Способ определения токсичности зернопродуктов и комбикормов Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/40 

микроскопическими грибами и содержащих микотоксины. Инкубирование экстрактов микотоксинов и тест-объекта проводят при 38-42 С в течение 10- 15 мин, а о токсичности судят по снижению активности фермента. Продолжительность анализа 3-4 ч.

.Пример. К навеске измельченного зерна, продуктов его переработки (отруби, мучки) или комбикорма массой 50 г приливают 150 см3 ацетона, встряхивают на шуттель-аппара- те в течение 1 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу, куда добавляют 50 см3 гексана и 100 см3 1%-ного раствора NaCl. Содержимое колбы перемешивают в течение 1 мин, а затем выливают в делительную воронку. После расслоения жидкости верхний (гексановый) слой отбрасывают, а нижний (водно-ацетоновый) переносят в другую делительную воронку ,и экстрагируют токсические вещества хлороформом трижды (50, 20, 20 см3). Хлороформные экстракты объединяют, пропускают через фильтрат с безводным сульфатом натрия и выпаривают в выпарительной чашке на водяной бане (50-60°С) досуха. Сухой остаток ацетоном количественно переносят в мерную колбу взаимностью 50 см3 и доводят до метки.

О токсичности исследуемого экстракта судят по изменению активности глюкоамилазы - глюконигрина Г20х при добавлении в инкубируемый раствор 1 см3 экстракта. К контрольному раствору добавляют 1 см3 чистого ацетона.

Активность глюкоамилазы определяют приятным глюкозооксидазным методом, основанным на специфическом определении глюкозы, образующейся при действии глюкоамилазы на растворимый крахмал.

Активность глюкоамилазы в предлагаемом способе при воздействии экстракта из корма определяют следующим образом. К 10 см3 1%-ного раствора крахмала, нагретого до 42°С, приливают 5 см3 раствора глюкоамилазы и 1 см3 экстракта исследуемого корма, инкубирают смесь в термостате при 42°С в течение 15 мин. Через 15 мин отбирают 1 см3 гидролизата и кипятят 10 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, вносят 3 см3 раствора С согласно действую0

щей методике, перемешивают, оставляют на 45 мин при комнатной температуре и в дальнейшем определение проводят согласно пейг.тт ющему глкжо- зооксидазному методу.

Для определения чувствительности и достоверности значения нижнего предела снижения активности глюкони- грина Г20х проведена метрологическая оценка полученных данных. Снижение активности тест-объекта - глюконигрина Г20х достоверно устанавливается при концентрации глюконигрина от 5 ЮМ и исследуемых микотоксинов

от 3,0-10 °М, при этом отсчет определения токсичности производится с 20% потери активности фермента - деградации молекулы глюконигрина от действия токсического фактора.

Сравнительная характеристика известных и предлагаемого методов определения токсичности и их пороговая чувствительность приведена в табл. 1„ 5Из данных табл. 1 следует, что

при действии экстрактов из кормов, зараженных продуцентами токсинов Т-2, Ф-2, охратоксина А, афлатоксина В. активность глюкоамилазы достоверно снижается на 42, 29, 37 и 32% соответственно.

Предлагаемьй способ определения токсичности определяет присутствие микотоксинов в концентрации 10 мкг/пробу, что подтверждает значительно большую чувствительность предлагаемого способа, чем используемые в настоящее время биометоды.

Для сравнения существующих методов с предлагаемым готовили пробы доброкачественного зерна, зерноотходов, комбикорма и такие же пробы, но содержащие определенное количество искусственно зараженного токсиген- ными грибами-продуцентами токсинов Т-2, ф-2,. охратоксина А и афлатоксина В корма, которые были исследованы на токсичность (см. табл. 2).

Из данных табл. 2 следует, что молекула глюкоамилазы - глюконигрина 0 Г20х достоверно уменьшает каталитическую активность при действии экстрактов зараженных микотоксинами кормов - до 84% от исходной, что может служить тестом для определения ток- 5 сичности. При понижении активности фермента от 20% и более пробы комбикорма или зернопродуктов считаются токсичными.

