ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1997 года по МПК A61K31/15 A61K31/295 A61K31/455 

Изобретение относится к медицине, конкретно к лекарственным противотуберкулезным средствам.

В настоящее время для лечения туберкулеза используют 2 группы препаратов:
а) Препараты 1 ряда (основные антибактериальные производные изоникотиновой кислоты, п-аминосалициловой кислоты, антибиотики - стрептомицин, рифалепицин).

б) Препараты II ряда (резервные этионамид, протионамид, этамбутол, циклосерин, канамицин и др.).[Машковский М.Д. Лекарственные средства, М. Медицина, 1993, ч. II, с. 366 367]
Недостатком препаратов I ряда является то, что при применении этих высокоактивных лекарств довольно быстро развиваются устойчивые микобактерии туберкулеза, а препараты II ряда для самостоятельного применения мало эффективны.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является препарат изониазид гидразид изоникотиновой кислоты (ГИНК) [Машковский М.Д. Лекарственные средства, М. Медицина, 1993, с. 367 -369] Будучи самым эффективным препаратом для лечения туберкулеза, ГИНК обладает тем недостатком, что при его применении довольно быстро развиваются микобактерии туберкулеза, устойчивые к ГИНК, кроме того, при его применении в организме образуются некоторые достаточно токсичные метаболиты, что приводит к нежелательному побочному действию препарата.

Цель изобретения создание препарата, не уступающего ГИНК по противотуберкулезной активности, но оказывающего бактериостатическое действие на штаммы микобактерий туберкулеза, устойчивых к действию изониазида и стрептомицина и не образующих в организме токсичных метаболитов.

Цель достигается применением в качестве лекарственного противотуберкулезного препарата неописанного ранее комплекса ГИНК с двухвалентным железом структуры

условно названным нами "Феназидом".

Феназид получают прибавлением к 0,2 М раствору ГИНК в дистиллированной воде 0,2 М раствора сульфата железа в дистиллированной воде. Выпавший осадок оранжевого цвета отфильтровывают, промывают дистиллированной водой, высушивают в сушильном шкафу при 40 50^oC до постоянного веса. Выход Феназида 76% от теоретического.

C₆H₁₁FeN₃O₇S
Вычислено, C 22,15; H 3,88; N 12,92; Fe 17,23.

Найдено, C 23,04; H 4,13; N 13,08; Fe 16,62.

Найдено содержание воды в Феназиде (определение по методу Фишера) - 11,6% вычислено 11,07%
При излучении спектральных характеристик в воде и 0,2 M HCl были получены следующие данные (фиг. 1 4).

Данные спектрального анализа показывают, что в воде спектр Феназида имеет два максимума поглощения 200 нм и 262 нм, спектр ГИНК в тех же условиях - 212 и 262 нм. Спектры поглощения Феназида и ГИНК в 0,2 M HCl полностью совпадают максимумы поглощения 215 и 265 нм. Это указывает на два обстоятельства:
1. Комплекс ГИНК с сульфатом железа (II) представляет собой внутрикомплексное соединение следующей структуры:

2. Комплекс ГИНК с сульфатом железа (II) полностью диссоциирует в 0,2 M HCl на ГИНК и ион железа.

Результаты, полученные при изучении данных УФ-спектроскопии, свидетельствующие о том, что комплекс ГИНК с сульфатом железа является внутрикомплексным соединением указанной структуры, подтверждается данными ИК-спектроскопии (фиг.5). ИК-спектры были получены в вазелиновом масле.

Исследование Феназида в сравнении с ГИНК методом жидкостной хроматографии высокого давления (сорбент Нуклеосил C₁₈, растворитель 32% метанол, pH 6,25) показывает, что Феназид является индивидуальным (100%) веществом - внутрикомплексным соединением ГИНК с сульфатом железа (II) (фиг.6, 7).

Хроматографические исследования были приведены на хроматографе "Миллипор Пат. N 52507" (США).

Масс-спектрометрическое исследование Феназида на приборе МИ-1201 Э (СССР) показало, что в образцах препарата, переданных на исследование, были обнаружены три масс-пика, идентифицированных как железо (М=56), ГИНК (М=137) и феназид (М=289). Масса 289 соответствует молекулярной массе Феназида без учета двух молекул воды (325 36=289).

Методом потенциометрического титрования определена константа устойчивости Феназида в водных растворах при физиологических значениях pH, равная 6,9522. Это позволяет сделать вывод, что Феназид будет всасываться в желудочно-кишечном тракте животных и человека без разложения и диссоциации на компоненты.

