СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФИБРИНОГЕНА В АНТИКОАГУЛИРОВАННОЙ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 G01N11/00 A61B5/14 

Это изобретение относится к способу определения количественного содержания фибриногена в образцах крови. Более конкретно, это изобретение относится к способу быстрого и точного визуального определения содержания фибриногена в центрифугированном образце крови.

Фибриноген это основной протеин плазмы крови, который необходим для надлежащего свертывания крови. Количество фибриногена, присутствующего в крови, прямо пропорционально способности крови образовывать тромбы. Фибриноген в крови трансформируется в фибрин в процессе образования тромба, таким образом дефицит фибриногена будет выражаться в неадекватном образовании фибрина и неадекватном свертывании.

Недостаток содержания фибриногена в крови плазмы может быть вызван снижением образования фибриногена, которое может быть результатом печеночной недостаточности или вызвано врожденной гипофибриногенемией. Диссеминированная внутрисосудистая коагуляция крови, являющаяся патологическим случаем, может также создать большее, чем нормальное потребление фибриногена, пригодного для использования в проценте образования тромба. Очевидно, что недостаток фибриногена может привести к избыточному кровотечению.

Избыточное содержание фибриногена в крови также представляет аномальное явление, которое, как правило, связано с воспалительными процессами. Высокое содержание фибриногена в крови может способствовать возникновению гиперкоагуляции, что нежелательно. Значительное повышение содержания фибриногена также обнаружено у беременных женщин.

Также установлено, что увеличение концентрации фибриногена в крови также представляет фактор риска для сердечно-сосудистого заболевания.

Из вышеуказанного очевидно, что мониторинг содержания фибриногена в крови является полезной процедурой в определении состояния здоровья пациента, и может быть полезен как инструмент, позволяющий заранее определять аномальное физическое состояние. Анализ содержания фибриногена таким образом является необходимой процедурой контроля состояния здоровых людей или как метод определения на ранней стадии отклонений от нормы.

Имеется несколько методов количественного определения фибриногена плазмы крови. Используемые в настоящее время методы требуют, чтобы плазма была полностью отделена от красных кровяных клеток и более того, согласно этим методам необходимо, чтобы произошло превращение фибриногена в фибрин в отделенной плазме. Затем фибрин определяют количественно либо гравиметрическим способом, либо используя нефалометрию или химические методы анализа. Иммунологическое или химическое, или физическое количественное осаждение фибриногена в плазме крови также описывается в прототипе.

Процедура, описанная в 1971 году Миларом, относится к измерению полосы осажденного нагреванием фибриногена в центрифугированной фракции плазмы крови. Это осаждение нагреванием фибриногена было так же, как это сказано в статье Милара, описано и другими исследователями, включая Фредерика в 1977 году, Шульца в 1955, Гудвина в 1955 и Лоу и других в 1967. После отделения плазмы от остальной часть образца крови, плазму отбирают в гематокритную микропробирку и в этой пробирке ее нагревают в течение трех минут при температуре 56^oC на водной бане. Нагретый образец затем центрифугируют так, чтобы образовалась полоса осажденного фибрина в плазме. Количество фибриногена в образце затем определяют количественно путем деления высоты слоя фибрина на высоту первоначального слоя плазмы. Этот метод позволяет объемный процент осажденного уплотненного фибрина перевести непосредственно в концентрацию фибриногена и предполагает, что объем уплотненного фибрина выражаемый в мл/100 мл плазмы по существу составляет один процент (1%) концентрации фибриногена в образце крови, выражаемой в мг/100 мл крови. При использовании вышеописанной процедуры после нагревания и центрифугирования в надосадочной жидкости фибриноген не обнаруживается. Также было установлено, что другие протеины нормальной плазмы не осаждают в этой стадии нагревания.

Вышеописанные процедуры, за исключением методики, разработанной Лоу и другими, цитированной выше и описанной ниже, для количественного определения фибриногена относительно сложны и требуют затрат времени, поскольку их осуществление связано с предварительной обработкой образца цельной крови для отделения плазмы от других компонент крови. Отделенная плазма крови должна быть затем перенесена в другую емкость для проведения дальнейших операций и анализов. Сложность общей процедуры количественного определения фибриногена приводит к необходимости проведения этого анализа в медицинской исследовательской лаборатории, поскольку его трудно осуществить в кабинете врача.

