СРЕДСТВО, ПОВЫШАЮЩЕЕ УСТОЙЧИВОСТЬ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР К ГРИБНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1997 года по МПК A01N37/06 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и касается защиты культурных растений от биологических повреждений с помощью веществ, повышающих устойчивость растений к фитопатогенам.

Проблема защиты растений возникла, видимо, одновременно с зарождением земледелия направленного выращивания сельскохозяйственных культур для удовлетворения человеческих потребностей и до настоящего времени совершенно не утратила актуальности.

Наиболее широко распространенный способ защиты растений состоит в периодической обработке посевов инсектицидами, фунгицидами и другими подобными агентами химической или биологической природы, вызывающими гибель вредителей и возбудителей болезней или подавляющих их развитие.

Подобная обработка должна производиться неоднократно, эффективность ее зависит от погодных условий, фазы развития вредителя или фитопатогена и от других обстоятельств.

Химические агенты, используемые для борьбы с болезнями и вредителями растений, не обладают, как правило, избирательностью по отношению к конкретному сельскохозяйственному вредителю и могут разрушать природные биогеоценозы, вызывая, например, гибель полезных видов.

Известен принцип защиты культурных растений от болезней, сводящийся к получению отдельных сортов растений, устойчивых к тем или иным возбудителям болезни. Устойчивые сорта получают или в результате селекционной работы, или за счет методов генетической инженерии /1/.

Однако практическая реализация этого принципа встречает затруднения и требует значительной творческой работы. Приходится учитывать и то обстоятельство, что придать таким путем устойчивость к конкретным заболеваниям можно отдельным наиболее ценным сортам, в то время как на практике используются десятки районированных сортов культурных растений и создать гибридные формы для всех них просто невозможно.

Кроме того, вновь созданные сорта, устойчивость которых основывается на наличии единичных генов, быстро начинают поражаться болезнями в силу высоких адаптационных возможностей патогенов.

Существует и еще один подход к повышению биологической устойчивости растений к повреждающим факторам биологической природы стимулирование у растений собственных защитных механизмов.

Были предприняты некоторые успешные попытки повышения устойчивости растений за счет иммунизации предварительной обработки растительных тканей несовместимыми расами патогенов или их ослабленными культурами /2/.

Главное ограничение метода реальная опасность возникновения эпифитотий и сомнительная экономическая целесообразность непосредственной полевой обработки сельскохозяйственных культур.

Гораздо более перспективным направлением оказалась иммунизация растений не живыми биологическими объектами, а продуктами их метаболизма.

Метаболиты фитопатогенов, индуцирующие у растений механизмы защиты от биологических повреждений, с 70-х годов стали называться индукторами или элиситорами.

Попытки иммунизации растений культуральными фильтратами или вытяжками из фитопатогенов предпринимались давно, но однозначно положительных и достоверных результатов получено не было.

Было установлено, однако, что липогликопротеидный комплекс, выделенный из мицелия возбудителя фитофтороза Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, содержащий 60% липидов, 35% углеводов и 5% веществ, дающих положительную пробу по Лоури, проявляет свойства биогенного индуктора защитных реакций растений и в малых концентрациях вдвое повышает устойчивость картофеля, сахарной свеклы и томатов к целому ряду болезней.

В ходе дальнейших исследований установили, что биологически активные вещества липогликопротеидного комплекса с исковыми свойствами локализованы в его липидной фракции.

Параллельно выделили элиситоры углеводной природы, идентифицированные как глюканы клеточной стенки возбудителя фитофтореза, имеющие бета-1-3-связи в основной цепи и бета-1-6-связи в разветвленных цепях.

Было обнаружено в то же время, что суммарная липидная фракция липогликопротеидного комплекса сохраняет элиситорные способности полного комплекса.

Более подробное излучение липидной фракции позволило заключить, что индукторами, повышающими устойчивость растений к биологическим повреждениям, являются такие ненасыщенные жирные С₂₀ кислоты с несколькими двойными связями (алкеновые кислоты ряда C₂₀), как арахидоновая (эйкозатетраеновая), эйкозапентаеновая и эйкозатриеновая, а в некоторой степени и алкеновые кислоты C₁₈ ряда линолевая и линоленовая, причем последние три обладали значительно меньшей активностью (примерно в 10 30 раз).

