ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE 2414 КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА СЕРОВАРА ОГАВА - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ТОКСИНКОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара серовара Огава, эффективно продуцирующего основные протективные антигены - холерный токсин и токсинкорегулируемые пили адгезии, и может быть использовано в производстве для создания высокоэффективных химических холерных вакцин нового поколения, получение очищенных препаратов указанных антигенов, предназначенных для дальнейшего приготовления диагностических тест-систем, а также для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.

Известен штамм классического биовара V. cholerae КМ68 серовара Огава (авторское свидетельство СССР N 1456468 МКИ: C 12 N 1/20, 15/00, A 61 K 35/74//(C 12 N 1/20, C 12 R 1:63)), эффективно продуцирующий в среду выращивания холерный токсин (по данным GM₁ELISA35-45 мкг/мл), B-субъединица которого является основным иммуногеном.

Однако продукция токсинкорегулируемых пилей адгезии у этого штамма неизвестна.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм V. cholerae 569(В), относящийся к другой серогруппе - Инаба, который используется в зарубежной и отечественной медицине в качестве производного для получения вакцин (патент РФ N 2076734, A 61 K 39/00, 35/76; Ketley J. et all. Infect. Immun., 1990, v. l41, p. 893-899). Однако указанный штамм по данным GM₁ ELISA продуцирует лишь 8-10 мкг/мл холерного токсина (XT) в среду выращивания и небольшое количество токсинкорегулируемых пилей адгезии (ТКПА), выявляемых лишь высокочувствительным методом иммуноблота, но не в реакции самоагглютинации.

Для создания более эффективных химических вакцин, а также дешевых диагностических тест-систем необходимы штаммы холерного вибриона, с высокой продукцией холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии.

Задача изобретения - получение штамма холерного вибриона с высокой продукцией холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии.

Штамм V. cholerae 2414 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение этой среды. Штамм растет на простых средах и на средах с добавлением 5 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл канамицина. Прототроф.

Патогенные свойства - вирулентен для кроликов-сосунков в дозе 10⁵ м.т. /мл.

Физиологические свойства.

Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками О и Огава. Чувствителен к холерному диагностическому фагу C. Не ферментирует лактозу и арабинозу. До кислоты без газа ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу.

Высокий уровень продукции холерного токсина в среду выращивания и поверхностных токсинкорегулируемых пилей адгезии.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.

Штамм Vibrio cholerae 2414 серовара Огава классического биовара сконструирован путем коньюгативного введения в клетки природного штамма V. cholerae Дакка35 Огава, продуцирующего 10-13 мкг/мл холерного токсина, рекомбинантной плазмиды pCT 105 (Km^rTc^r), и последующего отбора клонов с высоким уровнем экспрессии токсинкорегулируемых пилей адгезии и холерного токсина, контролируемых, соответственно, хромосомными генами tcp и ctxAB. Одновременное увеличение продукции двух основных протективных антигенов (ХТ и ТКПА) обусловлено, видимо, повышением за счет плазмидно-хромосомных взаимоотношений активности гена toxR, который является общим регуляторным геном для структурных генов ctxAB и tcp. В результате был получен штамм, у которого уровень продукции холерного токсина возрос в 3,7 раза, а токсинкорегулируемых пилей адгезии - в 2-3 раза. Штамм V. cholerae 2414 серовара Огава депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб" под номером КМ197.

Пример,иллюстрирующий высокую продуктивность штамма.

Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae 2414 засевают на агар Хоттингера pH 7.6, содержащий 5 мкг/мл тетрациклина или 50 мкг/мл канамицина, и инкубируют 18 ч при 37^oC. Выросшую культуру рассевают на LB-агар для получения изолированных колоний и последующей проверки наличия токсинкорегулируемых пилей адгезии методом самоагглютинации культуры в бульоне [Chiang S. L. et al. Molecular Microbiology, 1995, v.l7, p.1133-1142]. Через 18 ч ресуспендируют одну выросшую колонию в 1 мл LB бульона и как инокулят вносят 7 мкл этой суспензии в 10 мл казаминового бульона, содержащего 3% казаминовых кислот и 0,5% дрожжевого экстракта с соответствующим антибиотиком, pH 7,6. Культуру выращивают 17-18 ч в шейкере при 30^oC. Степень агглютинации учитывают визуально. Штамм 2414 вызывает видимую самоагглютинацию всех бактериальных клеток в бульоне за счет синтеза значительного количества находящихся на поверхности токсинкорегулируемых пилей адгезии.

Бульон после самоагглютинации клеток используют для определения холерного токсина иммуноферментным методом [Svennerholm A.M. et al. J. Clin. Microbiol. , 1983, v. 17, p. 596-601]. Пробы инкубируют в течение 2 ч при 37^oC в лунках микроплат, блокируют неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 1 ч при 37^oC. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных коньюгатов, которые представляют собой меченные пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 мин после добавления субстрата - 0,03 % перекиси водорода в цитратном буфере pH 4,0 с 0,1 % ABTS [2,2 azino-di-(3-thylbenzthiazoline sulphonate)]. Чувствительность метода ELISA составляет в данной серии опытов 1 мкг/мл. Количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма рассчитывают в соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших микробных клеток. Штамм V. cholerae 2414 продуцирует 48-60 мкг/мл токсина.

Таким образом, новый штамм Vibrio cholerae 2414 обладает высоким уровнем продукции холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии, превышающим в 6-8 раз уровень продукции этих антигенов у известных производственных штаммов. Штамм может быть использован в производстве для получения более эффективной холерной вакцины холероген-анатоксин, содержащей новые протективные антигены, которая применяется для профилактики холеры; приготовления дешевых очищенных антигенов, используемых при разработке диагностических тест-систем для выявления природных штаммов с продукцией ХТ и ТКПА; для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммунгогенности холерного вибриона.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве для получения вакцин и диагностических тест-систем. Штамм бактерий Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава обладает высоким уровнем продукции (48-60 мкг/мл) холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, превышающим в 6-8 раз уровень продукции известных производственных штаммов.

Штамм Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава - продуцент холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии.