СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК A61K38/05 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается применения известного дипептида L-лизил-L-глутаминовая кислота (L-Lys-Glu) в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью.

Известны вещества, обладающие иммуномодулирующей активностью, к ним относятся препараты тимуса, полученные из животного сырья, такие как: тимозин [1] тималин [2] тактивин [3] и другие. Эти препараты состоят из комплекса веществ полипептидной природы, которые способны регулировать различные этапы пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов. Использование их в качестве иммуномодулирующих средств затруднено в связи со сложностью способов получения, малым выходом активных веществ, значительной вариабельностью их физико-химических свойств, а также из-за возможности возникновения у больных побочных реакций ввиду присутствия в природных препаратах тимуса балластных компонентов.

Широко применяется иммуномодулирующий препарат тимоген [4] синтезированный на основе выделенной из тималина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии иммунно-активной фракции, представляющей собой дипептид L-Glu-L- Trp. Оптимальная доза препарата тимоген для внутримышечных инъекций составляет 100 мкг 1 раз в сутки в течение 5-10 дней.

Однако эффективность использования тимогена в качестве иммуномодулирующего средства снижается из-за сложности химического синтеза, нестабильности препарата в растворе, а также необоснованного применения больших доз препарата.

Известен дипептид L-Lys-L-Glu [5] используемый в настоящее время в качестве компонента для пептидного синтеза.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является применение известного дипептида L-Lys-L-Glu в качестве иммуномодулирующего средства.

Синтез дипептида проводили классическим методом в растворе.

Пример синтеза дипептида:
1. N^α,N^ε -дибензилоксикарбониллизил-γ-бензил-глутаминовая кислота [I]
0,154 г (0,65 ммоль) g-бензилглутаминовой кислоты суспензируют в 3 мл диметилформамида, при перемешивании добавляют 0,091 мл (0,65 ммоль) триэтиламина, затем 0,300 г (0,59 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира N^a,N^e -дибензилоксикарбониллизина. Реакционную смесь перемешивают 12 ч при комнатной температуре. После чего растворитель упаривают в вакууме при 40^oС, к остатку добавляют 10 мл 1 н Н₂SO₄ и дважды экстрагируют продукт этилацетатом (30х2). Органический слой промывают 1 н Н₂SO₄, водой до нейтральной реакции, сушат над Nа₂SO₄. Растворитель отгоняют в вакууме при 40^oС, остаток растворяют в 1-2 мл этилацетата и высаживают продукт гексаном. Перекристаллизация в системе этилацетат/ гексан. Продукт отфильтровывают и сушат в вакууме над Р₂О₅. Выход 0,330 г (88%). Rg 0,81 (бензол:ацетон 1:1, силуфол).

2. L-Лизил-L-глутаминовая кислота.

Защищенный дипептид [1] 0,330 г растворяют в 10 мг метанола, добавляют 3 мл воды и гидрируют над палладием на угле. Контроль по ТСХ. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, остаток растворяют в минимальном количестве воды и высаживают метанолом. Продукт отфильтровывают, промывают этанолом, сушат в вакууме над Р₂О₅. Выход 0,110 г (85%). Т.пл. 194-196^oС. [α]20γ

При экспериментальном изучении специфической активности заявляемого вещества, проведенном в сравнении с тимогеном, выявлены новые, неизвестные для дипептида L-Lys- -L-Glu иммуноактивные свойства, свидетельствующие о перспективности его применения в качестве иммуномодулирующего средства. Это подтверждается следующими примерами.

Влияние дипептида L-Lys-L-Glu на экспрессию Е-рецепторов тимоцитов.

"Трипсиновая" модель.

Проведена оценка влияния дипептида L-Lys-L-Glu на экспрессию Е-рецепторов обработанных трипсином лимфоидных клеток тимуса интактных морских свинок-самцов массой 180-200 г. Принцип метода состоит в том, что после обработки тимоцитов протеолитическим ферментом трипсином, происходит разрушение большей части Е-рецепторов на поверхности клеток к эритроцитам кролика, в результате чего снижается процентное содержание Т-лимфоцитов, выявляемое в реакции розеткообразования. Ранее установлено, что добавление тимогена к обработанным трипсином тимоцитам приводит к восстановлению части разрушенных Е-рецепторов, что проявляется в увеличении количества розеткообразующих клеток (Т-лимфоцитов).

Для оценки биологической активности дипептида L-Lys- -L-Glu использовали 48 морских свинок. С целью получения суспензии лимфоцитов тимус животных гомогенизировали в среде 199. В суспензии тимоцитов определяли процентное содержание "активных" Т-лимфоцитов (Еа-РОК) методом розеткообразования с эритроцитами кролика[6]
Дипептид L-Lys-L-Glu и тимоген растворяли в 0,9%-ном растворе NaCl и вносили в культуры клеток в концентрациях 1•10^-2, 10^-4 мкг/мл.

Установлено, что обработка трипсином проводит к снижению более чем в 2 раза количества лимфоцитов, имеющих на поверхности Е-рецепторы. Добавление дипептида L-Lys-L-Glu в концентрациях 10^-4 1 мкг/мл и тимогена в концентрациях 10^-2 1 мкг/мл приводило к восстановлению количества Е-рецепторов Т-лимфоцитов тимуса (табл.1).

Таким образом, дипептид L-Lys-L-Glu в большом диапазоне концентраций способствует усилению экспрессии Е-рецепторов Т-лимфоцитов, что, вероятно, объясняется непосредственным лиганд-рецепторным взаимодействием. Аналогичное действие оказывает тимоген в дозе, в 100 раз превышающей дозу дипептида L-Lys-L-Glu, что указывает на более высокую биологическую активность нового синтетического дипептида.

2. Модель "старые животные".

Проведена оценка влияния дипептида L-Lys-L-Glu на экспрессию Е-рецепторов тимоцитов старых морских свинок-самцов массой 700-800 г.

Принцип метода состоит в том, что у животных с возрастной инволюцией тимуса на поверхности лимфоцитов уменьшается количество Е-рецепторов к эритроцитам кролика, вследствие чего снижается процентное содержание розеткообразующих Т-лимфоцитов.

С целью сравнительной оценки иммуностимулирующего действия дипептида L-Lys-L-Glu и тимогена использовали тимоциты 42 интактных морских свинок. Для получения суспензии лимфоцитов тимус животных гомогенизировали в среде 199, затем определяли процентное содержание Т-лимфоцитов (Е-РОК) методом розеткообразования с эритроцитами кролика [7]
Исследуемый дипептид и тимоген растворяли в 0,9%-ном растворе NaCI и вносили в культуры клеток в концентрациях 1,10^-2, 10^-4 мгк/мл.

В результате проведенного эксперимента установлено, что у морских свинок с возрастной инволюцией тимуса снижено количество Т-лимфоцитов, выявляемых в реакции розеткообразования. Тимоген способствовал достоверному увеличению розеткообразующих Т-лимфоцитов только в концентрации 1 мкг/мл, тогда как дипептид L-Lys-L-Glu оказывал стимулирующее влияние на экспрессию Е-рецепторов Т-лимфоцитов во всех исследуемых концентрациях (табл.2).

Таким образом, стимулирующий эффект L-Lys-L-Glu проявляется в концентрациях в 100-10000 раз меньших, чем концентрация тимогена.

Влияние дипептида L-Lys-L-Glu на субпопуляции Т-лимфоцитов периферической крови человека.

Проведена оценка действия дипептида L-Lys-L-Glu на субпопуляции лимфоцитов, используя реакцию непрямой иммунофлуоресценции моноклональными антителами, полученными к дифференцировочным антигенам поверхности клеток.

Лимфоциты выделяли из гепаринизированной (25 ед/мл) периферической крови 18 больных с гнойно-воспалительными заболеваниями легких и хроническими гнойными бронхитами, сопровождающимися вторичными иммунодефицитными состояниями, центрифугированием в градиенте плотности фиколл-уротраст. Выделенные клетки инкубировали с дипептидом L-Lys-L-Glu в концентрациях 1, 10^-2, 10^-4 мкг/мл и тимогеном в концентрациях 1, 10^-2, 10^-4 мкг/мл в течение 45 мин при 37^oС.

