СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2002 года по МПК A61K38/08 

Изобретение относится к медицине, а именно к новым пептидным средствам, обладающим иммуностимулирующей активностью.

Известны вещества пептидной природы, обладающие иммуностимулирующей активностью. К ним относятся препараты, полученные из тимуса животных, такие как тимозин [1] , Т-активин [2] , тималин [3] , а также выделенные из костного мозга и бурсы Фабрициуса: миелопид, бурсилин, гемалин [4] . Эти препараты состоят из комплекса веществ пептидной природы, которые способны регулировать различные этапы пролиферации и созревания лимфоцитов, воздействовать на различные звенья иммунного ответа. Использование их в качестве иммуностимулирующих средств затруднено в связи со сложностью способов получения, малым выходом активных веществ, значительной вариабельностью их физико-химических свойств, а также из-за наличия нежелательных побочных эффектов ввиду присутствия в природных препаратах тимуса балластных высокомолекулярных компонентов. Предпочтительнее использовать низкомолекулярные синтетические пептиды. Они эффективны в чрезвычайно малых дозах и не оказывают вредного воздействия на организм.

Известны синтетические пептиды, обладающие иммуностимулирующей активностью. К ним относятся пептид Glu-Asp-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asp-OH (патент США 4478828, А 61 К 37/00, С 07 С 103/52, 1984); тимопентин Arg-Lys-Asp-Val-Thr (Goldstein G. , Audhya Т. К. . Thymopoietin to Thymopentin: Experimental Studies. Survey of immunologic Research. (1985), 4: suppl. 1, pp. 1-10); аналоги тимопентина (патент ЕР 1450798, С 07 К 7/64, 1985; патент США 5013723, А 61 К 37/02, 1991); пептид общей формулы R-NH-CH-(-COOH)-
(CH₂-)_n-CO-X, где n = 1, 2, R - водород, низший ацил или низший алкил, Х-гетероароматическая аминокислота (патент РФ 2142958, С 07 К 5/037, А 61 К 38/05, 1999); пептид формулы R-Arg-X-Y-Z-R₁, где R - водород, ацетил, формил; Х - пролин, Y - L-Ala, L-Asp, L-Val; Z - L-Val, L-Ala; R₁ - H, OH, NH₂, NH (СН₃), NНСН(СН₃)₂ (патент РФ 2060998, С 07 К 5/068, А 61 К 38/07, 1996); пептид L-Lys-L-Glu (патент РФ 2080120, А 61 К 38/05, 1997); гексапептид структурной формулы: аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (патент РФ 2062096, А 61 К 38/08, 1996); лизинсодержащий пептид, имеющий формулу: R₁-L-Glx-L-Glx-L-Lys-R₂, где Glx - это Gln или Glu (патент WO 94/09804, А 61 К 37/00, 73/02, С 07 К 5/00, 1994); пептид Tyr-Gly (патент США 5100663, А 61 К 37/02, 1992); пептид, имеющий формулу L-Thr-L-Ala-L-Glx-L-Glx-L-Lys, где Glx - это Gln или Glu (патент WO 95/12810, А 61 К 37/02, С 07 К 7/06, 1993); аналог гормона тимуса, имеющий формулу Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (патент WO 95/01182, А 61 К 37/00, 37/02, С 07 R 5/00, 7/00, 15/00, 17/00, 1995); пептид, обладающий иммуномодуляторной активностью Н-Lys-Asn-Pro-Tyr-OH (патент США 5980913, А 61 К 38/04, 1999); трипептид Arg-Lys-Glu, обладающий иммуностимулирующей активностью и действующий в основном на Т-клеточное звено иммунитета (патент США 4874844, С 07 К 5/08, 1989); нонапептид формулы Glu-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trh-Asn-OH (патент США 4478828, А 61 К 37/00, 1984); пептид формулы А-В-С-И-Д, где А - Lys или Arg, В - Lys или Arg, С - Asp или Glu, И - Val или Тyr, Тгр, Д - Тгр или Phe (патент США 4650788, А 61 К 37/02, 1987); пептид, имеющий в своем составе аминокислотную последовательность пролил-глицил (патент США 4399124, А 61 К 37/00, 1983); пептид формулы A-X-Lys-Y-B, где А - Н, или трипептид Arg-Ala-Arg, или гексапептид Glu-Lys-Arg-Arg-Ala-Arg, Х и Y - аргинин или глутаминовая кислота, В-ОН, или трипептид Arg-Ala-Arg (патент США 5079231, А 61 К 37/02, 1992); аналог сывороточного тимического фактора общей формулы A-Gly-Gly-Ser-Asn-B-C-NH-R, где А - Glu, Gln, Ala-Lys-Ser или Glu-Ala-Lys-Ser; В и С - Gly, Phe, Leu, Ala (патент ЕР 0201646, С 07 К 07/06, 1986); иммуностимулирующий пептид (патент ЕР 0353565, С 07 К 07/06 1990), миелопептиды (WO 98/30581, С 07 К 7/06, 1998).

