СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ПРОБЕ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕРОЯТНОСТЕЙ В ПОПУЛЯЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ИХ ПОДМНОЖЕСТВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к анализу эритроцитов или красных кровяных телец в пробах крови, в частности к способу и устройству для определения распределения вероятности подмножеств плотности в популяции эритроцитов в пробе крови, отражающего динамику во времени образования и/или уменьшения количества эритроцитов в крови пациента в течение предыдущих ста двадцати дней.

В настоящее время концентрация красных кровяных телец в крови пациента, складывающаяся из вновь образующихся и теряемых эритроцитов, контролируется путем определения в ней гематокрита. Гематокрит представляет собой выраженный в процентах объем, занимаемый уплотненными красными кровяными тельцами в пробе цельной крови после ее центрифугирования. В настоящее время для определения гематокрита небольшую стеклянную трубку заполняют цельной кровью с добавкой антикоагулянта, закрывают ее пробкой и центрифугируют для уплотнения красных кровяных телец. После уплотнения, которое осуществляют в течение примерно 3-5 мин в небольшой центрифуге, измеряют высоту слоя уплотненных красных кровяных телец и общую высоту слоя жидкости в трубке и рассчитывают гематокрит в процентах. Величина гематокрита не несет информации об образовании и/или потере красных кровяных телец.

В патентах США N 4027660, 4181609, 4156570, 4558947 и др. описан способ, включающий отбор в капиллярную трубку пробы цельной крови с добавкой антикоагулянта, помещение в трубку с пробой крови поплавкового тела, центрифугирование пробы, в результате которого происходит погружение этого тела в слой красных кровяных телец, что позволяет определять количество различных компонентов лейкоцитной пленки. Этот способ используется также для определения гематокрита с учетом поправочного коэффициента на погружение поплавкового тела в слой уплотненных красных кровяных телец и на возможное сжимание этого слоя в присутствии в пробе крови каких-либо добавок, например оксалата калия. Гематокрит является надежной мерой содержания красных кровяных телец в крови в момент измерений, однако ничего не говорит об условиях, касающихся образования новых эритроцитов или их потери. Низкое значение гематокрита является сигналом для врача, что в настоящий момент организм пациента находится в таком состоянии, при котором происходит подавление образования новых красных кровяных телец или имела место необычно большая их потеря, или это связано с недостаточным возрастанием их образования. Определение гематокрита не позволяет, однако, выявить такое состояние, если оно не совпадает примерно по времени с момента произведения анализа. Так, например, если у пациента было кровотечение за три недели до определения гематокрита, то анализ крови не может дать ответа на вопрос, имело ли оно место, так как потеря крови может явиться импульсом для увеличения интенсивности образования организмом красных кровяных телец с тем, чтобы компенсировать эту потерю.

Красные кровяные тельца в возрасте одного дня сохраняют фрагменты нуклеиновой кислоты, которые, будучи окрашены новым метиленовым синим, приобретают вид ретикулоцитов. Путем окрашивания мазка красных кровяных телец и последующего ручного подсчета процентного содержания красных кровяных телец, являющихся ретикулоцитами, можно определить скорость их образования в данный момент времени. По другому варианту ретикулоциты в пробе крови могут быть помечены выпускаемыми промышленностью красителями и затем детектированы и подсчитаны с помощью активируемого флуоресценцией анализатора клеток (FACS). Однако ни метод обычного окрашивания мазков, ни FACS не позволяют определить скорость образования красных кровяных телец, например, в пять раз превышающую обычную при продолжении этого процесса в течение трех дней, когда образование эритроцитов с такой повышенной скоростью имело место за десять дней до взятия пробы крови. Указанные известные способы позволяют зафиксировать факт увеличения или уменьшения скорости образования красных кровяных телец лишь в момент самого процесса или спустя сутки.

