СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НАТИВНЫХ ХОЛЕРОГЕНА-АНАТОКСИНА И О-АНТИГЕНА VIBRIO CHOLERAE О1 КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА ШТАММА 569 В СЕРОВАРА ИНАБА Российский патент 2012 года по МПК A61K39/106 C12P21/00 A61P31/04 

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов, в частности к способам концентрирования холерогена-анатоксина и О-антигена Vibrio cholerae О1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба, и может быть использовано в практике производства вакцины оральной холерной бивалентной химической таблетированной.

Холероген-анатоксин и О-антиген V.cholerae О1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба, наряду с О-антигеном V.cholerae О1 классического биовара штамма М-41 серовара Огава, являются основными компонентами вакцины оральной холерной бивалентной химической таблетированной.

Данная вакцина в 2001 году Приказом Минздрава России (№229 от 27.06.2001 г.) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации у лиц, выезжающих в неблагополучные по холере страны, и населения приграничных районов России в случае возникновения неблагоприятной по холере обстановке на сопредельной территории.

Известен способ получения О-антигена холерного очищенного (патент России №2143280, кл. А61К 39/106, 1999 г.), сущность которого заключается в том, что из нативного О-антигена удаляют балластные белки осаждением их при рН 4,4±0,2, далее концентрируют и отделяют неспецифические примеси с молекулярной массой менее 100 кДа ультрафильтрацией, а неспецифические примеси с молекулярной массой менее 300 кДа отделяют колоночной хроматографией.

Однако выделенный по данному способу О-антиген может быть использован только для специфической индикации и диагностики холеры, и не используется как один из компонентов вакцины. Кроме того, в препарате, полученном по данному способу, отсутствует один из компонентов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, а именно холероген-анатоксин.

Известен способ получения очищенного холерного экзотоксина (В.В.Строганов и др. Применение метода ультрафильтрации на отечественных полупроницаемых мембранах марки УАМ для отделения соматического О-антигена от экзотоксина холерного вибриона - Пробл. особо опасных инф., 1978, вып.4, с.52-55) сущность которого заключается в том, что из нативной культуры, содержащей О-антиген и холерный экзотоксин, удаляют ультрафильтрацией О-антиген.

Полученный холерный экзотоксин используется только для получения антихолерогенной сыворотки, а не как компонент вакцины. Кроме того, в препарате, полученном по данному способу, отсутствует один из компонентов вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, а именно О-антиген.

Известен способ производства химической вакцины, состоящей из холерогена-анатоксина вместе с О-антигеном серовара Инаба, описанный в патенте России №2076734, А61К 39/00. Концентрирование заключается в последовательном фракционировании сульфатом аммония из культуральной жидкости штамма Инаба соматического О-антигена Инаба между 0,2 и 0,35 насыщения и анатоксина-холерогена между 0,35-0,8 насыщения.

Известным и наиболее близким к заявляемому решению является способ концентрирования холерогена-анатоксина и О-антигена, описанный в промышленном регламенте на производство вакцины холерной бивалентной химической таблетированной №ПР 01898109-05-06 (РосНИПЧИ "Микроб", г.Саратов, 2006 г.), сущность которого заключается в том, что нативные холероген-анатоксин и О-антиген полученные при глубинном культивировании V.cholerae О1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба и отделенные от биомассы центрифугированием (безмикробный центрифугат) концентрируют с использованием ряда последовательно сменяющихся операций: осаждение балластной фракции путем добавления 281±7,6 г сульфата аммония на 1 дм³ безмикробного центрифугата с последующим удалением этой фракции центрифугированием; осаждение холерогена-анатоксина и О-антигена из полученного центрифугата путем добавления 327±38 г сульфата аммония на 1 дм³ безмикробного центрифугата с последующим их концентрированием центрифугированием. Недостатком данного способа является существенные потери холерогена-анатоксина и О-антигена и применение значительного (608±45,7 г на 1 дм³ безмикробного центрифугата) количества сульфата аммония, затрачиваемого на осаждение.