Известно иммуностимулирующее средство тимоген [5, 6] , синтезированный на основе выделенной из тималина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии иммуноактивной фракции, представляющей собой дипептид Glu-Trp. Данное вещество по технической сущности и достигаемому эффекту является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом. Однако данный пептид обладает низкой биологической активностью, что требует применения больших доз препарата и влечет появление нежелательных побочных эффектов.

Настоящее изобретение направлено на расширение арсенала и повышение биологической активности средств, обладающих иммуностимулирующим действием.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства, обладающего иммуностимулирующим действием, предлагается использовать новый синтетический пептид структурной формулы Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu.

Пептид формулы Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu был обнаружен в ткани бурсы Фабрициуса - центральном органе гуморального иммунитета птиц, и в дальнейшем синтезирован. Пептид синтезировали стандартной методикой твердофазного синтеза путем наращивания пептидной цепи с N-конца [7] .

При экспериментальном изучении биологической активности заявляемого средства, проведенном в сравнении с тимогеном, выявлена его способность стимулировать иммунитет. Это подтверждается следующими примерами.

1. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на экспрессию Е-рецепторов "трипсинизированных" тимоцитов. С целью получения суспензии лимфоидных клеток тимус интактных морских свинок-самцов гомогенизировали в среде 199. Затем полученную суспензию тимоцитов обрабатывали протеолитическим ферментом трипсином ("Sigma"), разрушающим большую часть Е-рецепторов на поверхности клеток к эритроцитам кролика, в результате чего снижается процентное содержание клеток, выявляемых в реакции розеткообразования. В суспензии интактных тимоцитов и тимоцитов, обработанных трипсином, определяли процентное содержание "активных" Т-лимфоцитов (Еа-РОК) методом розеткообразования с эритроцитами кролика [8, 9] .

Установлено, что обработка трипсином приводит к снижению более чем в 2 раза количества тимоцитов, имеющих на поверхности Е-рецепторы. Добавление пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu в концентрации 0,1-0,001 мкг/мл и тимогена в концентрации 0,1-0,01 мкг/мл приводило к восстановлению количества Е-рецепторов лимфоидных клеток тимуса (табл. 1).

Таким образом, минимальная концентрация, в которой заявляемое средство способствует усилению экспрессии Е-рецепторов тимоцитов, в 10 раз меньше, чем у тимогена, что указывает на более высокую иммуностимулирующую активность пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu.

2. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на экспрессию иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов. Известно, что IgM является маркером зрелой В-клетки и определяется на завершающем этапе антигеннезависимой дифференцировки и пролиферации В-лимфоцитов [10] . Лимфоциты выделяли из гепаринизированной (25 ЕД/мл) периферической крови больных с ожогами IIIб-IV степени 15-30% поверхности тела, поскольку известно, что при ожоговой болезни нарушается дифференцировка лимфоцитов и в периферической крови появляется большое количество незрелых или "нулевых" клеток [11, 12] . Выделенные клетки инкубировали в течение 2 часов при температуре 37^oС в полной питательной среде с пептидом Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu и тимогеном в концентрациях от 0,001 до 1 мкг/мл. Уровень экспрессии IgM-рецепторов оценивали методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител СН2 ("Сорбент", Москва) [13] .

Установлено, что у больных с ожогами более чем в 1,5 раза снижено количество лимфоцитов, несущих поверхностный IgM, что, вероятно, связано с дефектом дифференцировки лимфоцитов в костном мозге. Предлагаемый пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu дозозависимо стимулирует экспрессию иммуноглобулиновых рецепторов. Так, заявляемое средство эффективно в концентрациях 0,1-1 мкг/мл. В то же время известное средство тимоген проявляет слабую активность лишь в концентрации 1 мкг/мл (табл. 2).

Таким образом, заявляемое средство синтетический пептид Тrр-Тrе-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu увеличивает экспрессию IgM-рецепторов В-лимфоцитов в дозах, в 10 раз меньших, чем тимоген.

3. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на экспрессию дифференцировочных антигенов лимфоцитов больных с ожогами in vitro. Оценка действия заявляемого средства на субпопуляции лимфоцитов проводилась методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с моноклональными антителами LT3, LT4, LT8, LT19 и LT21 к дифференцировочным антигенам CD3, CD4, CDS, CD19 и CD21 соответственно ("Сорбент", Москва) [13] . Лимфоциты больных с ожогами, сопровождающимися вторичным иммунодефицитом, выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин. Полученную суспензию клеток инкубировали с пептидом Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu и тимогеном в течение 60 минут при 37^oС в полной питательной среде RPMI-1640 ("Flow") с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки ("Flow"), 2 мМ L-глутамина ("Flow"), 40 мкг/мл гентамицина ("Фармахим") и 5 мМ HEPES-буфера. В качестве контроля использовали физиологический раствор в соответствующем объеме.

Установлено, что у больных с ожогами резко снижено количество всех изучаемых субпопуляций лимфоцитов, исключая СD8⁺-клетки. Тимоген восстанавливал содержание СD3⁺- и CD4⁺-лимфoцитoв в концентрациях 1,0-0,01 мкг/мл, а заявляемое средство оказалось активно в дозах 1,0-0,001 мкг/мл. Оба средства достоверного изменения количества СD8⁺-лимфоцитов не вызывали (табл. 3).

Инкубация лимфоцитов ожоговых больных с пептидом Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu приводит к достоверному увеличению числа CD19⁺ и CD21⁺ клеток в концентрации от 0,05 до 1 мкг/мл, приближая эти показатели к нормальным, причем максимальная активность пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu наблюдается в концентрации 0,1 мкг/мл. В то же время известное средство тимоген проявляет свою активность лишь в концентрации 1 мкг/мл (табл. 4).

Таким образом, пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu увеличивает экспрессию дифференцировочных антигенов в дозах, в 10 раз меньших, чем тимоген, что является отражением его высокой иммуностимулирующей активности.

4. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на иммунный ответ у тимэктомированных крыс (табл. 5). Биологическую активность заявляемого средства изучали на модели тимэктомированных крыс [14] . В трехмесячном возрасте производили оперативное удаление тимуса. Контрольная группа крыс подверглась ложной операции. Через 2 месяца после оперативного вмешательства тимэктомированным животным вводили пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu и тимоген в дозах от 0,001 до 1 мкг/кг веса тела в течение недели. Контролем служили тимэктомированные животные, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме. Крыс иммунизировали эритроцитами барана и через 5 суток определяли состояние иммунитета.

Установлено, что у тимэктомированных крыс снижается титр гемагглютининов на ксеногенные эритроциты, уменьшается количество антителобразующих клеток в селезенке и число лейкоцитов в крови. При введении пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu восстанавливается иммунный ответ на тимусзависимый антиген, что выражается в увеличении титра гемагглютининов и гемолизинов, АОК, восстанавливается количество лейкоцитов и возрастает масса селезенки. Максимальная активность заявляемого средства проявляется в концентрации 0,1 мкг/кг веса, в то время как тимоген обладает подобным действием в концентрации 1 мкг/кг веса тела.

5. Влияние пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu на иммунный ответ у бурсэктомированных цыплят. Специфическую биологическую активность заявляемого средства изучали также в опытах in vivo на модели эмбриональной бурсэктомии [14] . Известно, что бурса Фабрициуса -центральный орган иммунитета птиц, аналог которого у млекопитающих отсутствует. В бурсе происходит антигеннезависимая дифференцировка В-лимфоцитов и ее удаление сопровождается нарушением этого процесса. При этом наблюдается выраженное угнетение гуморального иммунитета, что связано с отсутствием у бурсэктомированных птиц зрелых В-лимфоцитов, способных вовлекаться в иммунный ответ. Бурсэктомированные цыплята значительно отстают в росте и практически полностью погибают после 7-8 недели жизни.

Эмбриональную бурсэктомию выполняли хирургическим путем на 19 день эмбрионального развития, контрольная группа эмбрионов в эти же сроки подвергалась ложной операции с воспроизведением всех этапов оперативного вмешательства за исключением удаления бурсы Фабрициуса.

Начиная с месячного возраста в течение недели бурсэктомированные цыплята внутримышечно получали пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu и тимоген в дозах от 0,001 до 1 мкг/кг массы тела 1 раз в сутки в течение недели. Контролем служили бурсэктомированные цыплята, получавшие физиологический раствор в аналогичном объеме. Затем птиц иммунизировали эритроцитами барана и через 5 суток определяли состояние иммунитета (табл. 6).