Способность повышать устойчивость растений к биоповреждениям была обнаружена у некоторых продуктов окисления арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот простгландинов и тромбоксанов.

Однако круг потенциальных источников элиситоров не ограничивается метаболитами возбудителя фитофтороза, и элиситоры были выявлены среди метаболитов многих грибов, в частности, Fusarium culmorum; дрожжей, например, Saccharomuces cerevisiae; некоторых бактерий, таких как Pseudomonas solanacearum.

С точки зрения химической структуры известные элиситоры могут принадлежать к классам полисахаридов (глюканы, хитозан), полипептидов, гликопротеинов, липидов.

Упомянутыми классами соединений исчерпывается круг известных элиситоров, стимулирующих защитные функции растений, причем ассортимент идентифицированных и подробно изученных элиситоров довольно ограничен.

Очевидным является то, что расширение номенклатуры веществ, повышающих биологическую устойчивость растений, представляет не только теоретический, но и значительный практический интерес, в частности, и потому, что можно предполагать появление различных механизмов действия со стороны соединений, отличающихся химической структурой.

Цель изобретения изыскание новых соединений, обладающих способностью повышать биологическую устойчивость растений к биоповреждениям.

Исследованиями заявителя впервые показано, что алкеновые кислоты C₂₀ ряда обладают способностью повышать устойчивость растений к биоповреждениям, в особенности вызываемыми фитопатогенными микроорганизмами.

Одним из важнейших изученных механизмов возникновения индуцированной устойчивости инициация синтеза специфических антибиотических веществ - фитоалексинов. Корреляция между этими явлениями строго доказана, и индуцирующие синтез фитоалексинов вещества с высокой степенью вероятности рассматриваются как потенциальные индукторы приобретенного растениями иммунитета.

Экспериментальным путем заявитель впервые показал, что алкеновые кислоты C₂₂ ряда способны индуцировать синтез ришитина основного фитоалексина картофеля, и сведения об их сравнительном индуцирующем эффекте представлены в таблице 1.

Хотя индуцирующая активность таких алкеновых кислот ряда C₂₀, как эйкозатетраеновая (арахидоновая) и эйкозапентаеновая, выше, кислоты ряда C₂₂ ( докозатетраеновая, докозапентаеновая и докозагексаеновая) показали активность, превышающую активность алкеновых кислот ряда C₁₈, в частности, линоленовой и линолевой кислот.

Способность стимулировать синтез фитоалексинов связывается обычно с индуцированием локальной устойчивости растительной ткани к биологическому повреждению.

Под локальной устойчивостью понимается способность непосредственно иммунизированной ткани и ее ближайшего окружения противостоять атаке фитопатогена.

Для исследования локальной устойчивости растительной ткани были приготовлены диски, вырезанные из внутренней флоэмы предварительно промытых и высушенных клубней картофеля. На верхнюю поверхность диска равномерно наносили 0,05 мл раствора исследуемого вещества, а через 2 3 часа суспензию зооспор совместимой или несовместимой с сортом картофеля расы возбудителя фитофтороза. Инфицирование осуществляли 0,05 мл суспензии зооспор с концентрацией 10 спор/мл. Учет результатов проводили через 72 часа инкубации инфицированных дисков во влажной камере.

О степени поражения растительной ткани несовместимой расой фитопатогена судили по количеству клеток, некротизировавшихся в ответ на инфицирование: чем меньше клеток некротизировалось фитопатогеном, тем более высок уровень приобретенного иммунитета.

О степени поражения растительной ткани совместимой расой судили по количеству клеточных рядов в каждом диске, в которые проникли гифы патогенного гриба: чем меньше рядов поражено, тем более высок уровень приобретенного иммунитета.

Сравнительная эффективность известных элиситоров алкеновых кислот C₂₀ ряда и предлагаемых стимуляторов иммунитета у растений алкеновых кислот C₂₂ ряда приводится в таблице 2.

