СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ Т-ЛИМФОЦИТОВ Российский патент 2002 года по МПК A61K38/08 C07K7/06 

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и заключается в применении пептида формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в качестве средства, стимулирующего дифференцировку Т-лимфоцитов.

Дифференцировка Т-лимфоцитов представляет собой процесс образования функционально полноценных Т-лимфоцитов из клеток-предшественников, который протекает преимущественно на территории центрального органа клеточного иммунитета - тимуса. Дифференцировка заканчивается образованием зрелого Т-лимфоцита, имеющего определенные мембранные маркеры (антигены CD3, CD4, CD8), отсутствующие на ранних стадиях развития [1]. Одним из механизмов формирования иммунодефицита по Т-системе иммунитета является угнетение дифференцировки Т-лимфоцитов. Применение в таких случаях стимуляторов дифференцировки может привести к нормализации иммунного статуса организма.

Известны вещества пептидной природы, стимулирующие дифференцировку Т-лимфоцитов. К ним относятся препараты, полученные из тимуса животных, такие как тимозин [2], Т-активин [3], тималин [4]. Эти препараты состоят из комплекса веществ пептидной природы, которые способны регулировать различные этапы пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов. Использование их в качестве лекарственных средств затруднено в связи со сложностью способов получения, малым выходом активных веществ, значительной вариабельностью их физико-химических свойств, а также из-за наличия нежелательных побочных эффектов ввиду присутствия в природных препаратах тимуса балластных высокомолекулярных компонентов. Предпочтительнее использовать низкомолекулярные синтетические пептиды. Они эффективны в чрезвычайно малых дозах и не оказывают вредного воздействия на организм.

Известны синтетические пептиды, обладающие способностью стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов. К ним относятся пептид тимопентин Arg-Lys-Asp-Val-Thr (Goldstein G. , Audhya Т.К. Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies. Survey of immunologic Research. (1985), 4: suppl. 1, pp. 1-10); аналоги тимопентина (патент ЕР 1450798, С 07 К 7/64, 1985; патент США 5013723, А 61 К 37/02, 1991); пептид Tyr-Gly (патент США 5100663, А 61 К 37/02, 1992); аналог гормона тимуса, имеющий формулу Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (патент WO 95/01182, А 61 К 37/00, 37/02, С 07 R 5/00, 7/00, 15/00, 17/00, 1995); трипептид Arg-Lys-Glu, обладающий иммуностимулирующей активностью и действующий в основном на Т-клеточное звено иммунитета (патент США 4874844, С 07 К 5/08, 1989); аналог сывороточного тимического фактора общей формулы А-Gly-Gly-Ser-Asn-B-C-NH-R, где А - Glu, Gln, Ala-Lys-Ser или Glu-Ala-Lys-Ser; В и С - Gly, Phe, Leu, Ala (патент ЕР 0201646, С 07 К 07/06, 1986).

Известно средство тимоген, обладающее способностью стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов [5,6]. Тимоген синтезирован на основе выделенной из тималина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии иммуноактивной фракции, представляющей собой дипептид Glu-Trp. Данное вещество по технической сущности и достигаемому эффекту является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом. Согласно прототипу синтетический пептид Glu-Trp дозозависимо и избирательно стимулирует дифференцировку предшественников Т-клеток в зрелые Т-клетки, но не влияет на В-клеточную дифференцировку. Однако данный пептид обладает низкой биологической активностью, что требует применения больших доз препарата и влечет появление нежелательных побочных эффектов.

Настоящее изобретение направлено на расширение арсенала и повышение биологической активности средств, стимулирующих дифференцировку Т-лимфоцитов.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства, обладающего способностью стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов, предлагается использовать синтетический пептид структурной формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu. Пептид синтезирован стандартной методикой твердофазного синтеза путем наращивания пептидной цепи с N-конца [7]. Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu - кислый, гидрофильный пептид с ММ 761 Д.

При экспериментальном изучении специфической активности заявляемого средства, проведенном в сравнении с тимогеном, выявлена его способность стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов в значительно меньшей концентрации. Это подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на экспрессию Е-рецепторов "трипсинизированных" тимоцитов.