Определен коэффициент распределения Феназида "масло-вода", равный 1,48. Это позволяет сделать вывод, что Феназид должен хорошо проникать через липидную оболочку микобактерии туберкулеза.

При изучении кинетики окисления Феназида в водном растворе при комнатной температуре кислородом воздуха (с учетом данных термогравиметрического анализа) было показано, что окисление препарата идет по схеме:

образуя бактериостатическое соединение изоникотиновую кислоту и нетоксичные продукты (азот, протоны, ионы железа).

Фармакологическое изучение Феназида
Экспериментальное изучение бактериостатической и химиотерапевтической активности Феназида проводили в экспериментах "in vitro" и "in vivo" на культурах микробактерий туберкулеза человеческого и бычьего типов, свежевыделенных от больных туберкулезом легких, устойчивых к известным противотуберкулезным препаратам ГИНК и стрептомицину, а также на моделях заболевания.

Изучение бактериостатической активности Феназида в эксперименте "in vitro"
Культуру микобактерий туберкулеза засевали по 0,2 мл по V оптическому (казеиново-солевую). Концентрация микобактерий составляла при этом 1•10⁷ млн клеток в 1 мл питательной среды.

Раствор Феназида в различных концентрациях (от 10 до 100 мкг/мл) вводили в культуры микобактерий и выдерживали в стерильных условиях в течение 10 дн при 37^oC. По истечении указанного срока надосадочную жидкость удаляли, из осадка готовили фиксированные мазки, окрашивали их по Цилю-Нильсену и в 100 полях зрения считали количество образовавшихся "кос". Результаты исследования обрабатывали статически.

Установлено, что Феназид в концентрации 40 мкг/мл обладает бактерицидным, а в концентрации 10 и 20 мкг/мл бактериостатическим действием в отношении чувствительных к ГИНК лабораторных штаммов микобактерий туберкулеза. Особенно ценным представляется его антибактериальное действие в отношении штаммов, свежевыделенных от больных туберкулезом легких, устойчивых к воздействию высокоактивных туберкулостатиков ГИНК и антибиотика стрептомицина. В этом случае Феназид имеет такую же активность 40 мкг/мл, что и по отношению к чувствительным микобактериям туберкулеза, табл. 1-3.

Изучение химиотерапевтической активности Феназида при длительном лечении туберкулеза у белых мышей
Для проведения химиотерапевтического эксперимента были использованы беспородные белые мыши-самцы, массой 20-22 г. Животных заражали внутривенно (в хвостовую боковую вену) культурой микобактерий туберкулеза человеческого типа в дозе 0,025 мг в 0,5 мл.

Феназид вводили внутрь в дозах 5,0 мг/кг и 10,0 мг/кг, каждую дозу изучали на 10 животных; 10 мышей служили контролем.

В результате эксперимента установлено: контрольные животные пали в течение 1-го месяца после начала эксперимента. Причина гибели - генерализованный гематогенно-дессиминированный туберкулез.

В 1-ой экспериментальной группе, получавшей ежедневно 5 мг/кг Феназида, из 10 мышей в течение месяца али 2 особи, у остальных 8 животных индекс поражения туберкулезом составил от 0,5 до 2-х единиц, что соответствует присутствию единичных туберкулезных очагов (табл. 4).

Микробиологическое исследование органов животных через 1 месяц лечения Феназидом показало, что у 6 обследованных мышей в гомогенате внутренних органов не удалось выявить микобактерий туберкулеза как методом посева, так и методом бактериоскопии; у 2-х животных микобактерии туберкулеза были обнаружены в гомогенате селезенки и легких. При посеве материала рост микобактерий выявлен не бал.

Во 2-й экспериментальной группе белых мышей, которые получали Феназид внутрь в дозе 10 мг/кг ежедневно в течение месяца, все животные остались живы.

При вскрытии отмечались единичные туберкулезные очаги в селезенке, в легочной ткани были увеличены бронхиальные лимфатические узлы. В печени туберкулезных изменений выявлено не было. Микобиологическое обследование внутренних органов белых мышей, получавших Феназид в дозе 10 мг/кг, показало, что в гомогенатах внутренних органов животных микобактерий туберкулеза обнаружено не было (табл. 4).