Видно, что по сравнению с алкеновой кислотой ряда C₂₀ (арахидоновой кислотой) кислоты ряда C₂₂ (докозапентаеновая и докозагексаеновая) проявляют несколько более низкую активность во всем диапазоне исследованных концентраций.

Известно, однако, что элиситоры стимулируют не только локальную, но и системную устойчивость растительной ткани.

Под системной устойчивостью понимается способность ткани, непосредственно не контактировавшей с иммуногеном и удаленной от места иммунизации, противостоять атаке фитопатогена. Системная устойчивость клубней картофеля развивается во времени (примерно через 7-10 суток) и длительно сохраняется.

Для исследования системной устойчивости промытые и высушенные клубни картофеля были обработаны растворами исследуемых веществ, и через 10 суток из внутренней флоэмы были вырезаны цилиндрики, проходящие через весь клубень. Цилиндрики были разрезаны на несколько параллельных дисков, верхняя поверхность каждого диска инфицировалась фитопатогеном, и все диски инкубировались в течение 72 часов во влажной камере. Оценка полученных результатов проводилась, как описано выше.

Развитие системной устойчивости не связано с синтезом фитоалексинов, поскольку индукция системной устойчивости имела место при концентрациях иммуногенов, не вызывающих синтеза фитоалексинов.

Способность алкеновых кислот ряда C₂₂ индуцировать системную устойчивость растительных тканей к биоповреждениям демонстрируется данными таблицы 3.

Отчетливо видно, что алкеновые кислоты ряда C₂₂ по способности стимулировать системную устойчивость не уступают элиситорам из ряда C₂₀ алкеновых кислот.

Таким образом, представленные материалы позволяют заключить, что алкеновые кислоты ряда C₂₂ индуцируют синтез фитоалексинов и сообщают растительной ткани локальную устойчивость к возбудителю фитофтороза, хотя и в меньшей степени, чем наиболее активные аналогичные кислоты ряда C₂₀; алкеновые кислоты ряда C₂₂ индуцируют системную устойчивость растительных тканей к возбудителю фитофтороза примерно в той же степени, что и аналогичные кислоты ряда C₂₀.

Иными словами, алкеновые кислоты ряда C₂₂ обладают способностью стимулировать устойчивость растений к биоповреждениям, но по характеру действия отличаются от наиболее близких к ним по химической структуре и биологическому действию алкеновых кислот ряда C₂₀, являющихся ближайшими аналогами предложенных соединений.

Отличия в характере биологического действия, видимо, первично связаны с особенностями их химической структуры и это сопоставление проведено в таблице 4.

Сами по себе алкеновые кислоты ряда C₂₂ известны, но практического применения пока не нашли. Сведения об их способности стимулировать биоустойчивость растений в доступной патентной и научно технической литературе не обнаружены.

Заявителем были исследованы наиболее доступные представители алкеновых кислот C₂₂ ряда, выделенные из липидов животного происхождения.

Присутствия исследованных алкеновых кислот в липидных фракциях фитопатогенных микроорганизмов однозначно не доказано, хотя такая возможность совсем не исключается, тем более, что сведения о наличии в липидах возбудителя фитофтороза некоторых алкеновых кислот (в частности, эруковой кислоты C_22:1) имеются.

На этом основании причислять в настоящее время докозапентаеновую и докозагексаеновую кислоты к классу элиситоров преждевременно, но можно уверенно констатировать, что упомянутые кислоты проявляют явный и выраженный элиситорный эффект.

Выводы о стимулировании алкеновыми кислотами ряда C₂₂ устойчивости растений к фитопатогенам, сделанные на основе представленных материалов, должны быть признаны корректными, принимая во внимание следующие известные научные факты об общих свойствах элиситоров, обобщенные в обзорной работе по этой проблеме:
элиситоры являются веществами неспецифического действия;
элиситоры, обладающие сходной биологической активностью, могут быть выделены из мицелия всех рас возбудителя фитофтороза независимо от наличия у них генов вирулентности;
различными элиситорами возбудителя фитофтороза удавалось успешно иммунизировать сорта картофеля как обладающие R-генами фитоустойчивости, так и универсально-восприимчивые к этому патогену;
элиситоры возбудителя фитофтороза способны индуцировать устойчивость картофеля не только к возбудителю фитофтороза, но и к ряду других фитопатогенов грибного, бактериального и вирусного происхождения;
с помощью элиситора возбудителя фитофтороза можно успешно иммунизировать не только картофель, но и другие растения, например, томаты и сахарную свеклу;
-элиситоры возбудителя фитофтороза повышают биоустойчивость растительных тканей не только к повреждению микроорганизмами, но и, например, к механическим повреждениям.

