ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК A61K38/02 A61K31/73 

Изобретение касается фармацевтических композиций, обладающих ранозаживляющим действием, включающих по меньшей мере один полипептид, являющийся фактором роста фибробластов /ФРФ/, и водорастворимый полисахарид.

Факторы роста фибробластов /Fibroblast growth Factors, (ФРФ), относящиеся к классу аутогенных пептидов-регуляторов роста, первоначально были обнаружены в качестве веществ в мозге и гипофизе. После их выделения была установлена их способность стимулировать рост фибробластов, ФРФ известны как эффективные факторы образования сосудов, которые ответственны за неоваскуляризацию при лечении ран. Более близкие детали ФРФ, включая продукты их преобразования, их выделение или получение, структуру и биологическую активность, ее механизм и соответствующие области их медицинского применения можно найти в многочисленной специальной литературе. Достаточно полный обзор представлен, например, A. Baird и P.Bohler "Факторы роста фибробластов в работе "Факторы роста пептидов и их рецепторы 1 /издатели М.Б. Спорн и А.Б.Робарто/, издательство Шпрингер, Берлин, Гельдельберг, Нью-Йорк, 1990.

В качестве подходящих регуляторов роста в соответствии с изобретением следует рассматривать не только "классические" ФРФ, такие как кислый и основной фактор роста фибробластов ФРФ, но и все пептиды, обладающие в основном биологической активностью ФРФ.

К узкому кругу ФРФ причисляются естественные ФРФ, в частности, бычьего и человеческого происхождения, а также полученный из них рекомбинантный фактор роста фибробластов. Предпочтение отдается, в частности, рекомбинантно полученному из человека, аФРФ м бФРФ. См. например, следующие патентные публикации EP 0 228 449, EP 0 248 819, УЗ 259 953 и EP 0275 204. К дальнейшему кругу ФРФ относятся также мутеины, которые отличаются от аФРФ и бФРФ по числу и последовательности аминокислот, не изменяясь по основному признаку эффективности. Кроме того, это же понятие объединяет, например, различные формы бФРБ, отличающиеся по своей длине. Они содержат 146, 153, 154 или соответственно 157 аминокислотных радикалов. Другой круг ФРФ включает также родственные пептиды, частично с очень различными последовательностями аминокислот, которые, однако, обладают биологической активностью в отношении ФРФ. См. например, следующие патентные публикации: EP 0 148 922, EP 0 226 181, EP 0281 822, EP 288 307, EP 0 391052, EP 0 326 907 и 0 80-12645. Указанные пептиды с целью упрощения именуются "пептиды с ФРФ-активностью".

К ФРФ (согласно изобретению) относятся также производные этих пептидов, получаемые с применением стабилизируемых и/или повышающих активность агентов. Это в частности, стабилизированные в отношении кислот формы аФРФ и бФРФ, содержащие в качестве устойчивых агентов, например, глюкозаминглюканы, такие как гепарин, компоненты гепарина, гепаринсульфат или глюкансульфат, например, декстрансульфат и циклодакстринсульфат. ФРФ- производные такого типа описаны, например, в EP 251 806, EP 267 015, EP 312 208, EP 345 660, EP 406 856, EP 408 146, WO 89 12 464, WO-01041 и WO 90-03797.

Наиболее предпочтительными согласно изобретению является ФРФ, взятые от человека, их мутеины, особенно б-формы бФРФ, особенно предпочтительно также применение рекомбинантно полученные от человека, вФРФ, описанной в EP 0248 819.

Общей особенностью пептидов с ФРФ-активностью является их способность давать специфические связи с рецепторами ФРФ оболочки клетки и там проявлять свою биологическую активность, например, при лечении ран. Однако эти пептиды связаны неспецифично. Это связывание приводит к тому, что, например, бФРФ сам по себе после инъекции обычно уже невозможно обнаружить в сыворотке. Например, бФРФ как основной протеин /IP 9.8/ связывается с анионными макромолекулами /например, нуклеиновой кислотой и кислыми компонентами экстрацеллюлярных матриц /ЕМ/, таких как гепаринсульфат, /см. Москаталли и сотр. Взаимодействие основных ФР фибропластов с внеклеточной матрицей и рецепторами". Доклад на конференции "Семейство регуляторов роста фибропластов", состоявшейся в Нью-йоркской Академии наук, 1991 г./ Эти свойства РРФ описаны в литературе и используются для выделения РРФ. Очистка а/- и б/-форм РРФ производится методом хроматографии на носителях, содержащих связанный гепарин.

Неспецифическое связывание пептидов, обладающих ФРФ-активностью, уменьшают количество ФРФ-компонентов, которое может быть достигнуто специфическим рецептором в клетке. В частности, при старых /хронических ранах или ожоговых ранах, когда имеет место наличие больших количеством некротического материала, происходит неспецифическое связывание большой и одновременно неизвестной части ФРФ вследствие абсорбции. В результате становится невозможным точное дозирование, действующего количества пептидов, обладающих ФРФ-активностью. Появляются необходимость в передозировке активного вещества. Поэтому дозировка также недопустима, поскольку неизвестно, как много неспецифических мест связывания имеет в той или иной ране.

Попытки стабилизировать б-ФРФ, снизить его неспецифическое связывание и повысить его сродство со специфическим рецептором, до сих пор состояла в том, чтобы скомбинировать бФРФ с гепарином или другими сульфатированными гликанами /например, декстрансульфатом/ или сукралфатом. Обычно же испытывают бФРФ без таких добавок. Добавляются лишь вспомогательные вещества, используемые для повышения устойчивости и улучшения наносимости.

Недостатком применения чистого бФРФ и значительного количества указанных комбинаций является то, что постоянно существует необходимость в передозировке активного вещества и ненадежности дозировки, поскольку неизвестно, сколько специфических мест связывания существует в ране в данный момент.

Поэтому в основе изобретения лежит задача создать такую композицию активного вещества, биологическая активность которой не оказала бы влияния на неспецифическое связывание пептидов, обладающих ФРФ-активностью.

Для улучшения дозирования путем контроля диффузии в Европейском патенте EP N 312 208 было предложено использовать вместе с фактором роста предпочтительно эпидермальным фактором роста /ЭФР/ гелеобразующее средство. Однако эта мера не смогла решить ключевой проблемы дозировки факторов роста, обусловленной неспецифическим переменным связыванием.

Было установлено, что эта проблема может быть решена, если при использовании пептидов с ФРФ-активностью дополнительно использовать, по меньшей мере, один катионный полиэлектролит. Неожиданно оказалось, что катионные полиэлектролиты способны блокировать неспецифические места связывания, например вЕСМ, вследствие чего пептиды с РРФ-активностью могут достигать специфических рецепторов в оболочке клетки, где и проявляется биологическая активность РРФ.

В соответствии с изобретением можно использовать большое количество известных катионных полиэлектролитов. Общим для них является то, что они способны в физиологических условиях образовывать необратимые комплексы с неспецифическими связывающими ФРФ структурами клетки. В качестве примера подходящих катионных полиэлектролитов следует назвать полиамиды или полиимиды, а также их четвертичные производные. Далее для этой цели подходят также полигуанидины, а также полипептиды, содержащие основные аминокислоты, например, полилизин, полиорнитин, полимергинин. Эти полипептиды могут также содержать смеси нескольких аминокислот. Сами аминокислоты могут применяться в рацемической или в единой D- или L-формах в представляемых изобретением полипептидах. Наиболее предпочтительными согласно изобретению являются также полисахариды с основными группировками. Особенно предпочтительным является применение хитозанов и их производных, например, N-карбокси-бутил-хитозана или метил-пирролидон-хитозана, поскольку они являются биоразрушаемыми и продукты их распада идентичны компонентам обычного обмена веществ /глюкозамин и N-ацетил-глюкозами/.

В соответствии с изобретением, катионные полиэлектролиты могут быть использованы в виде свободных оснований, а также в виде солей, совместимых физиологически с органическими и неорганическими кислотами. Физиологически совместимыми органическими кислотами являются, например, глутаминовая, уксусная и молочная кислоты. Соляная кислота может быть указана в качестве примера физиологически совместимых неорганических кислот. Другие физиологически совместимые соли известны среди лекарств растительного происхождения.

Эти вещества наносятся в избытке по отношению к пептидам с ФРФ-активностью наряду с другими. Возможно также предварительная аппликация катионных полиэлектролитов. Это обеспечивает беспрепятственное диффундирование ФРФ-препарата к специфическому рецептору и связывание его там. Однако, в рамках процесса, согласно изобретению, допустимо дополнительно наносить катионные полиэлектролиты, чтобы "вытеснять" ФРФ из неспецифических мест связывания. Преимуществом настоящего способа в любом случае является возможность сравнительно низкой дозировки пептидов с ФРФ-активностью, вследствие чего соответственно повышается и терапевтический индекс. Кроме того достигается достаточно надежное применение, так как даже при сильно некротических ранах ФРФ может доходить до места назначения. В таких случаях рекомендуется многоразовая аппликация ФРФ.

Поэтому предметом настоящего изобретения являются композиции, содержащие, по меньшей мере, один полипептид, обладающий ФРФ-активностью, и по меньшей мере, один катионный полиэлектролит, например, водорасторимый полисахарид, выбранный из группы, включающий хитозан и его производные.

Представляемые изобретением композиции существуют преимущественно в виде водных растворов, содержащих наряду с, по меньшей мере, одним полипептидом с ФРФ-активностью и, по меньшей мере, одним водорастворимым полисахаридом обычные добавки, например, буферные вещества или соли для регулирования осмотического давления, а также наполнители. В этих растворах концентрация полипептидов с ФРФ-активностью составляет от 0,1 до 500 мкг/мл, предпочтительно от 0,5 до 300 мкг/мл, концентрация катионных полиэлектролитов 1 300 мг/мл, предпочтительно 0, 200 мг/мл. Эти растворы могут быть преобразованы в гидрогели путем добавления гелеобразователей по известным методикам. Растворы иногда при добавлении наполнителей могут быть высушены или лиофилизированы в пленки, порошки, гранулы или волокна. Полученные таким образом волокна могут быть в дальнейшем преобразованы в ткани или сетчатые образования. Можно также абсорбировать эти растворы на марлю или специальную пленку для покрытия ран с последующим просушиванием. Из высушенных готовых форм при добавлении жидкости можно получать водные растворы или гели и гидрогели. И, наконец, композиции, согласно изобретению, могут находиться в виде состава реагентов /Кит/, в котором компоненты пептид с ФРФ-активностью и водорастворимый полисахарид могут существовать раздельно, но в определенных количествах.

Для свежих чистых ран достаточен незначительный избыток катионного полиэлектролита, т. е. по меньшей мере пятикратное количество пептидов с ФРФ-активностью для их покрытия. В зависимости от состояния раны этот избыток может быть значительно увеличен с целью блокирования неспецифических мест связывания. В соответствии с этим количество катионного полиэлектролита может составлять в десять тысяч раз больше количества пептидов с ФРФ-активностью. Предпочтительно, если соотношение весовых количеств катионного полиэлектролита и пептида составляет от 100 до 2000.

Предмет изобретения составляют также способы получения композиций, содержащих, по меньшей мере, один пептид с ФРФ-активностью в сочетании с, по меньшей мере, одним катионным полиэлектролитом, в котором компоненты существуют преимущественно в виде водного раствора с использованием обычных добавок, таких как буферные вещества или соли для регулирования осмотического давления или наполнителей. Возможна также стерильная форма приготовления таких растворов. Кроме того растворы можно перерабатывать в полутвердую и твердую форму, например, гидрогели, флизы, волокна, ткани, гранулы, порошки, пропитанные материалы.

Предметом изобретения являются также способы получения фармацевтических форм, в которых композиция, содержащая, по меньше мере, один пептид с ФРФ-активностью, и, по меньшей мере, один катионный полиэлектролит, соединяется с, по меньшей мере, одним твердым, жидким или полужидким носителем или вспомогательным веществом с преобразованием в подходящую лекарственную форму.

Предметом изобретения являются фармацевтические составы, содержащие композиции, состоящие из, по меньшей мере, одного пептида с ФРФ-активностью, и, по меньшей мере, одним катионным полиэлектролитом.

Фармацевтические композиции (согласно изобретению) целесообразно использовать для лечения ран по показаниям терапии, особенно когда при лечении этих ран или дефектов возможны процессы свободной грануляции. Важнейшие области применения представляемых изобретением комбинаций рода изъявления кожи /например, пролежни, диабетическая гангрена, артериальные и венозные застои/, а также раны от ожогов, язвы слизистой оболочки или расстройство их функций, лечение мест, откуда кожа для пересадки, мест трансплантации коже и мягких тканей, и послеоперационных ран /особенно при органической функции излечения/. Для всех областей применения использование композиций из пептидов с ФРФ-активностью и подходящих поликатионов особенно рекомендуется в тех случаях, когда речь идет о пациентах с ограниченной способностью к залечиванию /например, в силу возраста, основного заболевания или терапевтических соображений/.

Нижеследующие примеры поясняют изобретение, не ограничивая его.