В июльском номере Journal of Clinical Medicine за 1974 г. L.M.Corash'em и др. описан способ разделения эритроцитов по их возрасту на основании упрощенного градиента плотности. В указанной публикации отмечается, что разделение эритроцитов по возрасту может быть осуществлено с помощью различных известных носителей клеток, таких как альбумин бычьей сыворотки, эфиры фталевой кислоты, декстран и акация аравийская, но в то же время указывается, что эти известные носители имеют недостатки и предлагается использовать вместо них полисахарид галактан с молекулярным весом 30000 дальтон. Предложенный Corash'em и др. способ требует однако использования дефибринированных, промытых и уплотненных эритроцитов, которые располагают слоем в верхней части предварительно сформованного градиента среды. Трубку с находящимися в ней уплотненными клетками и средой заполняют минеральным маслом и центрифугируют для разделения клеток. Из сказанного видно, что предложенный Corash'em и др. способ является сложным и требует больших затрат времени.

Настоящее изобретение относится к способу и устройству для анализа кровяных телец, результатом которого является распределение вероятности подмножеств плотности в популяции эритроцитов в пробе цельной крови, который позволяет установить существование периодов повышенной и/или пониженной интенсивности образования красных кровяных телец, имевших место во время или за два дня до взятия пробы крови и за время до примерно 120 дн до проведения анализа, чего нельзя сделать путем определения гематокрита и ретикулоцита известными способами.

Эритроциты in vivo образуют популяцию с непрерывным градиентом подмножеств плотности, причем самые молодые из них имеют наименьшую плотность. Частично это связано с медленным и прогрессирующим уменьшением содержания в клетках калия и воды, которым сопровождается старение эритроцитов. Удельный вес всей популяции эритроцитов находится в пределах от примерно 1,050 до примерно 1,150 (при наличии в пробе крови увеличивающих плотность красных телец агентов он может быть выше на несколько (до 10) процентов).

В основу изобретения положена задача создать способ, позволяющий зафиксировать факт изменения скорости образования красных кровяных телец как в момент процесса, так и задолго до взятия пробы.

Суть настоящего изобретения заключается в том, что для получения распределения подмножеств в популяции эритроцитов по их удельному весу или плотности в центрифужную трубку вводят метки различной плотности. В результате становится возможным возрастной анализ красных кровяных телец, который может характеризовать образование (или потерю) эритроцитов с нормальной или отличной от нормальной скоростью за период в 120 дн до момента проведения анализа.

В качестве меток можно использовать пластмассовые бисеринки, латекс с частицами сфероидальной формы, липосомы и т.п. состоящие из родственных групп, причем сферические метки каждой группы имеют строго определенный удельный вес, находящийся в пределах вышеуказанного интервала удельного веса эритроцитов и отличающийся от удельного веса меток другой группы.

Предпочтительно использовать 5-20 групп меток, удельный вес которых равномерно, ступенчато распределялся бы в указанном интервале. Так, при использовании 20 групп меток распределение удельного веса этих групп будет иметь следующий вид: 1,05; 1,055; 1,060 и т.п. до 1,150 через интервалы 0,005 (или на 10% больше при наличии в пробе крови агента, увеличивающего плотность). Метки могут быть получены из растворов различных полимеров или других исходных материалов, имеющих различные плотности или удельные веса. Плотность или удельный вес таких меток не должны изменяться при взаимодействии их с клетками крови или плазмой в анализируемой пробе.

При центрифугировании трубки с пробой крови отдельные группы меток будут оседать и располагаться в соответствии со своим удельным весом примерно на границе, разделяющей отдельные подмножества популяции эритроцитов. Благодаря этому становится возможным измерить высоту слоя каждого подмножества клеток и затем пересчитать ее в массу. Если результаты этих измерений выразить в виде гистограммы, то можно определить любое отклонение от нормы образования или потери эритроцитов, имевшее место до проведения анализа. В том случае, если в течение изучаемого промежутка времени интенсивность образования и потери эритроцитов находились в пределах нормы, то высота слоев всех подмножеств эритроцитов будет практически одинаковой от верхней до нижней границы слоя красных кровяных телец с очень постепенным уменьшением высоты слоя по мере увеличения возраста за счет физиологической потери крови. При отклонении от нормы интенсивности образования или потери эритроцитов за изучаемый период времени до проведения измерений высота слоев будет соответственно уменьшаться или увеличиваться.