С целью получения суспензии лимфоидных клеток тимус интактных морских свинок-самцов гомогенизировали в среде 199. Затем полученную суспензию тимоцитов обрабатывали протеолитическим ферментом трипсином ("Sigma"), разрушающим большую часть Е-рецепторов на поверхности клеток к эритроцитам кролика, в результате чего снижается процентное содержание клеток, выявляемых в реакции розеткообразования (Т-лимфоцитов). В суспензии интактных тимоцитов и тимоцитов, обработанных трипсином, определяли процентное содержание "активных" Т-лимфоцитов (Еа-РОК) методом розеткообразования с эритроцитами кролика [8, 9]. Пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu и тимоген вносили в культуры "трипсинизированных" тимоцитов в диапазоне концентраций от 0,0004 до 0,05 мкг/мл.

Установлено, что обработка трипсином приводит к снижению более чем в 2 раза количества тимоцитов, имеющих на поверхности Е-рецепторы. Добавление пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в концентрации 0,05 - 0,002 мкг/мл и тимогена в концентрации 0,05 - 0,01 мкг/мл приводило к восстановлению количества Е-рецепторов лимфоидных клеток тимуса (таблица 1).

Таким образом, минимальная концентрация, в которой заявляемое средство способствует усилению экспрессии Е-рецепторов тимоцитов в 5 раз меньше, чем у тимогена, что указывает на более высокую специфическую активность пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu.

Пример 2. Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на экспрессию дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов больных с ожогами in vitro.

Специфическую активность заявляемого средства оценивали по способности последнего стимулировать экспрессию дифференцировочных антигенов, являющихся маркерами зрелого Т-лимфоцита. Уровень экспрессии дифференцировочных антигенов оценивали методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с моноклональными антителами LT3, LT4, LT8 к дифференцировочным антигенам CD3, CD4, CD8 ("Сорбент", Москва) [10], являющихся маркерами зрелого Т-лимфоцита и экспрессирующихся на завершающих этапах дифференцировки Т-клеток. Исследование проводили на лимфоцитах больных с ожогами, поскольку известно, что при ожоговой болезни нарушается дифференцировка Т-лимфоцитов и в периферической крови снижается количество зрелых форм Т-клеток [11,12]. Лимфоциты больных с ожогами IIIб-IV степени 15-30% поверхности тела выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин. Полученную суспензию клеток инкубировали с пептидом Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu и тимогеном в концентрации от 0,0004 до 0,05 мкг/мл в течение 2 ч при 37^oС в полной питательной среде RPMI-1640 ("Flow") с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки ("Flow"), 2мМ L-глутамина ("Flow"), 40 мкг/мл гентамицина ("Фармахим") и 5мМ HEPES-буфера. В качестве контроля использовали физиологический раствор в соответствующем объеме. Полученные данные представлены в таблице 2.

Установлено, что у больных с ожогами резко снижено количество всех изучаемых субпопуляций лимфоцитов, исключая СОВ⁺клетки. Тимоген восстанавливал содержание СD3⁺ и CD4⁺-лимфoцитoв в концентрациях 0,05 - 0,01 мкг/мл, а заявляемое средство оказалось активно в дозах 0,05 - 0,002 мкг/мл. Оба средства достоверного изменения количества CD8⁺-лимфоцитов не вызывали (табл. 2).

Таким образом, пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu увеличивает экспрессию дифференцировочных антигенов в дозах в 5 раз меньших, чем тимоген, что является отражением его высокой специфической активности.

Пример 3. Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на экспрессию дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов у тимэктомированных мышей in vivo. Биологическую активность заявляемого средства изучали на модели тимэктомии [13] . Известно, что в тимусе происходит дифференцировка Т-лимфоцитов и его удаление сопровождается нарушением этого процесса. В трехмесячном возрасте производили оперативное удаление тимуса у мышей. Контрольная группа животных подверглась ложной операции с воспроизведением всех этапов оперативного вмешательства за исключением удаления тимуса. Через 1 месяц после оперативного вмешательства тимэктомированным животным вводили пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu и тимоген в дозах от 0,0008 до 0,1 мкг/кг веса тела в течение 7 дней. Контролем служили тимэктомированные животные, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме. Количество зрелых Т-лимфоцитов, имеющих кластеры дифференцировки CD4 (Т-хелперы) и CD8 (цитотоксические Т-лимфоциты), определяли в реакции прямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител, меченых FITC, F7400 и F7525 к молекулам CD4 и CD8 мыши соотвественно ("Sigma", Швеция). Известно, что CD4 и CD8 являются дифференцировочным маркером Т-клеток и определяются на заключительных этапах дифференцировки соответственно Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов и отсутствуют на стадии пре-Т-клеток. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Установлено, что у тимэктомированных мышей резко снижается количество Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности дифференцировочные антигены CD4 и CD8. Введение пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu во всем диапазоне доз тимэктомированным животным приводит к повышению количества зрелых Т-лимфоцитов, имеющих кластеры дифференцировки на своей поверхности, причем максимальная активность предлагаемого средства зарегистрирована в концентрации 0,02 мкг/кг веса тела. Аналогичный эффект достигается и введением тимогена в дозах от 0,004 до 0,1 мкг/кг веса с максимальной активностью в дозировке 0,1 мкг/кг веса тела. Таким образом, пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu in vivo стимулирует дифференцировку Т-лимфоцитов в концентрациях в 5 раз меньших, чем известный пептид тимоген.

Таким образом, при экспериментальном изучении специфической активности заявляемого средства установлено, что пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu обладает свойством стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов. По сравнению с тимогеном заявляемый пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu способен стимулировать дифференцировку Т-клеток в 5 раз меньших дозах. Уменьшение дозировки заявляемого средства для достижения аналогичного эффекта дает возможность уменьшить риск побочного влияния средства при введении его в организм.

Предлагаемое средство может найти применение для профилактики и лечения широкого спектра иммунодефицитных состояний, сопровождающихся нарушением процесса дифференцировки Т-лимфоцитов.

Источники информации
1. Кетлинский С. А. , Калинина Н.М. Иммунология для врача. - Спб. ТОО, изд-во "Гиппократ". 1998. - 156 с.

2. Goldstein A.L., Guba A., Zatz M.M. et al. Purification and biological activity of thymosin, a hormone of the thymus gland // Proc. Nat. Acad. USA 1972. Vol. 69. N 7. P. 1800-1803.

3. Арион В. Я. Т-активин и его иммунобиологические свойства: Автореф. дис. док. биол. наук. - М. - 1990. - 52 с.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1988 - т.2, гл. 9, с. 168-175.

5. Яковлев Г.М., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. и др. Сравнительное изучение биологической активности тималина и синтетического пептида тимуса // Тез. докл. науч. конф. "Биохимия медицине". - Л., 1988, с. 217 - 218.

6. Хавинсон В.Х., Синакевич Н.В., Серый С.В. Тимоген.- СПб, 1991. - 48 с.

7. Steward J. M. , Young J.D. Solid phase peptide synthesis, San Francisco, 1969.

8. Nekam К., Fudenberg H.H., Strelkanskas A.J. Identification of "activ" T-lymphocytes among effector cells in guinea pigs // Immunopharmacol. - 1982. - Vol.5. - 1.- P. 85-94.

9. Stadecker M. J., Bishop G., Wortis H.H. Rosette formation by guinea pig thymocytes and thymus derived lymphocytes with rabbit red blood cells // J. Immunol.- 1973. Vol. 111. 6. - P. 1834-1837.

10. Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. - М.: Мир, 1990, 395 с.

11. Колкер И.И., Вишневская С.М., Панова Ю.М. и др. Содержание Т- и В-лимфоцитов у больных с термическими ожогами // Клиническая медицина. - 1985. - 7. - С. 87-93.

12. Белоцкий С. М. , Борисова Т.Г., Снастина Т.И. и др. Характеристика фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов у обожженных // Иммунология. - 1983. - 6. - С. 51-54.

13. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. Пер. с нем. А.П. Тарасова. - М.: Медицина, 1987, 472 с.

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской промышленности, и может быть использовано для лечения иммунодефицитных состояний, сопровождающихся нарушением процесса дифференцировки Т-лимфоцитов. Сущностью изобретения является применение пептида формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в качестве средства, стимулирующего дифференцировку Т-лимфоцитов. Техническим результатом является высокая специфическая активность предложенного пептида и снижение риска побочных эффектов. 3 табл.

Пептид структурной формулы Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu, стимулирующий дифференцировку Т-лимфоцитов.