Таким образом, индекс эффективности химиотерапии Феназидом в этом эксперименте составил:


Изучение химиотерапевтической активности Феназида при длительном лечении туберкулеза у морских свинок.

Изучение химиотерапевтической активности Феназида в дозах 5 и 10 мг/кг
Для проведения этого эксперимента были использованы 30 морских свинок-самцов, массой 200-220 г. Животных заражали культурой микобактерий человеческого типа в дозе 0,025 мг в 0,5 мл, которую вводили подкожно в правую паховую область. 10 животных служили контролем. Экспериментальные группы: 1-я, 10 животных, которым вводили ежедневно внутрь 5,0 мг/кг Феназида, и 2-я, 10 животных, которым ежедневно вводили Феназид в дозе 10,0 мг/кг.

Контрольные животные пали в течение первого месяца с момента начала эксперимента.

В первой опытной группе (Феназид, 5 мг/кг) в течение эксперимента (3 месяца) пали 4 морские свинки из 10. В легких у погибших животных определялись крупные полупрозрачные очаги серого цвета, печень и селезенка также содержали очаги поражения. Диагноз: гематогенно-диссиминированный туберкулез внутренних органов. У 6 морских свинок индекс поражения туберкулезом составил от 1 до 1,5 единиц, что соответствует присутствию единичных очагов туберкулеза в селезенке. В легочной ткани были увеличены трахео-бронхиальные лимфатические узлы. В печени туберкулезных изменений обнаружено не было (табл. 5). Микробиологическое исследование внутренних органов животных через 3 месяца лечения Феназидом в дозе 5 мг/кг показало, что из 6 обследованных морских свинок у пяти животных микобактерии туберкулеза в гомогенате внутренних органов выявлены не были как методом посева, так и методом бактериоскопии. Только у одной морской свинки микобактерии туберкулеза были обнаружены в гомогенатах печени, легких и селезенки. Посев этого материала не позволил получить положительного результат, то есть рост микобактерий выявлен не был.

Таким образом, у 50% животных в 1-ой опытной группе наступила стерилизация очагов после парэнтерального введения микpобактерий туберкулеза на фоне химиотерапии Феназидом в дозе 5 мг/кг в течение трех месяцев.

2-я группа экспериментальных животных получала Финазид в дозе 10 мг/0кг. Все 10 животных в течение трехмесячного эксперимента оставались живы. По окончании опыта при вскрытии были отмечены единичные поражения туберкулезом в селезенке. В гомогенатах внутренних органов при микробиологическом обследовании микобактерий обнаружено не было.

Индекс эффективности химиотерапии в этом эксперименте на морских свинках составил:

Изучение химиотерапевтической активности Феназида в дозах 20 и 40 мг/кг.

Для проведения оценки химиотерапевтической активности Феназида в дозах 20,0 и 40,0 мг/кг были использованы также 30 морских свинок-самцов массой 200-220 г. Животных заражали культурой микобактерий туберкулеза человеческого типа в дозе 0,025 мг в 0,5 мл, которую вводили подкожно в правую пазовую область. 10 животных служили контролем. Экспериментальные группы: 1-я, 10 животных, которым ежедневно вводили Феназид внутрь в дозе 20 мг/кг; 2-я, 10 животных, которым ежедневно вводили Феназид внутрь в дозе 40 мг/кг. Продолжительность эксперимента три месяца.

Контрольные животные пали в сроки от двух недель до 1,5 месяцев с момента начала эксперимента.

В первой опытной группе к окончанию эксперимента все животные живы. Индекс поражения туберкулезом составил от 0 до 0,5. Внутренние органы были без патологических изменений. У шести животных в легких были обнаружены замещенные соединительной тканью очаги воспаления (табл. 6). Микробиологическое исследование внутренних органов экспериментальных животных через три месяца лечения Феназидом в дозе 20 мг/кг показало, что у всех животных этой группы микобактерии туберкулеза не были выявлены как методом посева, так и методом бактериоскопии.

При обследовании 2-й экспериментальной группы было показано, что индекс поражения туберкулезом составил от 0 до 0,5. Однако в этой группе животных только у двух особей были обнаружены в легких небольшие разрешенные очаги воспаления, замещенные соединительной тканью. Остальные внутренние органы были найдены без патологических изменений. Микробиологическое исследование гомогенатов внутренних органов методов посева и бактериоскопическое не выявило наличия микобактерий туберкулеза.