При существовании периода повышенной интенсивности образования красных кровяных телец со скоростью, примерно в три или более раз превышающей нормальную физиологическую скорость, высота слоя соответствующего подмножества красных кровяных телец в отцентрифугированной пробе крови будет больше. Так, например, если подмножества красных кровяных телец ограничиваются клетками десятидневного периода времени и если период повышенной интенсивности образования продолжался в течение пяти из этих десяти дней при скорости образования в три раза выше нормальной (и если, разумеется, проба крови была отобрана в момент, когда соответствующее подмножество эритроцитов еще находилось в ней), то высота слоя этого подмножества будет вдвое выше ожидаемой нормальной величины. Вышесказанное иллюстрируется следующей картиной десятидневного периода, за время которого в течение пяти дней образование красных кровяных клеток происходило с нормальной скоростью и, кроме того, имело место образование красных кровяных телец с ненормально высокой (в три раза более высокой) скоростью. Предположим, что в течение любых пяти дней из этого десятидневного периода имело место образование красных кровяных телец с этой в три раза более высокой по сравнению с нормальной скоростью. Тогда в течение этого времени возникает пятнадцать (3•5) "порций" красных кровяных телец. За оставшиеся пять дней образуется пять "порций" красных кровяных телец (по одной "порции" за каждый из пяти дней). Всего за исследуемый десятидневный период можно было бы ожидать образования десяти "порций", однако на самом деле с учетом вышеуказанного периода с отклонением от нормальной скорости образования будет получено двадцать "порций". Следствием такой ненормальной высокой интенсивности образования красных кровяных телец будет более высокий по сравнению с нормальным слой подмножества красных кровяных телец в уплотненном слое их в отцентрифугированной пробе.

Очевидно, при существовании периодов с пониженной скоростью образования красных кровяных телец слой соответствующего подмножества будет иметь меньшую по сравнению с ожидаемой высоту.

В течение длительных периодов потери крови вследствие кровотечения, слои всех образующихся за время этого кровотечения подмножеств красных кровяных телец будут иметь соответствующую меньшую высоту.

Предметом настоящего изобретения таким образом является создание усовершенствованного метода анализа популяции подмножеств красных кровяных телец по плотности в пробе цельной крови с добавкой антикоагулянта.

Далее предметом настоящего изобретения является создание способа вышеуказанного типа, отличающегося тем, что красные кровяные тельца отделяют путем центрифугирования в прозрачной трубке в отдельный слой, который разделяют на отдельные видимые подмножества.

Предметом настоящего изобретения, кроме того, является создание способа вышеуказанного типа, отличающегося тем, что указанные подмножества красных кровяных телец выявляют путем добавления к пробе крови меток, состоящих из родственных групп, причем каждая группа имеет строго определенный удельный вес, отличный от удельного веса другой группы.

Предметом настоящего изобретения помимо того является создание способа вышеуказанного типа, отличающегося тем, что в качестве меток используют бисеринки, образующие в слое красных кровяных телец резко очерченные линии, разделяющие подмножества красных кровяных телец с разным удельным весом.

Эти и другие задачи, а также преимущества настоящего изобретения становятся более наглядными из нижеследующего подробного описания предпочтительного варианта осуществления изобретения.

На фиг. 1 изображена вертикальная проекция центрифужной трубки для осуществления изобретения; на фиг. 2 трубка в соответствии с фиг. 1 с отцентрифугированной пробой крови и с увеличенным для наглядности по размеру слоем красных кровяных телец; на фиг. 3 показан продольный разрез другого варианта центрифужной трубки для осуществления изобретения; на фиг. 4 показано схематическое изображение распределения красных кровяных телец в отцентрифугированной пробе крови, полученное с помощью управляемого компьютером считывающего устройства; на фиг. 5 схематическое изображение типичной гистограммы, построенной путем обработки информации по высоте слоев подмножеств красных кровяных телец; на фиг. 6 и 7 показаны гистограммы высот слоев подмножеств красных кровяных телец с нормальной "историей" и с отклонением от нормы.

