СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ХОЛЕРЫ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к области медицины, точнее к специфической профилактике инфекционных болезней, а именно холеры, методом пероральной вакцинации, и является усовершенствованием известного способа.

Описан способ выделения обезвреженного формальдегидом анатоксина и соматического О-антигена из культуральной жидкости штамма 569 B холерного вибриона серовара Инаба путем осаждения сульфатом аммония между 0,2-0,8 насыщения, что обеспечивает возможность включения в вакцинный препарат двух компонентов, ответственных за формирование антитоксического и антибактериального иммунитета к вибрионам серовара Инаба, повышению содержания О-антигена Инаба в рецептуре и увеличению выхода целевого продукта.

Вакцину изготавливают в виде таблеток с ацидорезистентным покрытием, что обеспечивает возможность орального применения препарата.

Недостатком известного способа является то, что полученная вакцина не может обеспечить защиту людей от заражения вибрионами двух сероваров Инаба и Огава, которые существуют в природе, так как в ней отсутствует О-антиген серовара Огава. Полноценная холерная вакцина по рекомендациям ВОЗ, сделанных на основании результатов неоднократных полевых испытаний (Бангладеш, Филиппины), должна включать антигены обоих сероваров, так как не подтверждена возможность создания перекрестного иммунитета между двумя сероварами.

Целью изобретения является повышение специфической активности и эффективности защиты от заражения штаммами Огавы оральной холерной вакцины включением в нее дополнительного компонента О-антигена серовара Огава.

Цель достигается тем, что к специфическим компонентам холерной химической вакцины (анатоксину и О-антигену Инаба), полученной из штампа 569B Инаба, добавляют О-антиген серовара Огава, что обеспечивает создание иммунитета также к штаммам серовара Огава.

Получение дополнительного компонента вакцины заключается в выделении О-антигена серовара Огава, которое проводят из культуральной жидкости, выдержанной в течение 20-30 дней при 10-12^oC в присутствии формалина (0,2-0,3%), что обеспечивает нативность структуры антигена в антисептических условиях и большой его выход из-за секреции антигена штаммами в среду и низкую его токсичность.

Очистку О-антигена Огава от балластных белков проводят легкодоступным, щадящим методом: осаждением сернокислым аммонием при 0,5 насыщения с последующим фракционированием между 0,3-0,4 насыщения, что обеспечивает сохранение структуры антигена и выход гомогенного препарата, содержащего 90% О-антигена Огава (табл. 1). Этот простой метод возможно было применить после обнаружения, что О-антиген Огава по молекулярной массе более чем в 10 раз отличается от всех других компонентов культуральной жидкости (фиг.1, где показана гель-фильтрация через сефарозу 4B культуральной жидкости штамма холерного вибриона серовара Огава. По оси ординат: содержание О-антигена, суммарного белка (сплошная кривая), протеиназы (Пр, в ПЕ/мл), нейраминидазы (НА, в НЕ/мл), фосфолипазы (Фф; в ЛЕ/мл); по оси абсцисс номер проб (фракций) и величина молекулярной массы).