Установлено, что у эмбрионально бурсэктомированных птиц снижается иммунный ответ на введение ксеногенных эритроцитов, это проявляется в резком снижении титра гемагглютининов и гемолизинов, антителобразующих клеток селезенки. У бурсэктомированных цыплят снижается вес тела, селезенки, наблюдается лейкопения. Введение пептида Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu приводит к повышению титра гемагглютининов и гемолизинов, числа антителобразующих клеток. У птиц, получавших предлагаемое средство, увеличивалось количество лейкоцитов, возрастал вес тела и селезенки. Максимальная активность пептида Тrр-Тrе-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu зарегистрирована в концентрации 0,1 мкг/кг веса тела. Аналогичный эффект достигнут введением тимогена. Максимальная активность последнего проявлялась лишь в концентрации 1 мкг/кг веса.

Таким образом, результаты экспериментального изучения заявляемого средства свидетельствуют о его высокой иммуностимулирующей активности, превосходящей таковую известного иммуностимулятора тимогена. По сравнению с тимогеном заявляемый пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu способен стимулировать иммунитет в 10 раз меньших дозах. Уменьшение дозировки иммуностимулирующего средства для достижения аналогичного эффекта дает возможность уменьшить риск побочного влияния.

Таким образом, установлено, что пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu обладает выраженным иммуностимулирующим действием и может найти применение в медицине для профилактики и лечения широкого круга иммунодефицитных состояний различной этиологии.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Goldstein A. L. , Guba A. , Zatz M. M. et al. Purification and biological activity of thymosin, a hormone of the thymus gland // Proc. Nat. Acad. USA 1972. Vol. 69. N 7. P. 1800-1803.

2. Арион В. Я. Т-активин и его иммунобиологические свойства: Автореф. дис. док. биол. наук. -М, 1990. -52 с.

3. Машковский М. Д. Лекарственные средства. М. : Медицина, 1988 - т. 2, гл. 9, с 168-175.

4. Кузник Б. И. , Степанов А. В. , Цыбиков Н. Н. и др. Влияние полипептидов из вилочковой железы, костного мозга и сумки Фабрициуса на иммуногенез и гемостаз у неонатально тимэктомированных и эмбрионально бурсэктомированных цыплят // Бюл. экспер. биологии и медицины. -1987. - 4. - С. 449-451.

5. Яковлев Г. М. , Хавинсон В. Х. , Морозов В. Г. и др. Сравнительное изучение биологической активности тималина и синтетического пептида тимуса // Тез. докл. науч. конф. "Биохимия медицине", Л. 1988, с. 217 - 218.

6. Хавинсон В. Х. , Синакевич Н. В. , Серый С. В. Тимоген. -СПб, 1991. -48 с.

7. Steward J. M. , Young J. D. Solid phase peptide synthesis, San Francisco, 1969.

8. Nekam К. , Fudenberg Н. Н. , Strelkanskas A. J. Identification of "activ" T-lymphocytes among effector cells in guinea pigs // Immunopharmacol. -1982-Vol. 5, 1. -P. 85-94.

9. Stadecker M. J. , Bishop G. , Wortis H. H. Rosette formation by guinea pig thymocytes and thymus derived lymphocytes with rabbit red blood cells // J. Immunol. -1973. Vol. 111, 6. -P. 1834-1837.

10. Ling N. R. Immunoglobulin as a differentiation and clonal marker // J. Immunol. Methods. -1983. - Vol. 65. - P. 1-25.

11. П. Колкер И. И. , Вишневская С. М. , Панова Ю. М. и др. Содержание Т- и В-лимфоцитов у больных с термическими ожогами // Клинич. медицина. -1985. - 7. -С. 87-93.

12. Белоцкий С. М. , Борисова Т. Г. , Снастина Т. И. и др. Характеристика фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов у обожженных // Иммунология. -1983. - 6. - С. 51-54.

13. Лимфоциты: Методы. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. -М. : Мир, 1990, 395 с.

14. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А. П. Тарасова. - М. : Медицина, 1987, 472 с.

Изобретение относится к медицине, а именно к новым пептидным средствам, обладающим иммуностимулирующей активностью, и направлено на расширение их арсенала и повышение биологической активности. Предлагается использовать новый синтетический пептид структурной формулы Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu в качестве средства с иммуностимулирующей активностью. По сравнению с прототипом пептид Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu активен в 10 раз меньших дозах. Средство может найти применение в медицине для профилактики и лечения широкого круга иммунодефицитных состояний различной этиологии. Технический результат - расширение арсенала средств для борьбы с иммунодефицитом. 6 табл.

Пептид формулы Trp-Tre-Ala-Glu-Glu-Arg-Gln-Leu, обладающий иммуностимулирующей активностью.