Особо можно выделить тот факт, что многолетние полевые испытания элиситоров показали абсолютное совпадение результатов, полученных в лабораторных условиях на растительных тканях, и результатов, полученных в полевых полупроизводственных условиях на вегетирующих растениях.

Изложенное свидетельствует о том, что современный уровень знаний позволяет отнести алкеновые кислоты C₂₂ ряда, индуцирующие механизмы иммунной защиты растительных тканей, к веществам, повышающим устойчивость растений к фитопатогенам.

Приводимые ниже примеры подтверждают эффективность предложения.

В приводимых примерах оценка на устойчивость вегетирующих растений проведена по 9-бальной шкале СЭВ, где 1 балл соответствует максимальному поражению, а значение 9 баллов его отсутствию (Методические указания по оценке селекционного материала картофеля на устойчивость к фитофторозу, ризоктониозу, бактериальным болезням и механическим поранениям. М. 1980, стр. 25-25).

Изменения в устойчивости растений на искусственном инфекционном фоне выявляли с помощью многократных заражений и последующего вычисления индекса поражения.

Пример 1. Клубни картофеля сорта Белорусский ранний были промыты, высушены и разделены на две части по 20 клубней в каждой. Одну часть клубней обработали раствором докозапентаеновой кислоты в концентрации 0,03 мкг/мл (10 М), вторую часть обработали водой (контроль), и все клубни высушили. Все клубни посадили в лотки в условиях теплицы. После периода цветения изолированные листья всех растений инфицировали суспензией зооспор возбудителя фитофтороза с плотностью 5•10 спор/мл. Результаты заражения учитывали через 10 дней. В опыте: индекс поражения листовой поверхности 4, балл устойчивости 7. В контроле: индекс поражения листовой поверхности 10, балл устойчивости 3.

Пример 2. Клубни картофеля сорта Огонек были промыты и высушены. Отобрали 40 клубней и разделили их на две части по 20 клубней. Одну часть клубней обработали раствором докозагексаеновой кислоты в концентрации 0,03 мкг/мл (10 М), а вторую часть обработали водой (контроль). Все клубни высадили в вазоны в условиях теплицы. После развития растений до стадии 5 листа все растения инфицировали культурой возбудителем макроспориоза. Результаты учитывали через 10 дней. В опыте: индекс поражения листовой поверхности 4,9, балл устойчивости 7,4. В контроле: индекс поражения листовой поверхности 9, балл устойчивости 3.

Пример 3. Растения томатов сорта Карлсон были высажены в горшки в условиях теплицы. После развития растений до стадии 5 листа половину растений подвергали опрыскиванию раствором, содержащим смесь докозапентаеновой докозагексаеновой кислот в суммарной концентрации 0,04 мкг/мл. После начала цветения листья растений инфицировали возбудителем фитофтороза. Результаты учитывали через 10 дней. В опыте: индекс поражения листовой поверхности 3,4, балл устойчивости 8,1. В контроле: индекс поражения листовой поверхности - 10, балл устойчивости 3,1.

Таким образом, все вышеизложенное свидетельствует о том, что алкеновые кислоты C₂₂ ряда обладают элиситорными свойствами и являются средствами, представляющими потенциальный интерес для сельскохозяйственного производства как вещества, повышающие устойчивость культурных растений к фитопатогенам.

Сельское хозяйство и защита культурных растений от болезней. Предложено использовать в качестве средств, повышающих устойчивость растений к фитопатогенам, алкеновые кислоты C₂₂-ряда, содержащие 4 - 6 двойных связей, в концентрации 10^-8-10^-7 М. 4 табл.

Применение С(22)-тетра-, пента- или гексаеновой кислоты в качестве средства, повышающего устойчивость сельскохозяйственных культур к грибной инфекции.