Согласно методу Лоу и др. разработанному в 1967 году, стадия предварительного разделения компонентов крови от плазмы устранена, осажденный фибриноген не отделяют от светлого кровяного сгустка, который также осаждается поверх уплотненного слоя красных кровяных клеток (эритроцитов). Согласно писанию Милара метод Лоу и др. включает стадию трехминутного нагрева при 56^oC предварительно центрифугированной гематокритной микропробирки, содержащей образец крови. Затем пробирку раскручивают в центрифуге при 12,000 G, в течение трех минут, и осажденный при нагревании фибриноген оседает непосредственно над слоем аналогичного окрашенного светлого кровяного сгустка.

Настоящее изобретение относится к методу количественного определения содержания фибриногена в образце крови, который позволяет, используя простое центрифугирование образца крови в пробирке с поплавком, описанной в прототипе для измерения числа белых кровяных клеток (лейкоцитов), измерять фибриноген наряду с другими компонентами. Используемые операции по определению содержимого и общего числа клеток описаны в патентах США N 4027660 от 7.06.1977 г. N 4077396 от 7.03.1978, N 4082085 от 4.04.1978 и N 4137755 от 6.02.1979, которые все, в частности, объединены здесь во всей их полноте. Ряд дополнительных патентов был представлен здесь изобретателям, которые используют пробирку и все детали поплавка для проведения других анализов крови и других образцов.

В методе настоящего изобретения используется прозрачная пробирка, такая, как капиллярная пробирка, или ей подобная, для хранения образца крови. В пробирке размещают пластмассовый поплавок и в нее вносят образец крови. Размеченную стенку пробирки покрывают красками, увеличивающими интенсивность цвета крови клеток. Образец крови центрифугируют так, как это изложено в вышецитированных прототипах, и проводится считывание числа лейкоцитов, тромбоцитов и определение гематокритного числа. После начального центрифугирования и определения числа клеток, образец нагревают примерно в течение пяти минут при примерно 56^oC. Это нагревание сопровождается осаждением фибриногена из плазмы, после чего последующее центрифугирование приводит к оседанию осажденного фибриногена на верхней поверхности поплавка. Верх поплавка и верхний слой светлого сгустка крови разделены вполне различным расстоянием так, что слой фибриногена четко отличим от слоя светлого сгустка крови. Кольцевой зазор между поплавком и размеченной стенкой пробирки очень мал и препятствует проникновению нитей осажденного фибриногена внутрь его. Таким образом, слой (полоса) фибриногена четко различим и его аксиальная длина может быть только измерена с помощью соответствующим образцом модифицированного инструмента общего типа, описанного в патентах США N 4558947 от 17.12.1985, и N 4209226 от 24.06.1980. Инструмент и связанные с ним микропроцессорное устройство должны быть модифицированы таким образом, чтобы значения аксиальной длины слоя фибриногена можно было превратить в показания, дающие количественные данные по содержанию фибриногена в образце крови.

Формула пересчета в тех случаях, когда используется капиллярная пробирка, была установлена на основании лабораторного анализа образцов, использующего процедуру капиллярной пробирки, описанную здесь и стандартные процедуры, путем сопоставления результатов полученных согласно тем и другим методам. Формула для пересчета в тех случаях, когда используют коммерчески доступную венную капиллярную пробирку, поставляемую Bectonu Pickinsen and Company под торговой маркой "QBC", капиллярную пробирку, заполненную III d л крови, представлена следующим выражением: F_q KF₁ + b, в котором F_q это количественное содержание фибриногена в крови в мг/d л, F₁ это длина полосы осажденного фибриногена, обнаруженного в пробирке на верхушке поплавка, выраженная в единицах 0,0005 дюйма (0,127 мм), K постоянный множитель и b - рассчитываемая константа, которая меняется в зависимости от формы верхушки поплавка и диаметра пробирки. При использовании коммерчески доступной пробирки "QBC" и поплавка, константа K будет равна 3,411, константа 66,702. Другие значения K и b могут с легкостью быть определены путем простого эксперимента при использовании пробирок и поплавков различных размеров.

Вышеназванные значения K и b были определены на образцах крови от больных с гематокритными числами в интервале 30 48 (средняя величина 39,4), которые принято врачами считать нормальными. Образцы крови с аномально высокими или низкими значениями гематокритных чисел свидетельствуют соответственно о более низком или более высоком содержании, чем в нормальной плазме, при этом может возникнуть необходимость в соответствующем изменении значений K и b для того, чтобы получить достоверные данные по фибриногену.

Итак, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить улучшенный способ измерения содержания фибриногена в образце крови.

Есть еще одна цель настоящего изобретения, которая заключается в том, чтобы обеспечить способ, отличающийся тем, что простое центрифугирование образца будет приводить к образованию легко измеряемого слоя осажденного фибриногена в прозрачной пробирке для отбора образцов.

Кроме того, есть еще одна задача настоящего изобретения, состоящая в том, чтобы обеспечить способ, отличающийся тем, что содержащийся в образе крови фибриноген выделяется в виде осажденного фибриногена, как слой в пробирке для отбора образцов, отделенный от других элементов, образующих образец крови.

Еще одна цель настоящего изобретения это обеспечить способ, отличающийся тем, что аксиальная длина слоя осажденного фибриногена в пробирке для отбора образцов пропорциональна и может быть переведена в количественное содержание фибриногена в образце крови.

Эти и другие цели и преимущества данного изобретения станут более очевидными из следующего детального описания предпочтительного варианта его осуществления, сопровождаемого схемой, на которой приведена вертикальная проекция пробирки для образца крови с поплавком после того, как слой фибриногена отложился на верхушке поплавка.

Возвращаясь теперь к рисунку, определим следующие обозначения: позицией 2 обозначена пробирка, которая может быть капиллярной или большего диаметра пробиркой для отбора образцов. Пробирка 2 содержит поплавок 4, который сделан из пластмассы и который имеет характерный удельный вес, который позволяет ему плавать в центрифугированном слое эритроцитов. Верх пробирки 2, обозначенный цифрой 8, открыт, а нижняя часть 6 пробирки закрыта пластмассовым цоколем 10. Как ранее отмечалось в тех случаях, когда пробирка 2 представляет пробирку для отбора образцов, то ей не нужен цоколь 10, а вместо этого у нее должна быть общая стенка (донышко пробирки) 11, а сверху пробирка закрывается пробкой 9. Образец антикоагулированной крови помещают в пробирку 2 и центрифугируют в ней. Это приводит к тому, что эритроциты оседают в нижней части пробирки 2, образуя столб 12, а поплавок 4, погружаясь в него, выталкивается на поверхность эритроцитами столба 12. Над слоем эритроцитов 12 располагается слой лейкоцитов и тромбоцитов или светлый сгусток крови 14. Индивидуальные компоненты светлого сгустка крови 14 также могут разделиться на отдельные полосы, как отмечено в прототипе. Слой плазмы 16 располагается над слоем светлого сгустка крови.

Следует отметить, что поплавок 4 выступает на довольно значительное расстояние над слоем светлого сгустка крови 14 и переходит в слой плазмы 16, причем верхушка 5 поплавка 4 располагается над (гораздо выше) светлого сгустка крови.

После первоначального определения данных состава клеток крови, т.е. таких параметров, как гематокритного числа, гемоглобина, дифференцированных лейкоцитов и т. д. образец нагревают при температуре достаточной для осаждения фибриногена из плазмы. Установлено, что инкубация образца в течение 5 минут при 56^oC достаточно эффективна. Затем образец снова центрифугируют в пробирке 2 в течение времени достаточном для того, чтобы вызвать агломерацию осажденного фибриногена в виде полосы 18 на верхушке 5 поплавка 4. Осажденный фибриноген наблюдается как белая полоса 18, расположенная на верхушке 5 поплавка 4. Таким образом, слой фибриногена 18 отделяют от слоя светлого сгустка крови 14 для проведения точных замеров. Свободный кольцевой зазор между поплавком 14 и стенками пробирки 2 должен быть достаточно малым, чтобы предотвратить во время центрифугирования попадание осажденного фибриногена в кольцевой зазор. Размер кольцевого зазора для каждой конкретной комбинации пробирки и поплавка для известного объема образца крови может быть определен с помощью стандартного эксперимента. В тех случаях, когда используют капиллярные пробирки марки "QBC" в комбинации с поплавками, которые описаны в прототипе вышеназванном, величина кольцевого зазора в 35 45 микрон считается приемлемой.

Содержание фибриногена определяют путем определения аксиального размера или длины слоя 18 фибриногена в пробирке. Этот размер затем пересчитывают в количественные данные по концентрации фибриногена в образце крови. Таким образом, показатель длины слоя пропорционален количеству фибриногена в образце крови.

Для того чтобы была возможность точного измерения, необходимо чтобы полоса фибриногена и светлый сгусток крови были разделены на как можно большее расстояние.