Представленные ниже примеры можно рассматривать как иллюстрацию получения и применения предлагаемых согласно изобретению композиций, а также преимуществ их в сравнении с известными из уровня техники лекарственными формами, содержащими ФРФ-компоненты.

Пример 1.

Пример 1а. Раствор хитозана.

100 мг хитозан-глутомата /пропан/ растворяют в 10 мл раствора Рингера.

Пример 1б. Раствор б-формы ФРФ.

100 мг рекомбинантно, полученного из человека, вФРФ растворяют в 10 мл 20 молярного цитратного буфера с pH 5,0.

Пример 1с. Комбинированный раствор хитозана б-формы ФРФ.

По 10 мл растворов в соответствии с примерами 1а и 1б перемешивают. Конечная концентрация бФРФ составляет 5 мкг/мл.

Пример 2.

Пример 2а. Раствор хитозана.

100 мг метил-пирролидон-хитозана растворяют в 10 мл водного раствора поваренной соли (9 г/л).

Пример 2б.

50 мкг, рекомбинантно полученного из человека бФРФ, растворяют в 10 мл 20 молярного цитратного буфера с pH 5,0.

Пример 2с.

Смешивают по 10 мл растворов 1а и 1б. Конечная концентрация бФРФ составляет 2,5 мгк/мл.

Пример 3.

Раствор из примера 1с после получения лиофилизируют при толщине слоя 2 - 5 мл. Получают эффективную форму, готовую для наложения на рану.

Пример 4.

Обычную марлевую повязку на рану пропитывают раствором из примера 2с (2 мл/ 5 см²), а затем высушивают. Получают эффективную марлевую повязку для наложения на рану.

Пример применения А.

Вязкий раствор из примера 1с равномерно наносят на обработанную рану (1 мл/5 см²).

Пример применения Б.

Сначала рану обрабатывают раствором из примера 1а /хитозан/ (приблизительно 1 мл/5 см²). Через примерно 30 мин избыточный раствор и выделяющийся из раны сакрет промокали тампоном или ватно-марлевыми шариками. Затем рану продолжали обрабатывать раствором в соответствии с примерами 1б /бФРФ/ (1 мл/5 см² площади поверхности раны).

Пример применения В.

Сначала рану обрабатывают раствором в соответствии с примером 1а /хитозан/ (приблизительно 1 мл/5 см² поверхности раны). Через 30 мин предварительной обработки избыточный раствор и выделяющийся из раны секрет промокают ватно-марлевыми шариками. Затем рану продолжали обрабатывать раствором в соответствии с примером 1с /комбинация из хитозана и бФРФ/ (1 мл/5 см² поверхности раны).

Преимущество данного метода состоит в том, что после нанесения комбинации из бФРФ и хитозана происходит абсорбирование связывающих бФРФ-пептидов в области раны.

Использование: в медицине, в качестве ранозаживляющего средства. Сущность изобретения: композиция содержит пептид, являющийся фактором роста фибробластов, и катионный полиэлектролит из группы хитозана и его производных. Массовое соотношение пептида и катионного полиэлектролита 1:5-10000. Композиция может содержать носитель и/или целевые добавки и быть в виде водного раствора, лиофилизата или марлевой повязки. Композицию получают смешиванием водных растворов исходных компонентов. 2 с.и. 4 з.п. ф-лы.

1. Фармацевтическая композиция, обладающая ранозаживляющим действием, включающая по крайней мере один пептид, являющийся фактором роста фибробластов, и водорастворимый полисахарид, отличающаяся тем, что в качестве водорастворимого полисахарида она содержит катионный полиэлектролит, выбранный из группы, включающей хитозан и его производные, при массовом соотношении пептид: катионный полиэлектролит 1:5 10000. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит носитель и/или целевые добавки. 3. Композиция по пп.1 и 2, отличающаяся тем, что она представляет собой водный раствор или лиофилизат. 4. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что она выполнена в виде марлевой повязки. 5. Способ получения фармацевтической композиции, обладающей ранозаживляющим действием, включающий смешивание водных растворов по крайней мере одного пептида фактора роста фибробластов и водорастворимого полисахарида, отличающийся тем, что в качестве водорастворимого полисахарида используют катионный полиэлетролит, выбранный из группы, включающей хитозан и его производные, при массовом соотношении пептид катионный полиэлектролит 1:5 10000. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в полученную композицию дополнительно вводят носитель и/или целевые добавки.