0

5

0

5

51

Использование молекулярйой модели для оценки токсичности позволяет за 3-4 ч получить окончательный результат, что позволяет считать этот метод экспрессным.

Формула изобретения

Способ определения токсичности зернопродуктов и комбикормов,включающий экстрагирование токсинов,

86

инкубацию их с тест-объектом с последующей оценкой токсичности, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и сокращения длительности, в качестве тест-объекта используют фермент глюкоамилазу-глюконигрин Г20х в концентрации М, инкубацию проводят при 38-42°С в течение 1015 мин, а оценку проводят по снижению активности фермента.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в кормопроизводстве, в частности в определении токсичности зерна, различных продуктов его переработки, комбинированных кормов, пораженных И зобретеиие относится к биотехнологии и может быть использовано в области кормопроизводства, в частности в определении токсичности зерна, различных продуктов его переработки, комбинированных кормов, пораженных микроскопическими грибами и содержащих их токсические метаболиты (мико- токсииы). Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение длительности.j микроскопическими грибами и содержащих их токсические метаболиты (мико- токсины). Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение длительности. Для этого в качестве тест-объекта используют отечественный ферментный препарат глкжо- амилазы - глюконигрин Г20х, который инактивируется в различной степени при инкубировании с экстрактами из токсичных кормов. Определение токсичности основано на снижении активности фермента глюкоамилазы - глюко- нигрина Г20х под действием как очищенных чистых препаратов микротоксинов, так и экстрактов из кормовых средств, инфицированных микроскопическими грибами и содержащих мико- токсины. Инкубирование экстрактов микотоксинов и тест-объекта проводят при 38-42°С в течение 10-15 мин, а о токсичности судят по снижению активности фермента. Продолжительность анализа 3-4 ч. 2 таблЛ о Ј (Л Для этого в качестве тест-объекта используют отечественный ферментньй препарат глюкоамилазы - глюконигрин Г20х, который инактивируется в различной степени при инкубировании с экстрактами из токсичных кормов. . Определение токсичности основано на снижении активности фермента глюкоамилазы - глюконигрина Г20х под действием как очищенных чистых препаратов микотоксинов, так и экстрактов из кормовых средств, инфицированных о Ј 00 00 00

Пороговая чувствительность различных метолов опрслг- тончн токсичности

Таблица 2

Влияние экстрактов из доброкачественных и токсичных комбикормов и зернопродуктов на активность глюконигрина Г20х (исходная активность 105,5 ед/мг белка)

Доброкачественное зерно и комбикорма(не токсично)

ПшеницаНет105,4+0,56

Ячмень- -105,4+0,42

Кукуруза- -105, +0,24

Отруби- -105,3+0,60

Комбикорм- -104,9+0,64

Зернопродукты и комбикорма, зараженные микотоксинами (токсично)

Пшеница

Ячмень

v-з

,2

-3

Т-2 3,0-10 Ф-2 2, Охратоксин А 7,5-10 Афлатоксин В 8,42-10 Т-2 1,9ЧО-3

-а

з

ь-2 2,0-10 Охратоксин А 3,040 Афлатоксин В 4,110

Г -ъ

61,2+0,33

74,9+0,51

66,5+.0,48

71,8+0,57

67,5+0,30

71,7+0,08

52,7+0,11

74,9+0,28

42 29 37 32 36 32 50 29

Таблица I

(в преде- лах ошиб- ки опыта)

3

-а

-ъ

61,2+0,33

74,9+0,51

66,5+.0,48

71,8+0,57

67,5+0,30

71,7+0,08

52,7+0,11

74,9+0,28

42 29 37 32 36 32 50 29

Пробы комбикормов перед экстракцией ацетоном были просеяны по ГОСТ 13496.8-72.

Редактор Т.Лазоренко

Составитель И.Тареева Техред М.Дидык

Заказ 1126

Тираж 373

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

1641888

8 Продолжение табл.2

Корректор М.Максимишинец

Подписное