Таким образом, у всех животных этой группы после трехмесячного лечения Феназидом в дозе 40 мг/кг наступила полная стерилизация очагов после парэнтерального введения микобактерий туберкулеза.

Индекс эффективности химиотерапии в этом эксперименте составил:

Изучение метаболизма и фармакокинетики Феназида
1. Изучение метаболизма Феназида
ГИНК, являясь субстратом N-ацетилтрансферазы, при длительном применении может оказывать и не оказывать побочное действие на организм больного в зависимости от фенотипа ацетилирования. Это обстоятельство предполагает проведение комплекса мероприятий в клинике, направленного на обеспечение индивидуализации разовых и курсовых доз этого препарата для каждого больного. Реализация же побочных эффектов изониазида связана с хелатирующими свойствами его молекулы.

Модификация молекулы ГИНК с помощью комплексообразования с железом (П) преследовала, в первую очередь, цель, достижение которой обеспечивало бы большую безопасность химиотерапии туберкулеза, поскольку блокированный железом (П), хелатный узел молекулы ГИНК теряет способность к взаимодействию с активными центрами металлсодержащих ферментов, а включение первичной аминогруппы гидразина в хелатный цикл комплекса, лишает ее свойств субстрата N-ацетилтрансферазы.

В этой связи мы провели изучение метаболизма Феназида с целью прямой проверки теоретических и экспериментальных результатов.

Белым крысам-самцам массой 200-220 г, вводили внутрь по 0,1 г Феназида и ГИНК. Животных помещали на сутки в обменные клетки "Кассель" (ФРГ). В течение эксперимента пищу животные не получали, воду получали по потребности.

Через 24 ч собирали суточную мочу и исследовали ее методом Defrancini, Zumboui, описанным Ж.Хирцем (1975). Для получения хроматограмм использовали бумагу марки "Ватман-плотный" и систему растворителей изопропанол вода в соотношении 85: 15. Вертикальное хроматографирование проводили в течение 5 ч. После окончания процесса хроматограммы сушили в течение 16 ч при комнатной температуре в темноте, затем проявляли парами йода при 25^oС в течение 45 мин. Идентификацию хроматограмм вели по результатам, полученным авторами метода в аналогичных условиях (табл. 7).

Результаты, приведенные в табл.7, показывают, что при введении в организм животного Феназида (в отличие от ГИНК) в суточной моче отсутствуют изониазид и ацетилизониазид основные соединения, ответственные за развитие побочных эффектов при длительном лечении больных препаратами ГИНК. Следовательно, Феназид не является субстратом N-ацетилтрансферазы и при его назначении больным нет необходимости в индивидуализации дозирования препарата. Кроме того, полученные нами данные подтверждают, что основной путь метаболизма Феназида окисление.

Изучение фармакокинетики Феназида
Фармакокинетику Феназида изучали на белых беспородных крысах самцах средней массой 300 г. Препарат вводили однократно через зонд внутрижелудочно в форме водной суспензии, в дозе 30 мг/кг.

Кровь для анализа отбирали после декапитации через 1,5; 3,0; 6,0; 9,0; 12,0; 18,0; 24,0 ч. На каждую временную точку фармакокинетической кривой в эксперимент было взято по 6 животных.

Определение содержания препарата в сыворотке крови экспериментальных животных проводили спектрофотометрически.

Расчет фармакокинетической кривой и параметров проводили по программе "фарм" на персональном компьютере НР-85 фирмы Хьюлит-Паккард (США).

Усредненные концентрации Феназида в сыворотке крови крыс приведены в табл.8.

Согласно полученным данным изменение концентрации Феназида в сыворотке крови крыс хорошо описывается экспоненциальным уравнением на одночастевой фармакокинетической модели со всасыванием (Соловьев В.Н. и др. 1980). Незначительная разница между экспериментальными и расчетными величинами концентраций Феназида свидетельствует в пользу правильности выбранной модели (табл. 9, фиг.8).

Фармакокинетические параметры Феназида приведены в табл.9.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что для Феназида характерно медленное всасывание из желудочно-кишечного тракта и еще более медленное выведение. Так, уровень максимальной концентрации Феназида в крови достигается через 9, 18 ч, при этом скорость всасывания составляет 2,6 мкг мл^-1ч^-1. В то же время период полувыведения препарата составляет 7,21 ч, а константа скорости элиминации 0,0961 ч^-1. Кажущийся объем распределения Феназида составляет 1,09 л кг^-1, общий клиренс 0,1047 л кг^-1 ч^-1.