Технический результат заключается в увеличении выхода получаемых продуктов - холерогена-анатоксина и О-антигена, с сохранением показателей качества препарата. Экономический эффект от использования изобретения заключается в снижении стоимости конечного продукта.

Для решения поставленной задачи введена дополнительная технологическая операция: предварительное концентрирование в 10 раз безмикробного центрифугата путем проточной фильтрации (кросс-флоу) через мембранные модули с номинальной отсечкой по молекулярной массой 50 кДа под давлением 0,23-0,25 МПа со средней удельной скоростью освобождения нативных холерогена-анатоксина и О-антигена от балластных примесей - 60-70 дм³/м²/ч, с последующим осаждением балластной фракции путем добавления 281±7,6 г сульфата аммония на 1 дм³ безмикробного центрифугата с последующим удалением этой фракции центрифугированием; осаждением холерогена-анатоксина и О-антигена из полученного центрифугата путем добавления 327±38 г сульфата аммония на 1 дм³ безмикробного центрифугата и концентрированием центрифугированием. Сравнение существенных признаков заявляемого способа получения концентрированных холерогена-анатоксина и О-антигена показывают, что общим для них является процесс отделения балластных примесей и концентрирование холерогена-анатоксина и О-антигена.

Существенным отличительным признаком предлагаемого способа является введение дополнительной технологической операции - отделения балластных примесей через мембранные фильтры с номинальной отсечкой по молекулярной массой 50 кДа, что позволяет увеличить выход конечного продукта и уменьшить его стоимость за счет снижения количества безмикробного центрифугата, подвергаемого осаждению сульфатом аммония.

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующим примером.

Пример. Получение концентрированных холерогена-анатоксина и О-антигена V.cholerae О1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба с увеличением выхода получаемого продукта и уменьшением его стоимости, с сохранением показателей качества препарата.

Для работы использовали нативные холероген-анатоксин и О-антиген V.cholerae О1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба, полученные способом глубинного культивирования и отделенные от биомассы центрифугированием согласно регламента производства №ПР 01898109-05-06. Количество безмикробного центрифугата штамма 569 В V.cholerae О1 классического биовара серовара Инаба для получения холерогена-анатоксина и О-антигена по способу-прототипу и заявляемому способу составляло по 10,0 дм³. Для предварительного концентрирования нативных холерогена-анатоксина и О-антигена использовали мембранные модули с номинальной отсечкой по молекулярной массе 50 кДа.

Концентрированные холероген-анатоксин и О-антиген получали путем рециркуляции через систему (установка с кассетным модулем) с отводом фильтрата в отдельную емкость, с последующим осаждением балластной фракции путем добавления 281±7,6 г сульфата аммония на 1 дм³ безмикробного центрифугата с последующим удалением этой фракции центрифугированием; осаждением холерогена-анатоксина и О-антигена из полученного центрифугата путем добавления 327±38 г сульфата аммония на 1 дм³ безмикробного центрифугата и концентрированием центрифугированием. Для ведения процесса экспериментально выбрали технологические параметры, которые представлены в табл.1.

Из приведенных в таблице 1 данных следует, что экспериментально подобранные параметры позволяют при значениях давления 0,23-0,25 МПа добиться оптимальной средней удельной скорости освобождения нативных холерогена-анатоксина и О-антигена от балластных примесей - 60-70 дм³/м²/ч. Коэффициент кратности концентрирования фильтруемого материала по объему равен 10, что позволяет уменьшить количество сульфата аммония в 10 раз в предлагаемом способе. В рассматриваемом примере количество сульфата аммония, затраченного на осаждение по способу-прототипу составило 6080 г, а по заявляемому способу - 608 г. Проведенный расчет стоимости расходных материалов при получения серии холерогена-анатоксина и О-антигена из 10,0 дм³ безмикробного центрифугата с использованием способа-прототипа и заявляемого способа, приведенный в таблице 2, показывает, что экономический эффект при заявляемом способе составляет 273,78 рублей (в ценах 2003 г.).

Характеристики препаратов, полученных с использованием способа-прототипа и заявляемого способа, приведены в таблице 3.

Согласно полученным данным выход получаемого продукта (холероген-анатоксина и О-антигена) при использовании заявляемого способа увеличивается в 1,2 раза. Кроме того, данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что значения показателей, характеризующих препараты, не отличаются друг от друга, что свидетельствует о сохранении показателей качества препарата, полученного с использованием заявляемого способа.

Таблица 1 Способ концентрирования нативных холерогена-анатоксина и О-антигена Давление, МПа Скорость освобождения нативных холерогена-анатоксина и О-антигена от балластных примесей, дм³/м²/ч 0,14-0,16 20-30 0,2-0,22 40-50 0,23-0,25 60-70 0,26-0,28 40-50

Таблица 2 Способ концентрирования нативных холерогена-анатоксина и О-антигена Перечень расходных материалов Количество на серию Стоимость за единицу, рублей Стоимость за серию, рублей Экономический эффект, рублей по способу-прототипу по заявляемому способу по способу-прототипу по заявляемому способу Сульфат аммония, кг 6,08 0,608 50,0 304,0 30,4 Электроэнергия, кВт/час 3172,6 3172,6 1,96 7603,44 7603,44 Пар насыщенный, кг 320 320 0,67 214,4 214,4 Вода хозяйственная - питьевая, м³ 16,52 18,32 1,50 24,66 27,48 Воздух сжатый, м³ 4,4 4,4 0,98 4,30 4,30 Итого: 8150,8 7877,02 273,78

Таблица 3 Наименование показателя Значение показателя качества препарата полученного по способу-прототипу полученного по заявляемому способу Специфическая безвредность безвредны Специфическая активность холерогена-анатоксина, единиц связывания анатоксина 6000 6000 Содержание О-антигена, обратный показатель титра в реакции непрямой агллютинации с «О1»-сывороткой 256 256 Количество продукта, г 2,5 3,0

Способ по изобретению предусматривает предварительное концентрирование нативных холерогена-анатоксина и О-антигена, полученных при глубинном культивировании холерного вибриона штамма серовара 569 В Инаба и отделенных от биомассы центрифугированием, которое осуществляют на пористых мембранах в режиме проточной (кросс-флоу) фильтрации. Концентрирование проводят через мембраны с номинальной отсечкой по молекулярной массе 50 кДа в режиме проточной (кросс-флоу) фильтрации с давлением 0,23-0,25 МПа, средней удельной скоростью освобождения нативных холерогена-анатоксина и О-антигена от балластных примесей - 60-70 дм³/м²/ч с коэффициентом кратности концентрирования фильтруемого материала по объему, равным 10. Далее балластные фракции двукратно осаждают сульфатом аммония. Использование способа позволяет повысить выход холероген-анатоксина и О-антигена в 1,2 раза и уменьшить количество используемого для осаждения балластных фракций сульфата аммония в 10 раз. 3 табл.

Способ концентрирования нативных холерогена-анатоксина и О-антигена Vibrio cholerae O1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба в производстве вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, включающий последовательное двукратное осаждение сначала балластной фракции и затем холерогена-анатоксина и О-антигена сульфатом аммония с последующим центрифугированием, отличающийся тем, что нативные холероген-анатоксин и О-антиген, полученные при глубинном культивировании V.cholerae O1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба и отделенные от биомассы центрифугированием, предварительно концентрируют в 10 раз через мембраны с номинальной отсечкой по молекулярной массе 50 кДа в режиме проточной (кросс-флоу) фильтрации с давлением 0,23-0,25 МПа, средней удельной скоростью освобождения нативных холерогена-анатоксина и О-антигена от балластных примесей - 60-70 дм³/м²/ч.