В конструкции в соответствии с фиг. 1 и 2 имеется показанная на фиг. 1 трубка 2, в качестве которой можно использовать стеклянную капиллярную или другую прозрачную трубку. В эту трубку помещается поплавковое тело или вкладыш 4 из пластмассы с таким удельным весом, что при центрифугировании трубки 2 с пробой крови тело проходит через слой красных кровяных телец и опускается на дно 6 трубки. В трубке 2 может быть помещена кучка пластмассового бисера 5, состоящая из нескольких групп бисеринок одинакового размера, но с различным удельным весом. Нижний конец трубки 2 закрывается пластмассовым колпачком 10.

В трубку 2 вводят пробу крови и центрифугируют ее вместе с поплавковым телом 4 и бисером 5. При центрифугировании бисер 5 распределяется в пробе крови и оседает на определенной высоте, образуя линии в слое красных кровяных телец, как это показано на фиг. 2, тогда как поплавковое тело 4 проходит через красные кровяные тельца R.

Лейкоциты при центрифугировании пробы крови образуют слой, располагающийся выше границы 1, отделяющей их от слоя красных кровяных телец. Полоски бисеринок В разделяют слой красных кровяных телец на подмножества, характеризующиеся удельным весом, зависящим от их возраста. При нормальной скорости образования и потери высота слоев всех подмножеств, как видно из чертежа, плавно уменьшается в направлении от верхней к нижней части слоя красных кровяных телец.

На фиг. 3 показана другая конструкция центрифужной трубки для осуществления изобретения. В этой трубке 12 имеется фигурное, воронкообразное отверстие с верхней, открытой частью 14 большего диаметра и нижней, закрытой частью 16 меньшего диаметра. Размер отверстия выбран таким образом, чтобы при центрифугировании пробы крови красные кровяные тельца R оседали в более узкой 16, а лейкоциты и плазма оставались в широкой 14 части отверстия. Полосы меток В распределяются в слое отцентрифугированных красных кровяных телец. Трубка 12 выполнена из прозрачной пластмассы. Следует отметить, что в случае конструкции, изображенной на фиг. 3, отпадает необходимость в использовании поплавкового тела.

После центрифугирования пробы крови ее помещают в устройство типа, описанного в патентах США 4209226 от 24 июня 1980 г. или 4558947 от 17 декабря 1985 г. В этом устройстве измеряется высота слоев всех подмножеств красных кровяных телец для построения развертки, типа схематически изображенной на фиг. 4, на которой направленные вниз метки соответствуют маркирующим полосам или линиям, "считываемым" устройством.

На основании этой развертки строится гистограмма, схематически изображенная на фиг. 5, на которой по оси Х отложена плотность подмножеств красных кровяных телец (отражающая их возраст), а по оси Y процентное содержание красных кровяных телец с удельным весом ниже величин соответствующих плотностей по оси Х.

На фиг. 6 и 7 показаны гистограммы высот слоев подмножеств красных кровяных телец с нормальной и соответственно отличной от нормальной скоростью образования и потери красных кровяных телец с группой подмножеств меток из расчета одно подмножество на день исследуемого периода. Условия, характеризуемые каждой гистограммой, приведены на соответствующих чертежах. Указанные гистограммы достоверно отражают изменение во времени ежедневной интенсивности образования и/или потери красных кровяных телец.

Хотя вышеуказанный пластмассовый вкладыш определяется как "поплавковое тело", из приведенного описания с очевидностью следует, что на самом деле он не должен обладать плавучестью в красных кровяных тельцах. Плотность или удельный вес его должны быть достаточными, чтобы обеспечить опускание его через основную массу, например, как минимум через примерно 90% уплотненного слоя красных кровяных телец. Слои подмножеств красных кровяных телец необходимо растянуть примерно в 1,5-3 раза. Длина описанного вкладыша должна быть такой, чтобы он полностью находился в уплотненном слое красных кровяных телец в пробе крови с гематокритом не выше 40. Из сказанного следует, что указанный вкладыш может быть выполнен как одно целое вместе с изображенным на фиг. 1 пластмассовым колпачком, закрывающим снизу трубку 2.