Способ получения вакцины холерной химической таблетированной заключает в себе, во-первых, способ, описанный в авт. св. N 102735, использованный для изготовления первого компонента вакцины, и во-вторых, дополнительно, способ получения О-антигена холерного вибриона серовара Огава. Этот дополнительный способ заключается в следующем:
В качестве продуцента О-антигена Огава используют штаммы холерного вибриона Vibuo cholerae cholerae, Ogawa (например, NN 41, М41). Штампы серовара Огава должны быть типичными для S=форм по морфологическим культуральным, биохимическим и серологическим свойствам; должны обладать холерогенными, иммуногенными свойствами для лабораторных животных. Холерный вибрион выращивают при 37^oC в реакторе 250 л бульона из ферментативного перевара казеина (pH 8,0-8,1, 200 мг% аминного азота, Na₂HPO₄ - 0,05% NaCl 0,5%), или бульоне Хоттингера в условиях глубинного культивирования с подкормкой глюкозой и аммиаком. В стационарной фазе роста (10-12 ч выращивания), когда концентрация микробных тел, достигнув 80-110 млрд.м.т. в 1 мл, оставалась постоянной в течение 3 ч, выращивание прекращают добавлением 0,6% формалина. Бульонную культуру с формалином перемешивают 15 мин и выдерживают 14-18 ч, убитые формалином микробные тела отделяют в центрифуге СГО-100 при 15000 об/мин, а стерильную надосадочную жидкость, содержащую 0,2-0,3% формалина, выдерживают в течение 20-30 дней при 10-12^oC и pH 7,0±0,3 для детоксикации О-антигена. В случае падения величины pH добавляют щелочь (10-ный раствор NaOH). После этого приступают к выделению и очистке антигена из культуральной жидкости путем осаждения сульфатом аммония при 0,5 насыщения, добавляя 380 г соли на 1 л и оставляя на 18-20 ч при температуре 20±2^oC. (В случае отклонения от указанной температуры делают пересчет количества сульфата аммония с учетом его растворимости). После центрифугирования и диализа осадка в проточной водопроводной воде получают О-антигеносодержащую фракцию (обем около 10 л), имеющую pH 6,7-6,9 и содержащую 1,0±0,2% белка и с большей в 20-25 раз, чем исходный материал концентрацией О-антигена. Из этой фракции проводят повторное осаждение О-антигена сульфатом аммония между 0,3-0,4 насыщения, добавляя при 20±2^oC 228 г, а затем 76 г соли на 1 л первоначального объема. Смесь оставляют на 18-20 ч. После центрифугирования и диализа в проточной водопроводной воде препарат дробно стерилизуют (или фильтруют через бактериальные свечи) и проводят его лиофильное высушивание и контролируют качество второго компонента вакцины. Этот компонент должен иметь титр в РПГА с холерной О-сывороткой не ниже 1:100, а с типовой Огава не ниже 1:25.

Результаты проведенного исследования по выбору оптимального способа выделения дополнительного компонента О-антигена Огава представлены в табл. 1. Как видно, отличия между препаратами были обусловлены не только условиями фракционирования, но и экспозицией безмикробного центрифугата от момента его получения до осаждения фракций. Изучение последнего вопроса было необходимо, поскольку культуральная жидкость содержит, кроме О-антигена, большое количество экзоферментов, в том числе липаз, протеиназ и др. способных вызвать расщепление липополисахаридного комплекса антигена. В то же время известно, что токсичность и антигенность О-антигенов (эндотоксинов) находится в прямой зависимости от величины молекулярной массы их компонентов.

Как видно из табл. 1, фракция 6 (экспозиция 25±5 дн, 31-40% сульфата аммония) содержит наибольшее количество О-антигена (90% титр преципитации 1: 256), по химическому составу препарат соответствует О-антигенам, по данным (см. фиг. 2, где показаны ИК-спектроскопии, ИК-спектры О-антигенсодержащих фракций, выделенных их культуральной жидкости штамма серовара Огава).

1 фракция 1-8; 2- фракция И-30; 3 фракция V-30; 4 фракция 11-8. По оси абсцисс частота (в см^-1); по оси ординат поглощение (в).

Она является специфическим липополисахариднобелковым комплексом - О-антигеном холерного вибриона, она достаточно растворима, малотоксична (LD₅₀=9 мг), в высоком титре вызывает образование специфических антител (1:1020). При экспозиции в 8 дней из культуральной жидкости не удалось выделить аналогичную по эффективности фракцию. Так фракция 1 (экспозиция 8 дн, 20-30% сульфата аммония) была мало растворима, содержала меньше О-антигена (64% титр преципитации 1:128), более токсична (LD₅₀=4 мг) и вызывала менее активный синтез антител (титр 1:420).

Сухой О-антиген Огава добавляют к сухой специфической фракции Инаба, прибавляют таблеточный наполнитель (сахар, крахмал, тальк, стеарат кальция), делают таблетки и наносят ацидорезистентное покрытие. Одна таблетка вакцины массой 0,3 г содержит (в мг) 10-50 фракции Инаба (авт. св. N 102735), 5-10 О-антигена Огава, 140-185 сахара, 80 крахмала, 10 талька и 10 стеарата. В тесте активной защиты мышей (в основном по рекомендациям ВОЗ для холерных вакцин) величина ED₅₀ составляет менее 1/20000 таблетки к штаммам серовара Огава и Инаба, а по реакции преципитации в геле с холерной О-сывороткой активность О-антигена Огава составляет 0,001 (0,0005) часть таблетки. Выход препарата с одного реактора обеспечивает получение 1000-12500 таблеток.

Сравнительная характеристика двух вакцин приведена в табл. 2.

Как видно, добавление О-антигена Огава улучшило защитные свойства вакцины по ED₅₀ до 1/36000 вместо 1:18000, а титры вибриоцидных антител к серовару Огава возросли более чем в три раза.

