл отбирали шприцем через 10-24 часов, и измеряли в них концентрацию СО₂ на газовом хроматографе ЛХМ-8МД с катарометром в качестве детектора. Условия определения: газ-носитель гелий 20 мл/мин, адсорбент Полисорб, колонка из нержавеющей стали 100 х 0,3 см, t 42^oC.

Для определения содержания органического углерода навеску почвы 0,05 г в конических колбах заливали 20 мл 0,4 н. окислительной смеси, и окисление органического вещества проводили в термостате при температуре 160^oC в течение 20 минут. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-46, при 590 нм (13).

Результаты испытания биологического способа рекультивации нефтезагрязненных почв показали, что внесение бактериального препарата "Бациспецин" в нефтезагрязненную почву способствует увеличению численности почвенных микроорганизмов, принимающих участие в трансформации нефти - бактерий, растущих на МПА, в 2,4 раза, бацилл в 3,0 раз, грибов в 1,6 раза (таблица 1). Максимальная численность всех учтенных групп микроорганизмов отмечалась в варианте с внесением микробного препарата на фоне дополнительного внесения минеральных и органических удобрений (навоза). Раздельное внесение только минеральных удобрений (//РК)₉₀ или навоза (70 т/га) без микробного препарата во II срок исследования (30 дней) стимулирующего эффекта не оказало. Через 60 дней в удобренных вариантах опыта под воздействием "Бациспецина" численность бактерий-деструкторов органики повысилось в среднем в 7 раз, микроскопических грибов в 2 раза. В варианте с внесением только микробного препарата в этот срок исследования отмечена максимальная численность всех исследуемых групп почвенных микроорганизмов: количество бактерий возрастает в 14,6 раза, бацилл в 2 раза, микромицетов в 3 раза.

Определение ферментативной активности показало, что нефтяное загрязнение повышает активность дегидрогеназы и оказывает ингибирующее действие на пероксидазу и полифенолоксидазу (табл. 2). Внесение бактериального препарата на фоне удобрений значительно повысило активность дегидрогеназы одного из основных ферментов, участвующих в процессе биодеградации углеводородов нефти, что подтверждается и показателями остаточного содержания нефти в почве (табл. 3). Так, например, в необработанных бактериальным препаратом вариантах опыта содержание нефти за 2 месяца практически не изменилось, в то время как за этот же период под воздействием "Бациспецина" разложилось около 43% нефти (при внесении либо одного бактериального препарата, либо в сочетании с зеленым удобрением).

Об ускорении биоразложения нефти и усилении процессов минерализации органического вещества нефти при заявленном способе рекультивации свидетельствует также динамика продуцирования CO₂ (табл. 4). Установлено, что наибольшая активность минерализационных процессов наблюдается при внесении только бактериального препарата или в сочетании с зелеными удобрениями, что связано с дополнительным внесением в почву легкометаллизируемого источника энергии для микроорганизмов. Интенсивность минерализации углеводородов нефти в вариантах с совместным внесением препарата Бациспецин и органических удобрений выше в 2 4 раза в сравнении с самоочищающей способностью почвы. По истечении 3 месяцев происходит выравнивание показателей интенсивности минерализационных процессов в различных вариантах опыта.

Под воздействием препарата Бациспецин происходит также восстановление водно-физических свойств и влагоудерживающей способности почв (табл. 4).

Таким образом предлагаемый способ биологической рекультивации почв с применением бактериального препарата "Бациспецин" по сравнению с известным позволяет повысить эффективность процесса биоразложения нефти в почве, активизировать микробиологическую и ферментативную активность почв, улучшить дыхание почв (по показателю СО₂) и восстановить водно-физические свойства рекультивируемых почв, что чрезвычайно важно при дальнейшем введении их в сельскохозяйственный оборот и использовании под посевы многолетних трав или злаковых культур. Использование предлагаемого способа в отличие от принятых в практике известных способов позволяет проводить рекультивацию нефтезагрязненных почв без предварительного нанесения плодородного почвенного слоя на их поверхность. Предлагаемый способ прост в реализации, экономически безопасен, не требует применения дефицитных материалов и специальной техники, что в сочетании с налаженным промышленным производством препарата Бациспецин делает его перспективным для широкого внедрения в районах с интенсивной нефтедобычей, а также на территориях, расположенных вдоль систем магистрального транспорта нефти и нефтепродуктов.

Список литературы
1. Хазиев Ф.Х. Тишкина Е.И. Киреева Н.А. Кузяхметов Г.Г. Влияние нефтяного загрязнения на некоторые компоненты агроэкосистемы //Агрохимия, 1988, N 2, с.56-61.

Pritchard P. H. Costa C.F. ERA's Alaska oil spill bioremedition project //Environ.Sci.and Technol, 1991, 25, N 3, p.372-379.

3. Leahy Joseph G. Colwell Rita R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment //Microbiol.Rev, 54, N 3, p.305-315.

4. Ellis B. Balba M.T. Theila P. Bioremediation of oilcontaminated land //Environ.Technol, 1990, 11, N 5, p.443-454.

5. Оборин А.А. Калачникова И.Г. Масливец Т.А. и др. Самоочищение и рекутивации нефтезагрязненных почв Предуралья и Западной Сибири. - Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М. 1988, с.140-159.

Katzer W. Mietenverfahren zur mikrobiologischen Bodtnsanierung //Entsorg.Prax, 1992, N 3, p.92-97.

7. Дядечко В.Н. Толстокорова Л.Е.Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных лесочных почв Среднего Приобья //Почвоведение, 1990, N 9, с.148-151.

8. Авторское свидетельство СССР N 1743019, кл. A 01 N 63/00, C 12 N 1/20, 1989.

9. McGill W.B. Rowell M,J.Determination of oil content of oil contaminated soil //The Science of the total Environment, 1980, 14, p.245-253.

10. Галстян А.Ш. К методике определения активности дегидрогеназ в почве// Докл. АН АрмССР, т.35, N 14, с.181-184.

11. Карягина Л.А. Михайловская Н.А. Определение активности полифенолоксидазы и пероксидазы //Вести АН БССР. Сер.сельскогоспод. наук, 1986, N 2, с. 40-41.

12. Звягинцев Д. Г. Методы почвенной микробиологии и биологии. М. МГУ, 1980, с.223.

13. Хазиев Ф.Х. Мукатанов А. Х. Багаутдинов Ф.Я. и др. Органическое вещество почв Башкирии Уфа. изд-во БНЦ УрО РАН, 1990,с.200.

Использование: для охраны почвенных ресурсов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Сущность изобретения: для активации процесса биодеградации нефти в почве использовали штамм Bacillus sp. Штамм выделен из серой лесной среднегумусной почвы Башкирского Предуралья и депонирован в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 132 в группе споровых культур. На основе штамма Bacillus sp. получен препарат "Бациспецин", опытная промышленная партия которого наработана Приволжским биохимическим заводом. Применение бактериального препарата "Бациспецин" позволяет очистить почву от нефти и нефтепродуктов. Микроорганизмы не изменены генетически, соответствуют принятым нормам безопасности и не представляют опасности для человека и животных. 4 табл.

1 Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, путем обработки почвы бактериальным препаратом на основе природного штамма бактерий, отличающийся тем, что из штаммов используют штамм бактерий Bacillus species ВНИИСХМ N 132.