Согласно данным, приведенным в табл.8, уравнения, описывающие кривую зависимости концентрации Феназида от времени, имеют вид:
C_(t)=27,0•(1-е^-0,09661•^T),
если t<T_abc, то есть для восходящей ветви кривой
C_(t)=17,2•e^{-0,0961 (t-9,18)},
если t>T_abc, то есть для нисходящей ветви кривой
где
T=t-T_лаг.

Следует отметить, что для Феназида время достижения максимального уровня препарата в крови определяется соотношением между константами всасывания и элиминации и не зависит от вводимой дозы препарата. При этом, поскольку значения констант всасывания и элиминации отличаются незначительно, каждая из ветвей фармакокинетической кривой характеризует одновременно оба процесса (Соловьев В.Н. и др. 1980).

Таким образом, Феназид является препаратом пролонгированного действия в отличие от ГИНК, что имеет огромное значение для фтизиатрии. Однократное назначение Феназида обеспечивает наличие в крови бактериостатической концентрации препарата в течение 24 ч (ГИНК 4 ч).

Результаты изучения острой токсичности Феназида
Исследование острой токсичности Феназида проводили на нелинейных белых мышах-самцах массой 18 20 г и нелинейных белых крысах-самцах массой 18 20 г и нелинейных белых крысах-самцах, массой 200 220 г. Феназид вводили внутрижелудочно и внутрибрюшинно в форме водной суспензии. Каждому виду животных вводили по пять доз препарата. На каждую дозу было использовано по 10 животных каждого вида. Наблюдение за экспериментальными животными после введения препарата вели в течение 10 сут. У крыс гибели не наблюдали при очень высоких дозах Феназида (табл.10). У мышей гибель отдельных особей наблюдались только на следующие сутки после введения препарата. ЛД₅₀ рассчитывали по методу Литчфилда-Уилкоксона.

Из опубликованных данных известно, что ЛД₅₀ ГИНК для белых мышей при внутрибрюшинном введении составляет 211,2 мг/кг (Витолия M.A. 1957), причем гибель животных наступает в первый ч после введения ГИНК при характерной картине интоксикации.

Сравнивая данные табл.10 и литературы, можно заключить, что блокада хелатного узла молекулы ГИНК ионом железа (II) резко снижает токсические свойства препарата, более того, в силу различных путей метаболизма ГИНК и Феназида, изменяется молекулярный механизм интоксикации и гибели экспериментальных животных. Так, если при введении ГИНК гибель животных наступает через 5 10 мин 1 1,5 ч(в зависимости от способа введения препарата), то при нагрузке экспериментальных животных (мыши) Феназидом гибель наблюдается только на следующие сутки после введения препарата, а у крыс, вообще не удалось установить ЛД₅₀ Феназида при внутрижелудочном введении препарата.

Таким образом, предложен в качестве препарата для лечения туберкулеза неописанный ранее комплекс ГИНК с двухвалентным железом под условным название Феназид, разработан метод получения, изучены физико-химические свойства и установлена структура Феназида.

Изучение бактериоскопической и химиотерапевтической активности Феназида в экспериментах "in vitrpo" и "in vivo" показано, что Феназид по химиотерапевтической активности превосходят ГИНК, оказывает выраженное бактериоскопическое действие на штаммы микробактерий туберкулеза, устойчивых к действию изониазида и стрептомицина.

Изучение метаболизма и фармакокинетики Феназид, в отличие от ГИНК, не образует в организме экспериментальных животных токсичных метаболитов. Однократное введение Феназида обеспечивает поддержание бактериостатической концентрации препарата в крови в течение 24 часов. Эффект пролонгации не зависит от дозы Феназида, при этом Феназид в острых опытах продемонстрировал гораздо меньшую токсичность нежели ГИНК. 10 табл.

Предлагается для лечения туберкулеза препарат, представляющий собой комплекс гидразина изоникотиновой кислоты с двухвалентным железом форм-лы:

В экспериментах на животных установлено, что он менее токсичен и более активен, чем изониазид, обладает пролонгированным действием, не образует в организме токсичных метаболитов, главное оказывает выраженное бактериостатическое действие на штаммы микобактерий туберкулеза, устойчивых к действию изониазида и стрептомицина. 10 табл.

Препарат для лечения туберкулеза, представляющий собой комплекс гидразида изоникотиновой кислоты с двухвалентным железом общей формулы
в