У пациентов, у которых компоненты светлого сгустка крови в норме, нормальное гематокритное число, и содержание фибриногена в норме, неувеличенная полоса светлого сгустка крови оставляет примерно 10% от размера полосы (высоты полосы) фибриногена. У пациентов, у которых отмечено повышенное содержание компонентов светлого сгустка крови и пониженные концентрации фибриногена, полоса светлого сгустка крови может превышать высоту полосы фибриногена, т. е. они налагаются друг на друга, приводя таким образом, к значительной ошибке в измерении полосы фибриногена, что связано с тем, что весь или часть сгустка светлого крови включают в измерение размеры полосы фибриногена.

Понятно, что не только поплавок, но и другие средства, позволяющие разделить слой фибриногена от образующих кровь компонентов, могут быть использованы для осуществления описанной процедуры. Например, слой геля соответствующей удельной вязкости может быть использован для отделения слоя фибриногена от образованного светлого сгустка крови; или можно использовать пластмассовые гранулы (шарики) с соответствующим удельным весом.

Понятно, что осаждения фибриногена можно использовать и другие методы, кроме нагревания, лишь бы можно было провести измерение осажденного слоя согласно способу настоящего изобретения. Например, для предотвращения фибриногена в нерастворимую форму, к образцу крови можно добавить тромбин или кальций.

Можно легко понять, что процедура, описанная выше, обеспечивает простой и более точный метод определения количественного содержания фибриногена в образце крови. Использование пробирки и поплавка, которые представляются Becton Pickinson and Company под торговой маркой "QBC" дает возможность проводить определение фибриногена непосредственно в кабинете врача, устраняя необходимость пользоваться дорогостоящими лабораторными услугами. Кроме того, результаты исследований становятся быстро доступными врачу и пациенту.

Поскольку в описанный вариант изобретения могут быть внесены многие изменения и модификации, не изменяющие сути самого изобретения, то этот вариант не ограничивает изобретение, если оно не выходит за рамки прилагаемой формулы изобретения.

Использование: в области медицины, в частности в лабораторной диагностике. Сущность изобретения: количественное определение содержания фибриногена плазмы крови осуществляют на образце антикоагулированной цельной крови, помещенном в пробирку для отбора образцов. Эта пробирка представляет собой прозрачную центрифужную пробирку, которая содержит образец составного вытянутого поплавка. Образец крови центрифугируют в трубке, содержащей поплавок и проводят измерения различных составляющих клетки, центрифугированный образец после этого затем нагревают и проводят повторное центрифугирование для того, чтобы вызвать осаждение слоя фибриногена на верхушке поплавка, отделенном от полосы светлого кровяного сгустка в слое плазмы. Затем измеряют толщину слоя фибриногена, причем может быть проведено количественное определение содержания фибриногенов в образце крови, если использовать предварительно прокалиброванный инструмент. Способ позволяет контролировать состояние здоровья людей на ранней стадии отклонения от нормы. 1 ил.

1. Способ определения содержания фибриногена в антикоагулированной цельной крови, включающий помещение образца крови в прозрачную пробирку, центрифугирование образца крови для отделения образовавшихся компонентов от компонентов плазмы крови в пробирке, преобразование фибриногена в компоненте плазмы в видимую форму, центрифугирование образца крови для образованного слоя в пробирке и пересчет измерений длины слоя в показатель количественного содержания фибриногена, отличающийся тем, что отделяют слой фибриногена видимой формы в пробирке, снабженной спейсером, фибриноген преобразуют в осадочный фибриноген нагреванием образца крови в пробирке, а пересчет длины образовавшегося слоя осуществляют по формуле
F_q K F₁ + b,
где F_q количественное содержание фибриногена;
F₁ измеренная длина образованного слоя;
b постоянная, представляющая собой зависимость между формой боковой поверхности спейсера и диаметром пробирки. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что спейсер является поплавком, который содержится в прозрачной пробирке и позволяет сформировавшемуся слою располагаться отдельно и быть легко отличимым от сформировавшихся компонентов образца крови. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что подбирают спейсер и пробирку относительно друг друга таким образом, что предотвращается значительное накопление фибрина или фибриногена между пробиркой и поплавком. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробирка является капиллярной пробиркой. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробирка является предварительно очищенной пробиркой для отбора образца крови. 6. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что преобразуют фибриноген в процессе центрифугирования образца крови.