В контрольные пробы добавляли среду 199. Затем в культурах лимфоцитов, используя метод непрямой иммунофлуоресцентной реакции с мышиными моноклональными антителами ОКТ4 и ОКТ8 ("Ortho",США), полученными к дифференцировочным антигенам поверхности лимфоцитов [8] определяли процентное содержание Т-хелперов (ОКТ4⁺), Т-супрессоров (ОКТ8⁺) и высчитывали коэффициент дифференцировки ОКТ4⁺/ОКТ8⁺.

Установлено, что действие дипептида L-Lys-L-Glu во всех концентрациях приводило к увеличению исходно сниженного количества Т-хелперов (табл.3). Тимоген восстанавливал содержание Т-хелперов в концентрациях 1, 10^-2 мкг/мл. Оба препарата достоверного изменения количества Т-супрессоров у данной категории больных в исследованиях in viro не вызывали.

Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о выраженной иммунобиологической активности дипептида L-Lys-L-Glu, проявляющейся в усилении экспрессии рецепторов Т-хелперов. Тимоген оказывает аналогичное действие в концентрации, в 100 раз превышающей концентрацию нового дипептида.

Влияние дипептида L-Lys-L-Glu на систему иммунитета здоровых животных.

Работа выполнена на здоровых морских свинках-самцах массой 250-300 г. В каждую подопытную и контрольную группы входило 10 животных. Исследуемые препараты вводили животным ежедневно однократно внутримышечно в течение 5 дней в дозах: дипептид L-Lys-L-Glu 0,01 мкг/кг, тимоген 1 мкг/кг. Животным контрольной группы по аналогичной схеме вводили физиологический раствор.

Учет результатов производили на 10 сутки от начала введения препаратов. В крови, тимусе, лимфатических узлах, селезенке и красном костном мозге оценивали количество Т-лимфоцитов, "активных" Т-лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами кролика, В-лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами барана обработанными антителами и комплементом [9]
Установлено, что на 10 сутки от начала введения препаратов, у животных, получавших новый дипептид и тимоген, наблюдалось увеличение количества Т-лимфоцитов в периферической крови, тимусе, селезенке и костном мозге (табл.4). Наряду с этим, тимоген способствовал увеличению количества В-лимфоцитов в периферической крови, а дипептид L-Lys-L-Glu в селезенке.

Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемый дипептид оказывает сходное с тимогеном стимулирующее влияние на процессы паролиферации, дифференцировки и миграции Т- и В-лимфоцитов в дозе, в 100 раз меньшей, чем тимоген.

Влияние дипептида L-Lys-L-Glu на показатели неспецифической защиты и состояние иммунной системы организма мышей.

В работе было использовано 80 мышей самцов СВА массой 18-20 г, которым ежедневно однократно внутрибрюшинно в течение 6 дней вводили исследуемые препараты: тимоген в дозах 1 мкг/кг и 0,01 мкг/кг и дипептид L-Lys-L-Glu в дозе 0,01 мкг/кг. Контрольным животным вводили апирогенный физиологический раствор. Все животные были разделены на две части по 40 мышей, в каждой из которых было 4 группы по 10 животных. В первой части животные не подвергались никаким дополнительным воздействиям, во второй получали внутрибрюшинное введение пептона.

В первой части эксперимента животных забивали методом цервикальной дислокации и исследовали тимус, селезенку и неиндуцированные клетки перитонеального экссудата. Тимус и селезенку взвешивали.

Селезенку гомогенизировали, из двух селезенок готовили клеточную суспензию и определяли процент содержания Т- и Влимфоцитов в непрямом методе иммунолюминесценции [10] по выявлению на их поверхности Thy-1 антигена и иммуноглобулиновых рецепторов. Иммунную сыворотку к Thy-1 антигену получали иммунизацией кроликов гомогенатом ткани головного мозга мыши [11] а антиглобулиновую сыворотку приготовляли иммунизацией кроликов суммарной фракцией иммуноглобулинов мыши, выделенных осаждением сульфатом аммония.