В табл. 3 приведена характеристика экспериментально-производственных серий вакцины, изученных в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и включенных для испытаний на добровольцах. Как видно, серии достаточно стабильны.

Результаты хроматографического разделения компонентов культуральной жидкости штамма Огава, выдержанной 30 дн при 10^oC и 0,2% формалина, показали, что по молекулярной массе эти компоненты четко разделяются на две группы. О-антигеносодержащие фракции выходили вслед за голубыми декстраном (молекулярная масса 2•10⁶) с первым пиком (молекулярная масса 1•10⁶). Основное же количество белков имело молекулярную массу менее 100000. (Присутствие протеиназы в первых порциях элюата вызвано ее сорбцией на липополисахариде). Такой состав культурной жидкости был свойственен только штаммам серовара Огава.

Интерпретацию спектрограмм проводили на основе имеющихся в литературе сведений и данных химических анализов фракций. Как видно, ИК-спектры фракции 1-8, 6-30 почти идентичны и определенно отличаются от таковых фракций 2-8 и 5-30. Так область частот спектра от 700 см^-1 по 1400 см^-1 имеет ряд полос поглощения, большинство из которых следует, по-видимому, отнести к полисахаридной части комплексов. В спектрах препаратов 2-8 и 5-30 поглощение в этой области уменьшается по интенсивности. Полосы поглощения 1545 см^-1 и 1660 см^-1, характерные для белков и пептидов, отмечены во всех препаратах, но были более выражены во фракциях 2-8 и 5-30. Особо следует подчеркнуть отличия в содержании липидов: фракции 1-8 и 6-30 имели относительно более богатый ИК-спектр в этой области. Только у этих фракций в спектрах обнаружены полосы поглощения при 1730 см^-1, за счет колебания карбонильной группы с=о липидов, а полосы при 2860 см^-1 и 2930 см^-1, обусловленные симметричными колебаниями CH₂ -групп жирных кислот, были у них более выражены. Полоса поглощения при 1240 см^-1, характерная для нуклеиновых кислот, была слабо выражена.

Использование предлагаемого способа по сравнению с известным дает следующее основное преимущество возможность обогащения оральной вакцины Инаба О-антигеном серовара Огава для создания невосприимчивости к обоим сероварам V. cholerae. Способ позволяет проводить производственное получение антигена. Выращивание холерного вибриона проводят в реакторе емкостью 250 л методом глубинного культивирования, что дает большой выход растворимого О-антигена Огава. Выделение и очистку О-антигена проводят щадящим его нативную структуру способом из культуральной жидкости фракционированием сульфатом аммония. О-антиген Огава служит компонентом холерной химической таблетированной вакцины, с ацидорезистентным покрытием таблетки, что обеспечивает оральное применение препарата.

Использование: медицина, вакцинопрофилактика. Сущность изобретения: способ производственного получения О-антигена Огава, при котором проводят глубинное культивирование вибрионов в реакторе, обезвреживание, сепарирование микробных тел, выделение и очистку О-антигена из культуральной жидкости, диализ, лиофильное высушивание, добавление к компонентам оральной вакцины, таблетирование и покрытие ацидорезистентной оболочкой. О-антиген Огава получают из культуральной жидкости, выдержанной в течение 20-30 дн при 10-12^oC с 0,2-0,3% формалина, путем осаждения сульфатом аммония при 0,5 насыщении при pH 7,0±0,3 и фракционирование между 0,3-0,4 насыщения при pH 6,8±0,1 и концентрации белка 1,0±0,2% с последующей лиафилизацией и обогащением полученным антигеном Огава препарата. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

1. Способ производства вакцины для профилактики холеры, включающий культивирование холерного вибриона штамма 569В Инаба, его инактивацию, выделение и очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности и эффективности защиты от заражения штаммами Огава, в препарат дополнительно вводят О-антиген Огава, выделение и очистку которого проводят из культуральной жидкости типичного по свойствам штамма Vibrio cholerae Ogawa 41 или М41 осаждением сернокислым аммонием при 0,5 насыщения при pН 7,0±0,3 с последующим фракционированием между 0,3 0,4 насыщения при pН 6,8±0,1 и концентрацией белка 1,0±0,2%
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью снижения токсичности О-антигена Огава, культуральную жидкость, содержащую 0,2 0,3% формалина, выдерживают в течение 20 30 дней при 10 12^oC.