Метки, о которых говорилось выше, могут быть выполнены в виде множества пластмассовых дисков с различной плотностью или удельным весом. Однако в случае использования таких дисков их следует предварительно загрузить в трубку в соответствии с величинами их плотности или удельного веса, а именно таким образом, чтобы самый тяжелый диск находился внизу трубки, а самый легкий был бы самым верхним.

Следует отметить далее, что разрешение по времени предлагаемого способа зависит от числа подмножеств меток. Так, например, при использовании 120 подмножеств меток, как это показано на фиг. 6 и 7, разрешение по времени будет равно одному дню, тогда как двенадцать подмножеств в идеальном случае дают разрешение в 10 дней. Полное погружение вкладыша в слой красных кровяных телец не мешает определению гематокрита пробы крови с помощью соответствующего прибора вышеописанными известными способами. Приборы для определения гематокрита в пробах крови описаны в патентах США N N 4558947 и 4683579.

Поскольку возможны различные изменения и варианты вышеописанного примера осуществления изобретения, не выходя за пределы положенного в его основу принципа, этот пример не ограничивает объема изобретения, характеризуемого прилагаемой формулой изобретения.

Использование: в области медицины, в частности в гематологии. Сущность изобретения: эритроциты in vivo представляют собой популяцию подмножеств с непрерывным градиентом плотности, причем самые молодые клетки являются самыми легкими. Пробу крови центрифугируют в прозрачной трубке, содержащей пластмассовый бисер, состоящий из нескольких групп, каждая из которых имеет строго определенный удельный вес, находящийся в пределах удельного веса красных кровяных телец. Этот бисер при центрифугировании распределяется в слое эритроцитов в виде узких полос, разделяющих слои разных подмножеств. После этого измеряют высоты слоев отдельных подмножеств красных кровяных телец и по ним определяют содержание этих телец в подмножествах в крови пациента. 2 с. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Способ определения в пробе цельной крови распределения вероятностей в популяции эритроцитов их подмножеств по плотности, в котором приготовливают прозрачную трубку с пробой крови, осуществляют центрифугирование трубки, содержащей пробу крови, подсчитывают подмножества эритроцитов, отличающийся тем, что в трубку дополнительно помещают метки, характеризующиеся различным удельным весом, находящимся в пределах удельного веса эритроцитов, вызывают расширение слоев подмножеств эритроцитов при центрифугировании за счет формы трубки или за счет средства, вызывающего такое расширение. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что он включает стадию введения в указанную трубку как правило цилиндрического вкладыша с удельным весом, обеспечивающим опускание вкладыша при центрифугировании в слой эритроцитов. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что он включает определение высоты слоем подмножеств красных кровяных телец для определения количества клеток в этих подмножествах. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что он включает распечатку гистограммы полученных высот слоев подмножеств клеток. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что он включает стадию определения на основании указанной гистограммы временных аномалий в содержании в крови красных кровяных телец. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве меток используют пластмассовый бисер. 7. Устройство для определения в пробе цельной крови распределения вероятностей в популяции эритроцитов их подмножеств по плотности, содержащее прозрачную центрифужную трубку, предназначенную для помещения в нее пробы крови, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит множество меток, которые выполнены с возможностью помещения их в трубку, распределенных по разным удельным весам в пределах диапазона удельного веса эритроцитов, причем форма трубки выполнена с возможностью расширения слоев подмножеств эритроцитов при центрифугировании, или она содержит средство, выполненное с возможностью расширения. 8. Устройство по п.7, отличающееся тем, что указанные метки представляют собой пластмассовый бисер. 9. Устройство по п.8, отличающееся тем, что указанный бисер состоит из отдельных групп, причем удельный вес бисеринок каждой группы отличается на 0,005 от удельного веса бисеринок соседней группы. 10. Устройство по п.7, отличающееся тем, что оно включает цилиндрический вкладыш, располагающийся в указанной трубке с таким удельным весом, который обеспечивает погружение его в слой эритроцитов в отцентрифугированной пробе цельной крови.