С помощью фазовоконтрастного устройства люминесцентного микроскопа определяли общее количество спленоцитов в поле зрения и клеток, дающих люминесценцию мембранного типа.

Клетки перитонеального экссудата пулировали, подсчитывали их общее количество и определяли процентное содержание макрофагов в мазках, окрашенных по Романовскому. Далее их центрифугировали при 150 g 10 мин, ресуспендировали в среде 199 и определяли способность клеток восстанавливать нитро-синий тетразолий (НСТ) [12] В качестве индуктора использовали зимозан. опсонизированный комплементом морской свинки по стандартной методике [13] Результаты учитывали на многоканальном спектрофотометре при длине волны 620 нм.

Для оценки поглотительной способности макрофагов использовали реакцию с нейтральным красным [14] Результаты учитывали на многоканальном спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Другая часть животных (также 40 мышей, по 10 животных в группе) за 2,5 ч до окончания эксперимента получали внутрибрюшинно инъекцию 10%-ного стерильного пептона для получения максимального выхода нейтрофилов (95-98%). Концентрация клеток перитонеального экссудата служила критерием оценки хемотаксической активности нейтрофилов в ответ на индуктор.

Объектом поглощения служила суточная культура Staphylococcus aureus в конечной концентрации 250 млн/мл.

В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза определяли фагоцитарный показатель (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и фагоцитарный индекс (количество микробов, захваченных одним нейтрофилом) [15]
При исследовании действия препаратов на вес тимуса и селезенки (табл.5) было установлено, что введение дипептида L-Lys-L-Glu в дозе 0,01 мкг/кг не оказывало влияние на вес тимуса, но вызывало увеличение веса селезенки.

Введение тимогена в сравнимой с ним дозе 0,01 мкг/кг вызывало иной эффект снижение веса тимуса и селезенки.

Тимоген в большой дозе 1 мкг/кг, приближающейся к дозировке, применяемой в клинике, вызывал достоверное снижение веса тимуса, не влияя при этом на вес селезенки.

Уменьшение веса лимфоидных органов, наблюдаемое при действии тимогена в дозе 0,01 мкг/кг, вызывало также и уменьшение количества клеток перитонеального экссудата (0,9 млн/мл по сравнению с контролем 1,9 млн/мл). Другая доза тимогена, а также дипептид L-Lys-L-Glu на содержание клеток перитонеального экссудата не влияли (1,9 млн/мл и 1,8 млн/мл соответственно). Процентное содержание макрофагов среди клеток перитонеального экссудата в группах не менялось и оставалось в пределах нормы около 30%
Процентное содержание Т-лимфоцитов в селезенке под влиянием дипептида L-Lys-L-Glu несколько увеличивалось (табл.6) В остальных группах содержание ни Т-, ни В-лимфоцитов не изменялось.

При исследовании влияния препаратов на резидентные перитонеальные макрофаги (табл. 7 и 8) было отмечено стимулирующее влияние дипептида L-Lys-L-Glu и тимогена в дозах 0,01 мкг/кг. При этом отмечали равнозначное для обеих групп животных усиление как спонтанной, так и индуцированной способности макрофагов восстанавливать НСТ, а по способности поглощать нейтральный красный дипептид L-Lys-L-Glu оказался в 1,3 раза активнее, чем тимоген.

Тимоген в дозе 1 мкг/кг не оказывал влияние на исследованные характеристики макрофагов.

Изучение влияния препаратов на функциональную активность индуцированных пептоном нейтрофилов показало, что дипептид L-Lys-L-Glu обладал способностью усиливать хемотаксическую (табл. 9) активность и фагоцитоз стафилококков (табл.10).

Тимоген в сравнимой с ним дозе 0,01 мкг/кг не обладал способностью стимулировать нейтрофилы. Однако, в большой дозировке 1 мкг/кг веса тимоген также стимулировал фагоцитоз и хемотаксис нейтрофилов.

Таким образом, оба исследованных препарата обладали способностью вызывать заметное перераспределение лимфоидных клеток в организме, а также оказывать стимулирующее действие на фагоцитарное звено неспецифического иммунитета. При этом дипептид L-Lys-L-Glu в дозе 0,01 мкг/кг обладал способностью стимулировать как макрофаги, так и нейтрофилы, в то время как тимоген в большой дозе (1 мкг/кг) стимулировал только нейтрофилы, а в меньшей дозе (0,01 мкг/кг) стимулировал только макрофаги.

Результаты экспериментального изучения заявляемого средства свидетельствуют о его высокой иммунологической активности Новый дипептид оказывает сильное иммуностимулирующее действие на показатели клеточного и гуморального иммунитета в дозах, пример, в 100-1000 раз меньших, чем тимоген. Дипептид L-Lys-L-Glu обладает более широким спектром действия на показатели неспецифической резистентности организма, усиливая функциональную активность фагоцитов и нейтрофилов в дозе, в 100 раз меньшей, чем тимоген.

Таким образом, известные до подачи заявки на изобретение свойства дипептида L-Lys-L-Glu не дают основания считать очевидным использование его в качестве иммуномодулирующего средства, что означает применение указанного дипептида по новому назначению.

Источники информации
1. Gldstein A. L. Guba A. Zatz M.M. et. al. Purification and bioligcal activity of thymosin, a hormone of the thymus gland // Proc. Nat. Acad. USA.

1972. Vol. 69, N 7. P. 1800-1803.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. Медицина, 1988. т. 2, гл. 9, с. 168-175.

3. Арион В.Я. Тактивин (Т-активин) и его иммунобиологическая активность // Иммунобиология гормонов тимуса. Киев: Здоровья, 1989. с.103-125.

4. Яковлев Г.М. Хавинсон В.Х. Морозов В.Г. и др. Сравнительное изучение биологической активности тималина и синтетического пептида тимуса // Тез.докл.науч.конф."Биохимия медицине" Л. 1988, с.217-218.

5. SERVA Catalog. Heidelberg, 1987/88.-PE 1 PE 40.

6. Nekam K. Fudenberg H.H. Strelkanskas A.J. Identification of "activ" T-lymphocytes among effector cells in guinea pigs // Immunopharmacol.-1982. -Vol.5, N 1.-P.85-94.

7. Stadecker M.J. Bishop G. Wortis H.H. Rosette formation by guinea pig thymocytes and thymus derived lymphocytes with rabbit red blood cells // J. Immunol.-1973. Vol.111, N 6.-P.1834-1837.

8. Reinherz E. L. Kung P.C. Goldstein G. Schlossman S.F. Separation of functional subsets of human T-cells by a monoclonal antibody // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1979. Vol.76, N 8.-P.4061-4065.

9. Bianco C. Patrick R. Nussenzwieg V.A population of lymphocytes bearing a membrane receptor for antigen-antibody complement complexes. I.Separation and characterization // J. Exp. Med. 1970. Vol.132, N 4.-P.702-720.

10. Шторх В. Эммрих Й. Определение клеточных маркеров методом мембранной иммунофлуоресценции // Иммунологические методы. М. Медицина, 1987.- с.254-268.

11. Jolub E.S. Brain-associated O antigen: reactivity rabbit anti-mouse brain nith mouse lymphoid cells // Cell. Immunol.-1971.-Vol.2.-P.353-361.

12. Rook J.A.W. et al.//J.Immun.Meth.-1985.-Vol.82-P.161-167.

13. Методические рекомендации по оценке иммунологических свойств фармакологических средств. М. 1992.

14. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека. Л. 1986.

15. Меньшиков В. В. Лабораторные методы исследования в клинике. М. Медицина, 1987. с.310.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Предложено использовать дипептид L-лизил-L- глутаминовая кислота в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью. 10 табл.

Применение дипептида L-лизил-L-глутаминовая кислота в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью.