ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА РЕЦЕПТОРЫ ErbB1 Российский патент 2009 года по МПК A61K39/395 A61P35/00 

Область техники изобретения

Изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим различные биологические молекулы, предпочтительно моноклональные антитела, каждое из которых содержит эпитопы, которые одновременно связываются с различными эпитопами одного и того же домена рецептора ErbB, в особенности домена рецептора ErbB1. Предпочтительные антитела в соответствии с настоящим изобретением представляют собой MAb 425 и MAb 225 каждое в его мышиной, химерной и гуманизированной модификации. Изобретение относится к применению и к способам улучшенного лечения предпочтительно опухолей при помощи указанных композиций.

Предпосылки создания изобретения

Известно, что биологические молекулы, такие как моноклональные антитела (MAb) или другие белки / полипептиды, а также небольшие химические соединения, направленные на различные рецепторы и другие антигены на поверхности опухолевых клеток, пригодны для лечения опухолей, что используется свыше двадцати лет. Что касается подхода с применением антител, то большинство таких MAb химеризуют или гуманизируют для улучшения переносимости иммунной системой человека. MAb или вышеупомянутые химические вещества специфически связываются с их структурами-мишенями в клетках опухолей и в большинстве случаев также в нормальных тканях и могут вызывать различные действия, которые зависят от специфичности их эпитопов и/или функциональных свойств конкретного антигена. Полагают, что MAb к орфановым рецепторам или другим нефункциональным молекулам поверхности клеток, а также MAb к структурам, расположенным снаружи по отношению к лиганд-связывающему участку функционально активных рецепторов (например, рецепторы фактора роста с киназной активностью) индуцируют первичные иммунные эффекторные функции против клетки-мишени (антитело-зависимая цитотоксичность, опосредованная клетками (ADCC), комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC)). Дополнительно, в зависимости от свойств антигена и MAb, связывание антигена может приводить к поперечному связыванию рецепторов. Последующая интернализация комплексов рецептор-антитело может приводить к пролонгированию снижающей модуляции плотности рецепторов на поверхности клеток.

MAb или небольшие химические молекулы, которые связываются с эпитопом в пределах лиганд-связывающего участка или в непосредственной близости к нему конкурируют за связывание с естественными лигандами с их рецептором и таким образом уменьшают или полностью ингибируют связывание лиганда и могут вытеснять уже связанные лиганды с их рецепторов. Это блокирование рецептора ингибирует лиганд-зависимую активацию рецептора и последующую передачу сигнала. Например, блокирование рецепторов ErbB, таких как рецептор фактора роста эпидермиса (EGFR), моноклональными антителами вызывает различные действия в клетках, включая ингибирование синтеза ДНК и пролиферацию, задержку клеточного цикла и апоптоз, а также антиметаститические и антиангиогенные действия.

Рецепторы ErbB представляют собой характерный рецептор тирозинкиназ, которые вовлечены в злокачественные новообразования, как установлено в 80-х годах прошлого века. Тирозинкиназы представляют собой класс ферментов, которые катализируют перенос конечного фосфата аденозинтрифосфата на остатки тирозина в белковых субстратах. Полагают, что тирозинкиназы при помощи субстратного фосфорилирования играют решающую роль в передаче сигнала при разнообразных клеточных функциях. Несмотря на то, что точно механизмы передачи сигнала все еще неясны, для тирозинкиназ было показано, что они являются важными факторами, которые принимают участие в пролиферации клеток, карциногенезе и дифференциации клеток.

Тирозинкиназы могут быть разделены на тирозинкиназы рецепторного типа и нерецепторного типа. Оба типа тирозинкиназ - рецепторного и нерецеторного типа - вовлечены в пути передачи сигналов в клетках, приводящие к многим патогенным состояниям, включая злокачественные новообразования, псориаз и гипериммунные ответы. Многие тирозинкиназы вовлечены в рост клеток, а также в ангиогенез (развитие кровеносных сосудов). Тирозинкиназы нерецепторного типа также включают множество подсемейств, такие как Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack и LIMK. Каждое из этих подсемейств также подразделяется в зависимости от разных рецепторов. Например, подсемейство Src является одним из наибольших и включает Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr и Yrk. Подсемейство ферментов Src связано с онкогенезом. Для более подробного обсуждения тирозинкиназ нерецепторного типа см. Bolen Oncogene, 8:2025-2031 (1993).

Тирозинкиназы рецепторного типа имеют внеклеточную, трансмембранную и внутриклеточную части, в то время как тирозинкиназы нерецепторного типа являются полностью внутриклеточными. Тирозинкиназы, связанные с рецептором, представляют собой трансмембранные белки, которые включают внеклеточный лиганд-связывающий домен, трансмембранную последовательность и цитоплазматический домен тирозинкиназы. Тирозинкиназы рецепторного типа включают большое количество трансмембранных рецепторов с разнообразной биологической активностью.

Были идентифицированы разные подсемейства тирозинкиназ рецепторного типа. Такие тирозинкиназы включают рецепторы фактора роста фибробластов (FGF), рецепторы фактора роста эпидермиса (EGF) семейства основного класса ErbB и рецепторы фактора роста производных тромбоцитов (PDGF). Также сюда включают рецепторы фактора роста нервов (NGF), рецепторы нейротрофического фактора, имеющего происхождение из головного мозга (BDNF), рецепторы нейротрофина-3 (NT-3) и рецепторы нейротрофина-4 (NT-4).

Одно подсемейство тирозинкиназы рецепторного типа, обозначенное как подсемейство HER или ErbB, включает EGFR (ErbB1), HER2 (ErbB2 или p185neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2). Лиганды этого подсемейства рецепторов включают фактор роста эпителия (EGF), TGF-α, амфирегулин, HB-EGF, бетацеллюлин, херегулин и нейрегулины. Подсемейство PDGF включает семейство FLK, которое включает рецептор вставочного домена киназы (KDR).

EGFR, кодируемый геном ErbB1, вовлечен и является одной из причин возникновения злокачественных опухолей у людей. В частности, усиленная экспрессия EGFR наблюдается при раке молочной железы, мочевого пузыря, легких, головы, шеи и желудка, а также при глиобластомах. Усиленная экспрессия рецептора EGFR часто связана с усиленной выработкой лиганда EGFR, трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), в подобных опухолевых клетках приводит к активации рецептора при помощи аутокринной стимуляции (Baselga и Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994)).

Рецептор EGF представляет собой трансмембранный гликопротеин, который имеет молекулярный вес 170,000 и был обнаружен во многих типах эпителиальных клеток. Он активируется по крайней мере тремя лигандами, такими как EGF, TGF-α, (трансформирующий фактор роста альфа) и амфирегулин. Было показано, что и фактор роста эпидермиса (EGF), и трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α) связываются с рецетором EGF и приводят к пролиферации клеток и росту опухолей. Эти факторы роста не связываются с HER2 (Ulrich и Schlesinger, 1990, Cell 61, 203). В противоположность некоторым семействам факторов роста, которые индуцируют димеризацию рецептора в силу их димерной природы (например, PDGF), мономерные факторы роста, такие как EGF, включают два связывающих участка к их рецепторам и, следовательно, могут в большинстве случаев перекрестно связывать два соседних рецептора EGF (Lemmon и др., 1997, EMBO J. 16, 281). Недавние исследования (J. Schlessinger, 2002, Cell 110, 669) показали, что димеризация рецептора опосредуется взаимодействиями между рецепторами, при которых петля, которая выпячивается из соседних рецепторов, опосредует димеризацию и активацию рецептора.

Димеризация рецептора является необходимой для стимуляции присущей каталитической активности и для аутофосфорилирования рецепторов факторов роста по остаткам тирозина. Последние являются пригодными в качестве стыковочных участков для различных адапторных белков или ферментов, которые одновременно инициируют многие каскады передачи сигналов. У высших эукариот простой линейный метаболический путь эволюционирует в интенсивно взаимодействующую многослойную сеть, в которой комбинационная экспрессия и активация компонентов путем развития обеспечивает возможность осуществления специфических биологических ответных реакций. Сеть ErbB может объединять не только свои входящие сигналы, но также гетерологические сигналы, включая гормоны, лимфокины, нейромедиаторы и индукторы стресса.

Следует отметить, что рецепторы тирозинкиназы белков (РТК) способны подвергаться как гомо-, так и гетеродимеризации, причем гомодимерные комбинации рецепторов являются менее митогенными и трансформирующими (не инициируют сигналы или слабо инициируют сигналы) по сравнению с соответствующими гетеродимерными комбинациями. Гетеродимеры, содержащие ErbB2, являются наиболее эффективными комплексами (см. обзорные статьи Yarden и Sliwkowski, 2001, Nature Reviews, Molecular cell Biology, том 2, 127-137; Tzahar и Yarden, 1998, ВВ А1377, М25-М37).

Было показано, что антитела к рецептору EGF хотя блокируют связывание EGF и TGF-α с рецептором, способны ингибировать пролиферацию опухолевых клеток. Принимая во внимание эти полученные данные, было выявлено много мышиных и крысиных моноклональных антител к рецептору EGF и изучена их способность ингибировать рост опухолевых клеток в условиях in vitro и in vivo (Modjtahedi и Dean, 1994, J. Oncology 4, 277). Гуманизированное моноклональное антитело 425 (hMAb 425, US 5,558,864; ЕР 0531 472) и химерное моноклональное антитело 225 (cMAb 225), оба к рецептору EGF, выявляют эффективность при клинических исследованиях. Было показано, что антитело С225 (цетуксимаб) ингибирует EGF-опосредованный рост опухолевых клеток в условиях in vitro и ингибирует образование человеческих опухолей в условиях in vivo у бесшерстых мышей. Антитела, так же как в целом все антитела к EGFR, обладают, прежде всего, синергетическим действием с определенными химиотерапевтическими веществами (например, доксорубицином, адриамицином, таксолом и цисплатином) и уничтожают человеческие опухоли в условиях in vivo на модели мышиных ксенотрансплантов (см., например, ЕР 0667165). Ye и др. (1999, Oncogene 18, 731) показали, что клетки рака яичника человека могут успешно поддаваться лечению комбинацией как химерного cMAb 225, так и гуманизированного MAb 4D5 к рецептору HER2.

Другой представитель семейства ErbB, HER2 (ErbB2 или p185neu), был первоначально идентифицирован в качестве продукта трансформации гена из нейробластом крыс, подвергнутых химиотерапии. Активированная форма neu протоонкогена возникает вследствие точечной мутации (валина на глутаминовую кислоту) в трансмембранном участке кодуруемого белка. Амплификация человеческого гомолога neu наблюдается при раке молочной железы и яичников и коррелирует с неблагоприятным прогнозом (Slamon и др., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon и др., Science, 244:707-712 (1989); US 4,968,603). ErbB2 (HER2) имеет молекулярный вес приблизительно 185,000 и обладает значительной гомологией к рецептору EGF (HER1), несмотря на то, что специфический лиганд для HER2 до сих пор еще не был окончательно идентифицирован. Антитело 4D5 к рецептору HER2 дополнительно обнаруживает чувствительность к цитотоксическим действиям TNF-α в клеточных линиях опухолей молочной железы, которые сверхэкспрессируют ErbB2 (патент US 5677171). Рекомбинантная гуманизированная модификация мышиного антитела 4D5 к ErbB2 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 или HERCEPTIN®; US 5821337) обладает клинической активностью у пациентов с метастазами рака молочной железы, что сверхэкспрессируют ErbB2, которые предварительно получали интенсивное противораковое лечение (Baselga и др., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). HERCEPTIN ® был разрешен к применению в 1998 для лечения пациентов с метастатическим раком молочной железы, который сверхэкспрессирует белок ErbB2.

Кроме антител к ErbB, существуют различные небольшие химические молекулы, которые, как известно, являются эффективными ингибиторами молекул рецепторов ErbB, блокируя участок связывания естественных лигандов (см. подробное описание) или блокируя остатки тирозина связывающего участка рецептора киназы, таким образом предотвращая фосфорилирование и дальнейший каскад передачи сигналов. Одним из таких характерных представителей, который обнаруживает высокую эффективность при клинических исследованиях, является Иресса (Iressa^ТМ, ZD-1839), которая может применятся при NSCLC (немелкоклеточном раке легкого).

Несмотря на то что в настоящее время развиваются и представлены на рынке некоторые перспективные лекарственные средства и способы лечения опухолей, существует настоятельная потребность в дополнительных средствах и фармацевтических композициях и комбинациях с улучшенными свойствами и повышенной эффективностью.

Сущность изобретения

Изобретение основано на результатах исследований авторов изобретения, которые обнаружили, что определенные рецепторные тирозинкиназы, такие как молекулы антитела рецептора ErbB, предпочтительно молекулы антитела рецептора ErbB1 (EGFR), которые свырхэкспрессируются на поверхностях патологических клеток, например, опухолевых клеток, имеют специфичные эпитопные участки в пределах домена, связывающего естественный лиганд, с которыми одновременно могут связываться различные молекулы антител только с незначительным взаимным препятствием или без него. Очевидно, эти молекулы антитела обладают связывающими эпитопами, которые, благодаря их трехмерной конфигурации, являются относительно небольшими по сравнению с общим размером связывающего домена молекулы рецептора. Они вызывают повышение модулирующей активности опосредуемого пути передачи сигнала, предпочтительно повышают блокирование рецептора ErbB и, таким образом, полный каскад передачи сигнала. Настоящее изобретение описывает, во-первых, новую концепцию лечения опухолей, которая предполагает введение особи одного или нескольких биологически и терапевтически эффективных средств, которые блокируют или ингибируют рецептор ErbB рецептор, предпочтительно EGF рецептор (EGFR) (ErbB1), путем связывания указанного(ых) средства(средств) по крайней мере с первым и вторым различными эпитопами, предпочтительно в пределах домена, связывающего естественный лиганд, одного и того же рецептора. Было обнаружено, что, например, две или больше, предпочтительно две, разных антагонистичных к рецептору молекулы одновременно могут связываться с одним и тем же доменоми рецептора, предпочтительно одной и той же молекулы рецептора, без взаимного препятствия или конкурирования, что дает возможность повысить плотность антагонистичного связывания с рецептором и обеспечить (путем снижения способности связывать естественные (агонистические) лиганды, такие как EGF или TGF-α) более значительное ингибирование пути передачи сигнала соответствующими молекулами рецепторов в виде мономерных или димерных единиц. Это может приводить к значительному ингибированию роста опухоли и/или усилению апоптоза солидных опухолей или метастаз опухолей. Указанные молекулы могут представлять собой небольшие химические и синтетические соединения или белки, полипептиды или пептиды, иммуноглобулины, такие как антитела или их фрагменты, или иммуноконъюгаты. Предпочтительные молекулы представляют собой антитела к ErbB, в особенности антитела к EGFR и Her2, как описано выше и в дальнейшем, и их фрагменты, предпочтительно F(ab')2. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения два различных антитела к EGFR вводятся особи, предпочтительно MAb 425 в гуманизированной, химерной или мышиной модификации или его фрагмент, такой как F(ab')2, и MAb 225 в гуманизированной, химерной или мышиной модификации или его фрагмент, такой как F(ab')2. Наиболее предпочтительным является совместное применение гуманизированного MAb 425 и химерного MAb 225 в виде полного антитела или в виде F(ab')2 фрагмента.

Однако также является возможным применять относительно короткие синтетические (поли)пептиды, имеющие происхождение и полученные из указанных сконструированных антител, содержащих аминокислотную последовательность одного, двух или трех CDR соответствующего антитела, в котором, необязательно, для повышения связывающего сродства и/или степени сродства к рецептору, некоторые аминокислоты в пределах антигенсвязывающего участка или в непосредственной близости от него (1-5 аминокислот) могут быть модифицированы предпочтительно путем замещения. Такие синтетические пептиды, которые могут связываться с рецептором со сродством, сравнимым с соответствующими антителами, обладают преимуществами, поскольку могут быть легко и недорого получены. Также представляется возможным синтезировать один единичный пептид, который содержит аминокислотные последовательности, имеющие происхождение от указанных CDR, в качестве первой молекулы, а также в качестве второй молекулы, например, (поли)пептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую происхождение от 1-3 CDR MAb 425 и 1-3 CDR Mab 225.

Было обнаружено, что фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут вызывать повышение поперечного связывания / димеризацию различных или одинаковых рецепторов ErbB, усиливать блокирование / ингибирование рецепторов ErbB и усиливать индукцию модуляции специфического пути передачи сигнала, опосредуемого рецептором ErbB, по сравнению с единичной молекулой, содержащей только один их указанных связывающих участков. Другими словами: смесь, например MAb 425 и MAb 225, выявляет улучшенное ингибирование и снижающую регуляцию на EGFR по сравнению с подходом, когда MAb 425 или 225 применяются в качестве единичного средства в аналогичной концентрации.

Несмотря на то, что вышеописанные исследования осуществляли только для рецепторов ErbB в качестве молекул рецепторов-мишеней, следует обратить внимание на то, что научный принцип, открытый изобретателями и описанный выше и в дальнейшем, также может применяться для других биологических рецепторов, отличных от ErbB.

Необязательно композиция в соответствии с настоящим изобретением включает дополнительные терапевтически активные соединения, которые могут способствовать и улучшать эффективность вышеописанных молекул. Такими средствами могут являться цитотоксические средства и предпочтительно антагонистические молекулы, такие как антагонисты тирозинкиназы, другие ErbB антагонисты, антагонисты рецептора гормона роста, антагонисты протеинкиназы, антиангиогенные средства или цитокины. Такие вещества, пригодные для применения, согласно настоящему изобретению более подробно описаны ниже.

В соответствии с настоящим изобретением терапевтически активные вещества также могут применяться в виде фармацевтического набора, включающего упаковку, содержащую одно или больше указанных антагонистических средств в общем или раздельных контейнерах. Лечение при помощи этих комбинаций необязательно может включать лучевую терапию. В большинстве случаев введение может сопровождаться лучевой терапией, при этом лучевая терапия может осуществляться в основном одновременно или перед или после введения лекарственного средства. Введение различных средств в комбинированной терапии в соответствии с изобретением также может осуществляться в основном одновременно или последовательно. Опухоли, которые на поверхностях своих клеток несут рецепторы, вовлеченные в развитие кровеносных сосудов опухоли, могут успешно лечиться комбинированной терапией в соответствии с настоящим изобретением.

Известно, что опухоли используют альтернативные пути для своего развития и роста. Если один путь блокирован, они часто обладают способностью переключаться на другой путь при помощи экспрессии и использования других рецепторов и других путей передачи сигналов. Поэтому фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут блокировать несколько таких возможных стратегий развития опухоли и, следовательно, обеспечивать различные преимущества. Комбинации в соответствии с настоящим изобретением полезны для лечения и предотвращения опухолей, опухолеподобных нарушений, неоплазий и метастаз опухолей, которые развиваются и растут вследствие активации их соответствующих рецепторов гормонов, присутствующих на поверхности опухолевых клеток. Предпочтительно, сочетания различных средств по настоящему изобретения вводятся в комбинации в низких дозах, при этом такие дозы являются ниже тех доз, которые обычно используются в медицине. Преимущество снижения доз соединений, композиций, средств и терапий по настоящему изобретению, что вводятся особи, состоит в уменьшении количества побочных эффектов, связанных с введением высоких доз. Например, при снижении дозы средства, описанного выше и ниже, происходит уменьшение частоты и степени тошноты и рвоты по сравнению с наблюдаемыми при введении высших доз. При снижении количества побочных действий улучшается качество жизни раковых больных. Дополнительными преимуществами снижения количества побочных эффектов является улучшение соблюдения больным режима и схемы лечения, снижение числа госпитализаций, необходимых для лечения побочных эффектов, и уменьшение введения обезболивающих средств, необходимых для лечения боли, связанной с побочными действиями. Альтернативно, способы и комбинации по настоящему изобретению могут также обеспечивать максимальную терапевтическую эффективность при высших дозах.

Комбинации в соответствии с изобретением выявляют неожиданный синергетический эффект. При введении комбинации лекарственных средств действительно наблюдается сокращение и распад опухоли при клинических исследованиях, в то время как не наблюдается существенного неблагоприятного взаимодействия лекарственных средств.

В целом изобретение относится к:

- фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько биологически и/или терапевтически эффективных молекул антител (или их фрагмент), которые обладают способностью связываться с различными эпитопами связывающего домена молекулы рецептора ErbB, где указанная одна или несколько молекул антитела содержат по крайней мере участок связывания, который связывается с первым специфическим эпитопом указанного связывающего домена рецептора и по крайней мере другой участок связывания, который связывается с вторым специфичным эпитопом одного и того же связывающего домена рецептора ErbB;

- соответствующей фармацевтической композиции, содержащей две или больше молекул антитела, причем одна молекула антитела содержит по крайней мере участок связывания, который связывается с первым специфическим эпитопом указанного связывающего домена рецептора, и по крайней мере другая молекула антител содержит по крайней мере другой участок связывания, который связывается с вторым специфичным эпитопом одного и того же связывающего домена рецептора;

- соответствующей фармацевтической композиции, в которой по крайней мере одна из указанных молекул антител связывается с эпитопом в пределах связывающего домена рецептора, с которым связывается естественный лиганд рецептора;

- соответствующей фармацевтической композиции, которая вызывает усиление блокирования и/или ингибирования рецептора ErbB и усиливает индукцию изменения специфического пути передачи сигнала, опосредуемого рецептором ErbB, по сравнению с единичной молекулой, содержащей только один из указанных участков связывания;

- соответствующей фармацевтической композиции, которая вызывает повышение поперечного связывания и/или димеризацию различных рецепторных молекул, обладающей одинаковой или различной специфичностью;

- соответствующей фармацевтической композиции, в которой указанный рецептор ErbB представляет собой рецептор EGF рецептор (EGFR);

- соответствующей фармацевтической композиции, содержащей первое и второе моноклональное антитело (или их биологически активный фрагмент), каждое из которых направлено на различные эпитопы рецептора EGF;

- соответствующей фармацевтической композиции, в которой первое антитело представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное MAb 425;

- соответствующей фармацевтической композиции, в которой второе антитело представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное MAb 225;

- соответствующей фармацевтической композиции, в которой указанное первое антитело представляет собой гуманизированное MAb 425 (h425) и указанное второе антитело представляет собой химерное MAb 225 (с225, цетуксимаб);

- соответствующей фармацевтической композиции, которая дополнительно содержит цитотоксическое средство;

- фармацевтическому набору, который содержит

(i) первую упаковку, содержащую по крайней мере первую биологически активную молекулу антитела (или ее фрагмент), которая связывается с первым специфическим эпитопом связывающего домена на молекуле рецептора ErbB, и

(ii) вторую упаковку, содержащую по крайней мере вторую молекулу антитела или ее фрагмент, которая связывается с отличным вторым специфическим эпитопом связывающего домена одной и той же молекулы рецептора ErbB;

- соответствующему фармацевтическому набору, в котором по крайней мере одна из указанных молекул антител связывается с эпитопом в пределах связывающего домена рецептора, с которым связывается естественный лиганд рецептора;

- соответствующему фармацевтическому набору, в котором указанная первая молекула антитела представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное моноклональное антитело 425 или его биологически активный фрагмент, а указанная вторая молекула антитела представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное моноклональное антитело 225 или его биологически активный фрагмент;

- соответствующему фармацевтическому набору, содержащему первую упаковку, которая содержит гуманизированное MAb 425 (h425), и вторую упаковку, которая содержит химерное MAb 225 (с225);

- соответствующему фармацевтическому набору, который дополнительно включает третью упаковку, содержащую дополнительное лекарственное средство, обладающей способностью усиливать эффективность лекарственных средств, которые содержатся в первой и второй упаковках;

- соответствующему фармацевтическому набору, в котором указанное дополнительное лекарственное средство представляет собой цитотоксическое средство;

- способу лечения заболеваний, связанных с опухолями, у пациента, который предусматривает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества (i) по крайней мере первой молекулы антитела (или ее фрагмента), которая связывается с первым специфическим эпитопом связывающего домена молекулы рецептора ErbB, и (ii) по крайней мере второй молекулы антитела, которая связывается с отличным вторым специфическим эпитопом участка связывания одной и той же молекулы рецептора ErbB;

- соответствующему способу, в котором по крайней мере одна из указанных молекул антител связывается с эпитопом в пределах связывающего домена рецептора, с которым связывается естественный лиганд рецептора;

- соответствующему способу, в котором указанная молекула антитела, которая связывается с указанным эпитопом, блокирует и/или ингибирует рецептор, индуцируя таким образом модуляцию специфического пути передачи сигнала, опосредуемого рецептором;

- соответствующему способу, в котором связывание указанной молекулы антитела вызывает поперечное связывание и/или димеризацию различных молекул рецептора, обладающих одинаковой или различной специфичностью;

- соответствующему способу, в котором указанная первая молекула антитела представляет собой гуманизированное моноклональное антитело 425 (h425) или его биологически активный фрагмент, а указанная вторая молекула представляет собой химерное или моноклональное антитело 225 (с225) или его биологически активный фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения рецептор ErbB представляет собой рецептор EGF (EGFR) и антитела, направленные на различные эпитопы на этот рецептора, представляют собой антитела к EGFR.

Таким образом, изобретение относится, в частности, к:

- фармацевтической композиции, содержащей первую и вторую молекулу антитела или ее часть, обладающую способностью связываться с различными эпитопами, расположенными на молекулах рецептора ErbB одинакового или различного типа, где указанная первая молекула антитела или ее часть содержит участки связывания, которые связываются с первым специфическим эпитопом на молекуле рецептора типа ErbB1, и указанная вторая молекула антитела содержит участки связывания, которые связываются с вторым специфическим эпитопом на молекуле рецептора ErbB1 такого же типа;

- фармацевтической композиции, в которой по крайней мере указанный первый или второй эпитоп на молекуле рецептора типа ErbB1 расположен в пределах связывающего домена рецептора ErbB1;

- фармацевтической композиции, в которой указанный первый и второй эпитоп на молекуле рецептора типа ErbB1 расположены в пределах связывающего домена рецептора ErbB1;

- фармацевтической композиции, в которой указанный связывающий домен рецептора представляет собой связывающий домен естественного лиганда указанного типа молекулы рецептора ErbB1;

- фармацевтической композиции, в которой первое и второе антитело или их фрагмент связываются с различными эпитопами в пределах связывающего домена естественного(ых) лиганда(ов) указанного типа молекулы рецептора ErbB1;

- фармацевтической композиции, где блокирование и/или ингибирование рецептора ErbB, и индукция понижающей регуляции специфического пути передачи сигнала, опосредуемого рецептором ErbB, усиливается по сравнению с композицией, содержащей единичную молекулу антитела, которая связывается с указанным первым или вторым эпитопом только на указанном типе молекулы рецептора ErbB1;

- фармацевтической композиции, где индукция поперечного связывания и/или димеризации молекул рецептора ErbB, обладающих одинаковой или различной специфичностью, усиливается по сравнению с композицией, содержащей единичную молекулу антитела, которая связывается с указанным первым или вторым эпитопом только на указанном типе молекулы рецептора ErbB1;

- фармацевтической композиции, в которой указанные молекулы рецептора ErbB вовлечены в поперечное связывание и/или димеризацию и выбраны из ErbB1 и ErbB2 (Her-2);

- фармацевтической композиции, в которой указанные первое и/или второе антитела представляют собой моноспецифическое антитело;

- фармацевтической композиции, в которой первое антитело представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное MAb 425;

- фармацевтической композиции, в которой второе антитело представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное MAb 225;

- фармацевтической композиции, в которой указанное первое антитело представляет собой гуманизированное MAb 425 (h425) и указанное второе антитело представляет собой химерное MAb 225 (с225);

- фармацевтической композиции в соответствии с п.1-12, которая дополнительно содержит цитотоксическое средство;

- фармацевтической композиции, в которой указанное цитотоксическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство;

- фармацевтической композиции, в которой указанное химиотерапевтическое средство выбрано из любого соединения из группы, включающей: цисплатин, доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел, паклитаксел, блеомицин;

- фармацевтической композиции, в которой указанное цитотоксическое средство представляет собой ингибитор рецептора ErbB, ингибитор рецептора VEGF, ингибитор тирозинкиназы, ингибитор протеинкиназы А, антиангиогенное средство или цитокин;

- фармацевтической композиции, в которой указанная первая и/или указанная вторая молекула антитела представляет собой иммуноконъюгат, в котором антитело слито своей С-концевой частью с биологически эффективным пептидом, полипептидом или белком необязательно при помощи линкерного пептида;

- фармацевтической композиции, в которой белок представляет собой цитокин;

- фармацевтическому набору, содержащему (i) первую упаковку, которая содержит первую молекулу антитела или ее часть, содержащую участки связывания, которые связываются с первым специфическим эпитопом, расположенным на молекуле рецептора ErbB1, и (ii) вторую упаковку, которая содержит вторую молекулу антитела, содержащую участки связывания, которые связываются с вторым отличным эпитопом на молекуле рецептора ErbB1 такого же типа;

- фармацевтическому набору, в котором по крайней мере указанный первый или второй эпитоп на рецепторе ErbB1 расположен в пределах связывающего домена рецептора ErbB1;

- фармацевтическому набору, в котором указанный первый и второй эпитоп на рецепторе ErbB1 расположены в пределах связывающего домена рецептора ErbB1;

- фармацевтическому набору, в котором по крайней мере одна из указанных молекул связывается с эпитопом в пределах связывающего домена рецептора ErbB1, с которым связывается естественный лиганд рецептора;

- фармацевтическому набору, в котором указанная первая молекула антитела представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное моноклональное антитело 425, и указанная вторая молекула представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное моноклональное антитело 225;

- фармацевтическому набору, который содержит первую упаковку, содержащую гуманизированное MAb 425 (h425) и вторую упаковку, содержащую химерное MAb 225 (с225);

- фармацевтическому набору в соответствии с любым из п.19-24, который дополнительно содержит третью упаковку, содержащую цитотоксическое средство;

- фармацевтическому набору, в котором указанное цитотоксическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство;

- фармацевтическому набору, в котором указанное химиотерапевтическое средство выбрано из любого соединения из группы, включающей: цисплатин, доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел, паклитаксел, блеомицин;

- фармацевтическому набору, в котором указанное цитотоксическое средство представляет собой ингибитор рецептора ErbB, ингибитор рецептора VEGF, ингибитор тирозинкиназы, ингибитор протеинкиназы А, антиангиогенное средство, или цитокин;

- применению фармацевтической композиции или фармацевтического набора, как определено выше и в любом из пунктов формулы, для приготовления лекарственного средства для лечения опухолей, метастаз опухолей и заболеваний, связанных с опухолями, которые сверхэкспрессируют рецепторы ErbB, в особенности рецепторы ErbB1.

Подробное описание изобретения

Изобретение основывается на наблюдении, что две или больше различных молекул, предпочтительно моноклональных антител (MAb) со специфичностями к различным иммуногенным структурам могут связываться с их этитопами в одно и то же время и без препятствия, которые могут быть расположены на одном и том же ErbB, предпочтительно ErbB1, домене рецептора, например в пределах лиганд-связывающего домена ErbB (ErbB1). Применение двух или больше химических или биологических молекул, обладающих описанными свойствами, такие как моноспецифические MAb или комбинации антител, направленных на одинаковые или различные рецепторы, может значительно улучшать терапевтическую эффективность по сравнению с эффективностью, наблюдаемой при лечении только одним моноспецифическим антителом.

- Два или больше MAb независимо связываются с различными эпитопами на их мишенях-рецепторах (например, EGFR).

- Благодаря независимому связыванию с различными эпитопами рецептора количество связанного антитела на рецептор и, следовательно, на клетку может повышаться для одной той же дозы антитела или концентрации. В оптимальных условиях с насыщающими концентрациями или дозами для каждого антитела число связанных молекул антитела на рецептор и клетку теоретически может удваиваться в случае применения двух антител к различным эпитопам. При каждом дополнительном применяемом антителе можно добиться линейного повышения связанного белкового антитела на рецептор и на клетку.

- Клетки с плотностью антител ниже пороговой величины для антитело-зависимых иммунных эффекторных действий, которые не чувствительны к лечению антителами в обычных условиях, обнаруживают повышенное количество антител на их поверхности после лечения двумя или большим количеством антител, направленных к различным эпитопам одного и того же рецептора и, следовательно, потенциально становятся чувствительными к ADCC и CDC.

- По сравнению с эффективностью блокирования рецептора, полученного при помощи одного единичного антитела, применение двух или большего количества моноспецифических антител со специфичностями к различным эпитопам в пределах лиганд-связывающего домена или расположенными в непосредственной близости очевидно повышает эффективность блокирования рецептора.

- Поскольку блокирование рецептора при помощи комбинации различных антител против одного и того же домена рецептора является более эффективным, чем блокирование рецептора только при помощи одного единичного антитела, то достигается более эффективное ингибирование связывания лиганда, что приводит к более эффективной инактивации рецептора.

- Такая более эффективная инактивация рецептора приводит к более эффективному ингибированию последующей передачи сигнала рецептором и, следовательно, к повышенному воздействию на лиганд-зависимые клеточные функции.

- Благодаря более эффективному блокированию рецептора доза (или концентрация) каждого применяемого антитела может уменьшаться без уменьшения эффективности. Это может представлять большой интерес, если применяемые терапевтические антитела уже обнаруживают токсичность, ограничивающую дозу, или побочные действия в дозе, которая ниже оптимальной терапевтической.

- Моноспецифические антитела, которые взаимодействуют только с одним единичным эпитопом рецептора, образуют агрегаты, состоящие из двух молекул рецептора. В отличие от этого, поперечное связывание, которое индуцируется двумя или большим количеством антител, направленных на различные эпитопы, приводит к образованию комплексов рецептор-антитело, которые содержат очень большое количество рецепторов.

- Образование больших комплексов рецептор-антитело, вызванных применением двух или большего количества антител, улучшает интернализацию рецепторов и, следовательно, могут быть более эффективными для удаления рецепторов с поверхности клетки и в дальнейшем подавляет рецептор-зависимые клеточные функции.

- Сочетание двух или большего количества антител, направленных на одинаковые или различные рецепторы, может использоваться для лечения опухолей, несущих соответствующие рецепторы. Типичным примером являются EGFR-положительные опухоли, однако применение терапевтического подхода, раскрытого в настоящем изобретении, не ограничивается только этим показанием. Следовательно, используя аналогичный подход, можно лечить множество опухолей, несущих другие рецепторы, семейства рецепторов или другие антигенные структуры.

- Совместное лечение с использованием двух или большего количества антител, направленных на различные антигены одинаковых или различных рецепторов, также применимо в качестве комбинированного лечения совместно с химиотерапевтическими средствами и/или облучением.

- Совместное лечение с использованием двух или большего количества антител, направленных на различные антигены одинаковых или различных рецепторов, также может применяться в сочетании с другими терапевтическими подходами, включая, но не ограничиваясь только ими, лечение антагонистами гормонов или агонистами гормонов, ингибиторами ангиогенеза и другие виды лечения.

Принципы совместного лечения с использованием подходящих молекул, предпочтительно антител, с различными специфичностями к антигенным структурам на одинаковых или различных рецепторах, описаны в изобретении на примере лечения EGFR-положительных опухолей. Однако, этот подход не ограничивается EGFR и может адаптироваться для применения с любыми антигенами-мишенями.

Если не указанно другое, термины и фразы, применяемые в данном изобретении, имеют значения и определения, указанные ниже. Кроме того, эти определения и значения описывают изобретение более подробно, включая предпочтительные варианты осуществления.

"Рецептор" или "рецепторная молекула" представляет собой растворимый или мембранно-связанный / ассоциированный протеин или гликопротеин, содержащий один или более доменов, с которыми связывается лиганд с образованием комплекса рецептор-лиганд. При связывании с лигандом, которым может быть агонист или антагонист, происходит активация или инактивация рецептора и может инициироваться или блокироваться путь передачи сигнала.

Понятие "тип молекулы рецептора" или "тип молекулы ErbB (ErbB1) рецетора" обозначает специфический тип рецептора, такой как ErbB1, ErbB2 и т.д., но не конкретную единичную молекулу этого типа рецептора. Если указано в изобретении, что антитела в соответствии с изобретением при их комбинации связываются со специфическим типом молекулы рецептора ErbB, то это охватывает связывания антител с одинаковыми или разными молекулами одного и того же типа рецептора ErbB, как указано. Таким образом представляется возможным, когда первое антитело связывается со специфическим эпитопом на индивидуальной молекуле рецептора ErbB1 и второе антитело связывается с другим отличным эпитопом одной и той же индивидуальной молекулы рецептора ErbB1. Однако также представляется возможным, когда второе антитело связывается с идентичным эпитопом другой индивидуальной молекулы одного и того же типа рецептора.

Под "лигандом" или "лигандом рецептора" подразумевается естественное или синтетическое соединение, которое связывается с молекулой рецептора с образованием комплекса рецептор-лиганд. Под понятие лиганд подпадают агонисты, антагонисты и соединения с частичным агонистичным/антагонистичным действием.

"Агонист" или "агонист рецептора" представляет собой естественное или синтетическое соединение, которое связывается с рецептором с образованием комплекса рецептор-агонист, при этом происходит активирование указанного рецептора и комплекса рецептор-агонист, соответственно, инициализируется путь передачи сигнала и другой биологический процесс.

Под "антагонистом" или "антагонистом рецептора" подразумевается естественное или синтетическое соединение, которое обладает противоположным к агонисту биологическим действием. Антагонист связывается с рецептором и блокирует активацию рецептора агонистом путем конкуренции с агонистом за рецептор. Антагонист определяется путем его способности блокировать действие агониста. Антагонист рецептора также может представлять собой антитело или его иммунотерапевтически эффективный фрагмент. Предпочтительные антагонисты в соответствии с настоящим изобретением приведены и обсуждаются ниже.

"ErbB рецептор" представляет собой рецептор тирозинкиназы белков, который принадлежит, как уже указывалось выше, к семейству рецепторов ErbB и включает рецепторы EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 и ErbB4 и другие представители этого семейства, которые будут идентифицированы в будущем. Рецептор ErbB в большинстве случаев может включать внеклеточный домен, который может связывать лиганд ErbB; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный домен тирозинкиназы; и карбоксиконцевой сигнальный домен, в котором находится несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы. Рецептор ErbB может представлять собой "естественную последовательность" ErbB рецептора или "вариант его аминокислотной последовательности". Предпочтительно рецептор ErbB представляет собой естественную последовательность рецептора ErbB человека. ErbB1 относится к гену, кодирующему белковый продукт EGFR. Наиболее предпочтительным является EGF рецептор (EGFR, HER1). Выражения "ErbB1", "HER1" и "EGFR" взаимозаменяемо используются в настоящем изобретении и относятся к белку HER1 человека. Выражения "ErbB2" и "HER2" взаимозаменяемо используются в настоящем изобретении и относятся к белку HER2 человека. Предпочтительными в соответствии с данным изобретением являются ErbB1 рецепторы (EGFR).

"Лиганд ErbB" представляет собой полипептид, который связывается с и/или активирует ErbB рецептор. ErbB лиганды, которые связывают EGFR, включают, например, EGF, TGF-α, амфирегулин, бетацеллюлин, HB-EGF и эпирегулин, предпочтительно EGF и TGF-α.

"Связывающий домен рецептора ErbB" в контексте настоящего изобретения обозначает локальный участок (связывающую последовательность / петлю / карман) рецептора ErbB, с которым связывается естественный лиганд или антагонистическое или агонистическое лекарственное средство. Этот участок может содержать не только один специфический участок связывания или эпитоп, но также два или больше эпитопов и участков связывания соответственно. Один специфический связывающий эпитоп в пределах домена связывается с одним видом антагонистического или агонистического лекарственного средства или лиганда. Тем не менее полагают, что связывание различных средств с различными эпитопами в пределах связывающего домена или рядом со связывающим доменом рецептора идентичного типа, как правило, вызывает ингибирование или активацию отдельного и уникального пути передачи сигнала, который типичный для указанного рецептора. Кроме того, следует обратить внимание на то, что выражение "в пределах связывающего домена", которое используется в описании и пунктах формулы настоящего изобретения, включает также участки, расположенные в непосредственной близости к действительному связывающему домену соответствующего(их) естественного(ых) лиганда(ов).

"Связывающий эпитоп ErbB или участок связывания" обозначает структуру и/или конфигурацию аминокислот в пределах связывающего домена или в непосредственной близости к связывающему домену рецептора ErbB, с которым связываются лиганды или антагонисты/агонисты рецептора.

"Такая же молекула рецептора ErbB/ErbB1" обозначает необязательно идентичную молекулу рецептора, но также включает другую молекулу рецептора такого же типа. Предпочтительно подразумевается идентичная молекула рецептора.

Понятие "антагонист/ингибитор рецептора ErbB" относится к биологически активной молекуле, которая связывает и блокирует или ингибирует ErbB рецептор. Таким образом, при помощи блокирования рецептора антагонист препятствует связыванию ErbB лиганда (агониста) и активированию комплекса агониста/лиганда с рецептором. ErbB антагонисты могут быть направлены на HER1 (ErbB1, EGFR), HER2 (ErbB2) и ErbB3 и ErbB4. Предпочтительными антагонистами по изобретению являются антагонисты к EGF рецептору (EGFR, HER1). Антагонист ErbB рецептора может представлять собой антитело или его иммунотерапевтически эффективный фрагмент или неиммунобиологические молекулы, такие как пептид, полипептидный белок. Также сюда входят химические молекулы, тем не менее, предпочтительными антагонистами в соответствии с изобретением являются антитела к EGFR и антитела к HER2.

Предпочтительными антителами по изобретению являются антитела к Her1 и антитела к Her2, более предпочтительно антитела к Her1. Предпочтительные антитела к Herl представляют собой MAb 425, предпочтительно гуманизированное MAb 425 (hMAb 425, US 5558864; ЕР 0531472) и химерное MAb 225 (CETUXIMAB®). Наиболее предпочтительным является моноклональное антитело h425, которое обладает высокой эффективностью при лекарственной монотерапии в сочетании с уменьшенными нежелательными и побочными эффектами. Наиболее предпочтительным антителом к HER2 является HERCEPTIN®, выпускаемый Genentech/Roche. Эффективные антагонисты EGF рецептора в соответствии с изобретением также могут включать естественные или синтетические химические соединения. В качестве примеров предпочтительных молекул этой категории можно привести органические соединения, металлоорганические соединения, соли органических и металлорганических соединений. Примерами химических антагонистов HER2 рецептора являются: гетероарильные соединения, замещенные стирилом (US 5656655); бис- моно, и/или бициклические арильные гетероарильные, карбоциклические и гетерокарбоциклические соединения (US 5646153); трициклические пиримидиновые соединения (US 5679683); производные хиназолина, обладающие ингибиторной активностью по отношению к рецептору тирозинкиназы (US 5616582); гетероарилэтендиильные или гетероарилэтендииларильные соединения (US 5196446); соединение, обозначенное как 6-(2,6-дихлорфенил)-2-(4-(2-диэтил-аминоэтокси) фениламино)-8-метил-8Н-пиридо(2,3)-5-пиримидин-7-он (Panek, и др., 1997, J. Pharmacol. Exp. Therap. 283, 1433) ингибирующие семейства рецепторов EGFR, PDGFR, и FGFR.

Понятие "антагонист/ингибитор тирозинкиназы" согласно настоящему изобретению относится к естественным или синтетическим агентам, которые способны ингибировать или блокировать тирозинкиназы, включая рецептор тирозинкиназы. Таким образом, это понятие включает антагонисты/ингибиторы рецептора ErbB, как описано выше. За исключением антител к ErbB рецептору, упомянутых выше и ниже, более предпочтительными антагонистами тирозинкиназы, подпадающими под это определение, являются химические соединения, которые выявляют эффективность при лекарственной монотерапии при лечении рака молочной железы и предстательной железы. Приемлемые ингибиторы тирозинкиназы индолокарбазольного типа могут быть получены, используя информацию, приведенную в патентной литературе, такой как патенты US 5516771; 5654427; 5461146; 5650407. В патентах US 5475110; 5591855; 5594009 и заявке WO 96/11933 описаны ингибиторы тирозинкиназы и рака предстательной железы пирролокарбазольного типа. Одним из наиболее перспективных противоопухолевых средств в этом контексте является гефитиниб (IRESSA®, Astra Zeneca), который, как сообщалось, обладает значительной терапевтической эффективностью и прекрасной переносимостью у больных немелкоклеточным раком легких (NSCLC), а также прогрессирующим раком головы и шеи.

Предпочтительно, дозировка химических ингибиторов тирозинкиназы, указанных выше, составляет приблизительно от 1 пг/кг до 1 г/кг веса тела в сутки. Более предпочтительно, дозировка ингибиторов составляет от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг веса тела в сутки.

Биологические молекулы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой антитела или их фрагменты или любые модификации антител, такие как иммуноконъюгаты.

В этом контексте понятие "антитело" или "иммуноглобулин" применяется в изобретении в широком смысле и в частности относится к интактным моноклональным антителам, поликлональным антителам, многоспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), которые образуются по крайней мере из двух интактных антител, и к фрагментам антитела, при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность. Как правило, понятие включает гетероантитела, которые состоят из двух или более антител или их фрагментов с разной связывающей специфичностью, соединенных вместе.

В зависимости от аминокислотной последовательности их постоянных участков, интактные антитела могут быть отнесены к разным "классам антител (иммуноглобулинов)". Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них в дальнейшем могут быть разделены на "подклассы" (изотипы), например, lgG1, lgG2, IgG3, lgG4, IgA и lgA2. Постоянные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам антител, называются α, δ, ε, γ и µ соответственно. Предпочтительно основной класс антител в соответствии с изобретением представляет собой IgG, более подробно IgG1 и IgG2.

Антитела обычно представляют собой гликопротеины, которые имеют молекулярный вес приблизительно 150,000 и состоят из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей отличается в тяжелых цепях иммуноглобулинов разных изотипов. Каждая тяжелая и легкая цепь также регулярно соединены в пространстве междуцепочечными дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым расположено несколько постоянных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL) на одном конце и постоянный домен на ее другом конце. Постоянный домен легкой цепи совмещается с первым постоянным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи совмещается с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что специфические аминокислотные остатки образуют поверхность между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей. "Легкие цепи" антител у многих видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух явно отличных типов, которые называются каппа (к) и лямбда (X), на основании аминокислотных последовательностей их постоянных доменов.

Понятие "моноклональное антитело", как здесь применяется, относится к антителу, полученному из популяции, по существу, однородных антител, например, индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций, встречающихся в естественных условиях, которые могут присутствовать в единичном количестве. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными к отдельному антигенному участку. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело связывается с отдельной детерминатной в антигене. В связи с их специфичностью моноклональные антитела обладают преимуществами, так как могут быть синтезированы без загрязнения другими антителами. Способы получения моноклональных антител, включая гибридомный метод, описаны Kohler and Milstein (1975, Nature 256, 495) и в "Технологии моноклональных антител, получение и характеристика гибридом грызунов и людей" (1985, под ред. Burdon и др., Лабораторные технологии в биохимии и молекулярной биологии, том 13, научное издательство Элсевиер, Амстердам), или могут быть получены при помощи хорошо известных методов рекомбинантной ДНК (см., например, патент US 4816567). Моноклональные антитела также могут быть изолированы из библиотек фаговых антител, применяя, например, методику, описанную в Clackson и др., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks и др., J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991).

Понятие "химерное антитело" подразумевает антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной к соответствующим последовательностям антител, имеющим происхождение от отдельного вида или принадлежащим отдельному классу или подклассу антитела, в то время как остаток цепи(ей) является идентичным или гомологичным к соответствующим последовательностям антител, имеющим происхождение от другого вида или принадлежащим другому классу или подклассу антитела, а также фрагменты таких антител, при условии, что они выявляют необходимую биологическую активность (например: патент US 4816567; Morrison и др., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Способы получения химерных и гуманизированных антител также известны в данной области техники. Например, такие способы получения химерных антител описаны в патентах на имя Boss (Celltech) и Cabilly (Genentech) (патенты US 4816397; US 4816567).

"Гуманизированные антитела" представляют собой разновидность нечеловеческих (например, грызунов) химерных антител, которые включают минимальную последовательность, имеющую происхождение от нечеловеческого иммуноглобулина. Главным образом, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в котором остатки гипервариабельного участка (CDR) реципиента заменены остатками гипервариабельного участка вида, не относящегося к человеку (донорное антитело), такого как мышь, крыса, кролик или нечеловекообразная обезьяна, которые имеют необходимую специфичность, аффинность и функциональную активность. В некоторых случаях, остатки каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина заменяются соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации осуществляются для облегчения дальнейшей очистки антитела. В основном, гуманизированное антитело может содержать, по существу, все, по крайней мере один, и типично два вариабельных домена, в которых все или, по существу, все гипервариабельные петли соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или, по существу, все FR соответствуют таковым последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно также может содержать по крайней мере часть постоянного участка (Fc) иммуноглобулина, типично эта часть является частью иммуноглобулина человека. Способы получения гуманизированных антител описаны, например, Winter (US 5225539) и Boss (Celltech, US 4816397).

"Фрагменты антитела" включают часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антигенсвязывающий или вариабельный участок. Примеры фрагментов антитела включают Fab, Fab', F(ab')2, Fv и Fc фрагменты, дитела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител; и многоспецифичные антитела, образованные с фрагмента(ов) антител. "Интактное" антитело представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающий вариабельный участок, а также постоянный домен (CL) легкой цепи и постоянные домены тяжелой цепи, СН1, СН2 и СН3. Предпочтительно, интактное антитело выполняет одну или несколько эффекторных функций. При расщеплении антитела папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, которые называются "Fab" фрагментами, каждый из них включает один антигенсвязывающий участок и CL и СН1 участок и оставшийся "Fc" фрагмент, чье название отображает его способность к быстрой кристаллизации.

"Fc" участок антител, как правило, включает СН2, СН3 и петлевой участок IgG1 или IgG2 основного класса антител. Петлевой участок представляет собой группу с приблизительно 15 аминокислотных остатков, которая соединяет СН1 участок СН2-СНЗ участком. При обработке пепсином образуется "F(ab')2" фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих участка и сохраняет способность к перекрестному связыванию антигена.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный участок распознавания антигена и участок связывания антигена. Этот участок состоит из димера одной тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, которые плотно нековалентно присоединены. В этой конфигурации три гипервариабельных участка (CDR) каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка на поверхности VH - VL димера. Совместно, шесть гипервариабельных участков определяют антигенсвязывающую специфичность антитела. Тем не менее, даже один вариабельный домен (или половина Fv, которая включает только три гипервариабельных участка, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя с меньшим сродством по сравнению с целым антигенсвязывающим участком.

"Fab" фрагмент также включает постоянный домен легкой цепи и первый постоянный домен (СН1) тяжелой цепи и имеет только один антигенсвязывающий участок.

"Fab'" фрагменты отличаются от Fab фрагментов путем прибавления нескольких остатков к карбоксильному концу тяжелой цепи СН1 домена, включая один или больше цистеинов с петлевого участка антитела.

F(ab')2 фрагменты антитела необязательно образуют пары Fab' фрагментов при наличии цистеинов в петле между ними. Другие химические связывания фрагментов антитела также известны (см., например, Hermanson, Технология биоконъюгатов, Academic Press, 1996; US 4342566).

"Одноцепочечные Fv" или "scFv" фрагменты антитела включают V, и V, домены антител, в которых эти домены присутствуют в виде единичной полипептидной цепи. Предпочтительно, Fv полипептид также включает полипептидный линкер между VH и VL доменами, который дает возможность scFv приобретать необходимую для связывания антигена структуру. Одноцепочечные FV антитела известны, например, из Plückthun (The Pharmacology of Monoclobal al Antibodies, том. 113, под ред. Rosenburg и Moore eds.. Springer-Verlag, Нью Йорк, стр. 269-315 (1994)), WO 93/16185; US 5571894; US 5587458; Huston и др. (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 5879) или Skerra и Plueckthun (1988, Science 240, 1038).

Понятие "вариабельный" или "FR" относится к тому обстоятельству, что определенные части вариабельных доменов в значительной степени отличаются по своей последовательности в антителах и используются для связывания и специфичности каждого индивидуального антитела с его индивидуальным антигеном. Однако, вариабельность распределена неравномерно на всем протяжении вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, которые называются " гипервариабельными" участками вариабельных доменов как в легкой цепи, так и в тяжелой цепи. Наиболее высококонсервативные участки вариабельных доменов называются каркасными участками (FR). Вариабельные домены естественных тяжелых и легких цепей каждый включает четыре FR (FR1 - FR4), которые в значительной степени имеют β-складчатую конфигурацию, соединенные с тремя гипервариабельными участками, которые образуют связующие петли, и в некоторых случаях частично образуют β-складчатую структуру. Гипервариабельные участки в каждой цепи удерживаются вместе непосредственно близко при помощи FR и с гипервариабельными участками другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего участка антитела (см. Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-e изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Батезда, MD. (1991)). Постоянные домены непосредственно не вовлечены в связывание антитела с антигеном, но выполняют разные эффекторные функции, такие как участие антитела в антитело-зависимой клеточной токсичности (ADCC). Понятие "гипервариабельный участок" или "CDR" при использовании в изобретении, относится к аминокислотным остатками антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный участок, как правило, включает аминокислотные остатки с "комплементарного детерминирующего участка" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в легкой цепи вариабельного домена и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (НЗ) в тяжелой цепи гипервариабельного домена; и/или такие остатки с "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в легкой цепи вариабельного домена и 26-32 (HI), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в тяжелой цепи вариабельного домена; Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Каркасный участок" или "FR" остатки представляют собой такие остатки вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельного участка, как определяется в настоящем изобретении.

Понятие "моноспецифический" относится к антителам в соответствии с настоящим изобретением, в которых два связывающих участка антитела обладают одинаковой специфичностью, поэтому способны связываться с одним и тем же эпитопом на рецепторе. Предпочтительно, в соответствии с настоящим изобретением фармацевтическая композиция содержит моноспецифические антитела.

"Биспецифические антитела" (BAb) представляют собой отдельные, дивалентные антитела (или их иммунотерапевтически эффективные фрагменты), которые имеют два различных специфичных участка связывания антигена. В соответствии с настоящим изобретением, BAb характеризуются как BAb <MAb 1, MAb 2>, где <MAb 1> и <MAb 2> обозначают антигенсвязывающие участки, имеющие происхождение от MAb 1 и MAb 2. Например, первый участок связывания антигена представляет собой участок к рецептору ангиогенеза (например, интегрину или VEGF рецептору), тогда как второй участок связывания антигена представляет собой участок к рецептору ErbB (например, EGFR или HER2). Биспецифические антитела могут быть получены при помощи химических методов (см., например, Kranz и др. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807), при помощи "полидомной" технологии (см. патент US 4474893) или при помощи технологии рекомбинантной ДНК, которые все известны per se. Дополнительные методы описаны в WO 91/00360, WO 92/05793 и WO 96/04305. Биспецифические антитела также могут быть получены из одной цепи антитела (см., например, Huston и др. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 5879; Skerra и Plueckthun (1988) Science 240, 1038). Аналоги вариабельных участков антитела могут быть получены в виде единичной полипептидной цепи. Для образования биспецифического связывающего агента отдельные цепи антител могут быть связаны вместе при помощи химических методов или методов генетической инженерии, известных в данной области техники. Также представляется возможным получать биспецифические антитела в соответствии с настоящим изобретением при помощи использования последовательностей лейциновой застежки. Применяемые последовательности являются производными участков лейциновой застежки факторов транскрипции Fos и Jun (Landschulz и др., 1988, Science 240, 1759; см. обзор Maniatis и Abel, 1989, Nature 341, 24). Лейциновые застежки представляют собой специфические аминокислотные последовательности длиной приблизительно 20-40 остатков, в которых лейцин обычно встречается в каждом седьмом остатке. Такая последовательность застежки образует алифатическую α-спираль с остатками лейцина, расположенными в гидрофобном участке для образования димера. Соответствующие пептиды для лейциновых застежек протеинов Fos и Jun предпочтительно образуют гетеродимеры (O'Shea и др., 1989, Science 245, 646). Биспецифические антитела, которые содержат застежки, и способы их получения также описаны в WO 92/10209 и WO 93/11.162.

Понятие "слитый протеин" относится к естественной или синтетической молекуле, включающей одну или больше биологических молекул, как определено выше, в которых две или больше пептидные молекулы или белковые молекулы (включая гликопротеины), обладающие различной специфичностью, связаны вместе необязательно химическими или аминокислотными линкерными молекулами. Соединение может осуществляться путем C-N слияния или N-C слияния (в направлении 5'→3'), предпочтительно C-N слияния. Однако предпочтительные слитые протеины в соответствии с изобретением представляют собой иммуноконъюгаты, как определено ниже.

Понятие "иммуноконъюгат" относится к слитому белку и обозначает антитело или иммуноглобулин, соответственно, или его иммунотерапевтически эффективный фрагмент, которое соединено ковалентной связью с иммунологически неактивной молекулой. Предпочтительно эта присоединенная часть представляет собой пептид или протеин, который может быть гликозирилирован. Указанная молекула, которая не представляет собой антитело, может присоединяться к С-концу постоянных тяжелых цепей антитела или к N-концам вариабельных легких и/или тяжелых цепей. Присоединенные части могут быть связаны посредством линкерной молекулы, которая представляет собой, как правило, полипептид, который включает 3-15 аминокислотных остатков. Иммуноконъюгаты в соответствии с настоящим изобретением представляют собой слитые протеины, содержащие иммуноглобулин или его иммунотерапевтически эффективный фрагмент к рецептору ErbB, и предпочтительно цитокин, такой как TNFα, IFNγ или IL-2, или другое токсическое средство. Предпочтительно, эти пептидные или белковые молекулы связаны их N-концом с С-концом указанного иммуноглобулина, который представляет собой его Fc часть.

"Гетероантитела" представляют собой слитые белки, содержащие, по существу, два или более антител или связывающих фрагментов антител, которые связаны вместе при помощи регулярных поперечных связующих химических молекул, каждое из указанных антител обладает разной связывающей специфичностью. Гетероантитела могут быть получены при помощи совместного конъюгирования двух или более антител или фрагментов антител. Предпочтительно гетероантитела включают перекрестно связанные Fab/Fab' фрагменты. Для конъюгирования антител могут применятся разные связующие или поперечно-сшивающие агенты. Примерами являются белок А, карбоимид, N-сукцинимидил-3-ацетил-тиоацетат (SATA) и N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP) (см. например, Karpovsky и др. (1984) J. EXP. Med. 160, 1686; Liu и др. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8648). Другие подобные методы описаны Paulus, Behring Inst. Mitt., №. 78, 118 (1985); Brennan и др. (1985) Science 30, 81 или Glennie и др. (1987) J. Immunol. 139, 2367. Другим способом является применение о-фенилендималеимида (oPDM) для связывания трех Fab' фрагментов (WO 91/03493). Многоспецифичные антитела в контексте настоящего изобретения также являются приемлемыми и могут быть получены, например, в соответствии с исследованием WO 94/13804 и WO 98/50431. Предпочтительным гетероантителом в соответствии с настоящим изобретением является слитый белок, содержащий два антитела к EGFR (каждое антитело направлено к разных эпитопам одного и того же рецептора), связанных вместе, как описано (например МАВ 425 - МАВ 225).

Понятие "цитокин" представляет собой общий термин для белков, которые высвобождаются одной популяцией клеток и воздействуют на другую клетку в качестве междуклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и обычные полипептидные гормоны. Цитокинами также являются гормоны роста, такие как человеческий гормон роста, N-метионильный человеческий гормон роста и гормон роста крупного рогатого скота; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулируюший гормон (FSH), тиреотропный гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; лактоген плаценты; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов, такие как NGFβ; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGFα и TGFβ; эритропоэтин (ЕРО); интерфероны, такие как IFNα, IFNβ и IFNγ; колониестимулирующие факторы, такие как M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины, такие как IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; и TNFα или TNFβ. Предпочтительные цитокины в соответствии с изобретением представляют собой интерфероны, TNFα и IL-2.

"Эффекторные функции" антитела относятся к таким биологическим активностям, которые определяются Fc участком (естественной последовательностью Fc участка или аминокислотной последовательностью варианта Fc участка) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают цитотоксичность, зависимую от комплемента, связывание Fc с рецептором, антитело-зависимую цитотоксичность, опосредованную клетками (ADCC), фагоцитоз; ингибирующую регуляцию рецепторов поверхности клеток (например, рецептора В-клеток) и т.д.

Понятие "ADCC" (антитело-зависимая цитотоксичность, опосредованная клетками) относится к опосредованной клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, естественные киллерные (NK) клетки, нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Для оценки ADCC активности молекул, которая представляет интерес, могут применятся исследования ADCC in vitro, такие, как описанные в уровне техники (патенты US 5500362; US 5821337). Подходящие эффекторные клетки для таких исследований включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные киллерные (NK) клетки.

Понятие "Fc рецептор" или "FcR" применяется для описания рецептора, которые связывается с Fc участком антитела. Предпочтительные FcR представляют собой естественную последовательность человеческого FcR. Кроме того, предпочтительный FcR представляет собой такой, который связывает IgG антитело (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII, и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно усиленные формы этих рецепторов. Обзоры относительно FcR приведены, например, в Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991).

Терапевтический подход согласно настоящему изобретению включает в качестве специфического варианта осуществления введение дополнительных терапевтически эффективных средств, которые способствуют желательному действию, например, являются токсичными по отношению к опухолям или обладают цитостатическим действием, или уменьшают или предотвращают нежелательные побочные действия. Таким образом, изобретение охватывают комбинацию таких средств с фармацевтической композицией, которая описана и заявляется ранее и в дальнейшем, где указанные средства могут представлять собой другие антагонисты рецептора ErbB, антагонисты рецептора VEGF, цитокины, цитокины-иммуноконъюгаты, антиангиогенные средства, антигормональные средства или цитотоксические средства в целом. Также объектом настоящего изобретения является сочетание композиций, как описано в изобретении, с лучевой терапией в соответствии с известными способами.

Понятие "цитотоксическое средство", как применятся здесь, является очень широким и относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток (гибель клеток), и/или обладает противоопухолевым / антипролиферативным действиями, например, прямо или косвенно препятствует развитию, созреванию или распространению злокачественных опухолевых клеток. Это понятие охватывает, кроме того, такие средства, которые обладают только цитостатическим действием, а также средства, которые обладают другим действием.

Понятие также включает химиотерапевтические средства, как описано далее, а также другие ErbB антагонисты (такие как антитела к ErbB), антиангиогенные средства, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы протеинкиназы А, представители семейства цитокинов, радиоактивные изотопы и токсины, такие как ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения.

Понятие "химиотерапевтическое средство" является подклассом "цитотоксического средства" и охватывает, в частности, химические средства, которые обладают противоопухолевыми действиями, предпочтительно непосредственно воздействуя на клетки опухоли и в меньшей степени непрямо воздействуя при помощи механизмов, таких как модификация биологической ответной реакции. Приемлемые химиотерапевтические средства в соответствии с изобретением предпочтительно представляют собой естественные или синтетические химические соединения. Существует много противоопухолевых химических средств, которые являются коммерчески доступными, исследованы в клинических условиях и в доклинических условиях, которые могут быть включены в настоящее изобретение для лечения опухолей/новообразований при комбинированной терапии с антагонистами рецепторов, как заявляется и описано в настоящем изобретении. Следует обратить внимание на то, что химиотерапевтические средства могут вводиться необязательно совместно с указанными антагонистами рецептора ErbB, предпочтительно указанными антителами к EGFR в соответствии с изобретением.

Примерами химиотерапевтических средств являются алкилирующие агенты, например, азотистые иприты, этилениминовые соединения, алкилсульфонаты и другие соединения с алкилирующим действием, такие как нитрозомочевины, цисплатин и дакарбазин; антиметаболиты, например, фолиевая кислота, антагонисты пурина или пиримидина; ингибиторы митоза, например, алкалоиды барвинка и производные подофиллотоксина; цитотоксические антибиотики и производные камптотецина.

Предпочтительные химиотерапевтические средства включают амифостин (этиол), цисплатин, дакарбазин (DTIC), дактиномицин, мехлорэтамин HCl (азотистый иприт), стрептозоцин, циклофосфамид, каррнустин (BCNU), ломустин (CCNU), доксорубицин (адриамицин), липодоксорубицин (доксил), гемцитабин (гемзар), даунорубицин, липодаунорубицин (дауноксом), прокарбазин, митомицин, цитарабин, этопозид, метотрексат, 5-фторурацил (5-FU), винбластин, винкристин, блеомицин, паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер), альдеслейкин, аспарагиназа, бисульфан, карбоплатин, кладрибин, камптотецин, СРТ-11,10-гидрокси-7-этил-камптотецин (SN38), гефитиниб (Iressa), дакарбазин, флоксуридин, флударабин, гидроксимочевина, ифосфамид, идарубицин, месна, альфа-интерферон, бета-интерферон, иринотекан, митоксантрон, топотекан, лейпролид, мегестрол, мельфалан, меркапропурин, пликамицин, митотан, пегаспаргас, пентостатин, пипоброман, пликамицин, стрептозоцин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, 5-[бис-(2-хлорэтил)амино]урацил, винорелбин, хлорамбуцил и их сочетания.

Наиболее предпочтительными химиотерапевтическими средствами в соответствии с изобретением являются цисплатин, гемцитабин, доксорубицин, паклитаксел (таксол) и блеомицин.

"Антиангиогенное средство" относится к естественному или синтетическому соединению, которое блокирует или в некоторой степени препятствует развитию кровеносных сосудов. Антиангиогенная молекула может, например, являться биологически активной молекулой, которая связывается и блокирует ангиогенный фактор роста или рецептор фактора роста. Предпочтительная антиангиогенная молекула при этом связывается с рецептором, предпочтительно рецептором интегрина или рецептором VEGF. Понятие в соответствии с изобретением также включает пролекарства указанного антиангиогенного средства. Понятие, кроме того, включает средства, действующие, как описано выше, которые также классифицированы как цитотоксические, предпочтительно, химиотерапевтические средства.

Существует много молекул, которые имеют разную структуру и исходный участок, который определяет антиангиогенные свойства. Более предпочтительные классы средств, которые ингибируют или блокируют ангиогенез, которые являются подходящими в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой, например:

(i) антимитотические средства, такие как фторурацил, митомицин-С, таксол;

(ii) метаболиты эстрогена, такие как 2-метоксиэстрадиол;

(iii) ингибиторы матриксной металлопротеиназы (ММР), которые ингибируют цинкметаллопротеиназы (металлопротеазы) (например, бетимастат, ВВ16, TIMP, миноциклин, GM6001 или описанные в "Inhibition of Matrix Metalloproteinases: Therapeutic Applications" (Golub, Ежегодник Нью-йоркской Академии наук, том 878а; Грюневолд, Zucker (ред.), 1999);

(iv) антиангиогенные многофункциональные средства и факторы, такие как IFNα (патенты US 4530901; 4503035; 5231176); фрагменты ангиостатина и плазминогена (например kringle 1-4, kringle 5, kringle 1-3 (O'Reilly, M. S. и др. Cell (Кембридж, Mass.) 79(2): 315-328, 1994; Сао и др., J. Biol. Chem. 271: 29461-29467, 1996; Сао и др., J. Biol Chem 272: 22924-22928, 1997); эндостатин (O'Reilly, M.S. и др., Cell 88(2), 277, 1997 и WO 97/15666), тромбоспондин (TSP-1; Frazier, 1991, Curr Opin Cell Biol 3(5): 792); тромбоцитарный фактор 4 (PF4);

(v) ингибиторы активатора плазминогена/урокиназы;

(vi) антагонисты рецептора урокиназы,

(vii) гепариназы;

(viii) аналоги фумагиллина, такие как TNP-470;

(ix) ингибиторы тирозинкиназы, такие как SUI 01. Многие из выше- и нижеупомянутых антагонистов рецептора ErbB (антагонисты EGFR/HER2) также являются ингибиторами тирозинкиназы и могут демонстрировать, следовательно, блокирующую активность по отношению к рецептору EGF, что приводит к ингибированию роста опухоли, так же как и антиангиогенную активность, в результате чего происходит ингибирование развития кровеносных сосудов и эндотелиальных клеток соответственно);

(х) сурамин и аналоги сурамина,

(xi) ангиостатические стероиды;

(xii) антагонисты VEGF и bFGF;

(xiii) антагонисты рецептора VEGF, такие как антитела к рецептору VEGF (DC-101);

(xiv) flk-1 uflt-1 антагонисты;

(xv) ингибиторы циклооксигеназы-II, такие как СОХ-II;

(xvi) антагонисты интегрина и антагонисты рецептора интегрина, такие как αv антагонисты и антагонисты αv рецептора, например, антитела к рецептору αv и RGD пептиды. Предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением являются антагонисты интегрина (рецептора). Понятие "антагонисты/ингибиторы интегрина" или "антагонисты/ингибиторы рецептора интегрина" относится к естественной или синтетической молекуле, которая блокирует и ингибирует рецептор интегрина. В некоторых случаях, понятие включает антагонисты к лигандам указанных рецепторов интегрина (такие как для α_vβ₃: витронектин, фибрин, фибриноген, фактор Виллербранда, тромбоспондин, ламинин; для α_vβ₅: витронектин; для α_vβ₁: фибронектин и витронектин; для α_vβ₆: фибронектин).

Предпочтительными в соответствии с изобретением являются антагонисты к рецепторам интегрина. Антагонисты интегрина (рецептора) могут представлять собой естественные или синтетические пептиды, непептиды, пептидомиметики, иммуноглобулины, такие антитела или их функциональные фрагменты, или иммуноконъюгаты (слитые белки).

Предпочтительными в соответствии с изобретением ингибиторами интегрина являются такие, которые связываются с рецептором α_v интегринов (например α_vβ₃, α_vβ₅, α_vβ₆ и подклассов). Предпочтительными ингибиторами интегрина являются α_v антагонисты и, в частности, α_vβ₃ антагонисты. Предпочтительными α_v антагонистами в соответствии с изобретением являются RGD пептиды, пептидомиметики (непептидные) антагонисты и антитела к интегриновому рецептору, такие как антитела, блокирующие α_v рецепторы. Типичные неиммунологические антагонисты α_vβ₃ описаны в исследованиях в патентах US 5753230 и US 5766591. Предпочтительные антагонисты представляют собой линейные и циклические пептиды, которые содержат RGD. Циклические пептиды являются, как правило, более стабильными и обладают увеличенным периодом полужизни в сыворотке. Наиболее предпочтительным антагонистам интегрина по изобретению, тем не менее, является цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (EMD 121974, Cilengitide®, Merck KgaA, Германия; ЕР 0770622), который является эффективным блокатором рецепторов

интегрина α_vβ₃, α_vβ₁, α_vβ₆, α_vβ₈, α_IIbβ₃.

Подходящие пептидные антагонисты, а также пептидомиметические (непептидные) антагонисты α_vβ₃/α_vβ₅/α_vβ₆ рецептора интегрина описаны в научной и патентной литературе. Например, на них ссылаются Hoekstra и Poulter, 1998, Curr. Med. Chem. 5, 195; WO 95/32710; WO 95/37655; WO 97/01540; WO 97/37655; WO 97/45137; WO 97/41844; WO 98/08840; WO 98/18460; WO 98/18461; WO 98/25892; WO 98/31359; WO 98/30542; WO 99/15506; WO 99/15507; WO 99/31061; WO 00/06169; ЕР 0853084; ЕР 0854140; ЕР 0854145; US 5780426; и US 6048861. Заявки на патенты, в которых описаны бензазепины, а также родственные бензодиазепины и бензоциклогептены, являющиеся антагонистами рецептора интегрина α_vβ₃, которые также являются пригодными для применения в соответствии с настоящим изобретением, включают WO 96/00574, WO 96/00730, WO 96/06087, WO 96/26190, WO 97/24119, WO 97/24122, WO 97/24124, WO 98/15278, WO 99/05107, WO 99/06049, WO 99/15170, WO 99/15178, WO 97/34865, WO 97/01540, WO 98/30542, WO 99/11626 и WO 99/15508. Другие антагонисты рецептора интегрина, характеризующиеся ограниченными изменениями структуры основного кольца, описаны в WO 98/08840; WO 99/30709; WO 99/30713; WO 99/31099; WO 00/09503; US 5919792; US 5925655; US 5981546; и US 6017926. В US 6048861 и WO 00/72801 описан ряд производных нонановых кислот, которые являются сильными антагонистами рецептора интегрина α_vβ₃. Другие химически небольшие молекулы антагонистов интегрина (главным образом антагонистов витронектина) описаны в WO 00/38665. Для других антагонистов рецептора α_vβ₃ показано, что они являются эффективными ингибиторами ангиогенеза. Например, синтетические антагонисты рецептора, такие как (S)-10,11-дигидро-3-[3-(пиридин-2-иламино)-1-пропилокси]-5Н-дибензо[а,d]циклогептен-10-уксусная кислота (известная как SB-265123) исследовалась в разных модельных системах на млекопитающих. (Keenan и др., 1998, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(22), 3171; Ward и др., 1999, Drug Metab. Dispos. 27(11), 1232). Исследования для идентификации антагонистов интегрина, подходящих для применения в качестве антагониста, описаны, например Smith и др., 1990, J. Biol. Chem. 265,12267, и в цитируемой патентной литературе. Антитела к рецептору интегрина также хорошо известны. Подходящие моноклональные антитела к интегрину (например, α_vβ₃, α_vβ₅, α_vβ₆) могут быть модифицированы для усовершенствования их антигенсвязывающего фрагмента, включая F(ab)2, Fab, и конструированный Fv или одноцепочечное антитело. Подходящее и предпочтительно применяемое моноклональное антитело к рецептору интегрина α_vβ₃ было идентифицировано как LM609 (Brooks и др., 1994, Cell 79, 1157; АТСС НВ 9537). Эффективное специфическое антитело к α_vβ₅, P1F6, описанное в WO 97/45447, также является предпочтительным в соответствии с данным изобретением. Также приемлемым селективным α_vβ₆ антителом является MAb 14D9.F8 (WO 99/37683, DSM ACC2331, Merck KGaA, Германия), а также MAb 17.E6 (ЕР 0719 859, DSM ACC2160, Merck KGaA), которые селективны к α_v-цепи рецепторов интегрина. Другим подходящим антителом к интегрину является коммерчески доступный Vitraxin®.

Как используется в настоящем описании, понятие "антигормональное средство" включает естественные или синтетические органические или пептидные соединения, которые действуют как регуляторы или ингибиторы гормональной активности в опухолях. Более подробно, "антигормональное средство" (1) ингибирует выработку сывороточных андрогенов, (2) блокирует связывание сывороточных андрогенов с рецепторами андрогенов, или (3) ингибирует превращение тестостерона в DHT, или комбинации двух или более таких соединений. Антигормональное средство в соответствии с изобретением включает в общем антагонисты стероидного рецептора и, более подробно, антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ароматазу, ингибирующую 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалютамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных соединений. Понятие также включает агонисты и/или антагонисты гликопротеиновых гормонов, таких как фолликулостимулирующего гормона (FSH), тиреотропного гормона (TSH) и лютеинизирующего гормона (LH) и LHRH (рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона). Агонист LHRH, пригодный в соответствии с изобретением, представляет собой ацетат гозерелина, коммерчески доступный под наименованием ZOLADEX® (Zeneca). Другим примером пригодного антагониста LHRH является GANIRELIX© (Roche/Akzo Nobel). Примерами стероидных антиандрогенов являются ципротеронацетат (СРА) и мегестролацетат, коммерчески доступный под наименованием MEGACE® (Bristol-Myers Oncology). Стероидные антиандрогены могут блокировать рецепторы андрогенов предстательной железы. Также они могут ингибировать высвобождение LH. СРА предпочтительно вводятся пациентам в дозах от 100 мг/в сутки до 250 мг/в сутки. Нестероидные антиандрогены блокируют рецепторы андрогенов. Также они могут вызвать увеличение уровней в сыворотке LH и тестостерона. Предпочтительным нестероидным антиандрогеном является флютамид (2-метил-N-[4-нитро-3-(трифторметил)фенил пропанамид), коммерчески доступный под наименованием EULEXIN® (Schering Corp.). Флютамид оказывает антиандрогенное действие путем ингибирования поглощения андрогена, путем ингибирования связывания андрогена с ядром в тканях-мишенях или путем обоих механизмов. Другим нестероидным антиандрогеном является нилютамид, его химическое название следующее: 5,5-диметил-3-[4-нитро-3-(трифторметил-4'-нитрофенил)-4,4-диметил-имидазолидин-дион. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения антигормональное средство представляет собой сочетание LHRH агониста, такого как лейпролидацетат, и антиандрогена, такого как флютамид или нилютамид. Например, лейпролидацетат может вводиться подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекцией, и одновременно флютамид может вводиться перорально. Антигормональные средства в соответствии с изобретением включают, как указано выше, антагонисты рецепторов стероидных/тиреодных гормонов, включая антагонисты других непермиссивных рецепторов, такие как антагонисты RAR, TR, VDR и подобные. Как очевидно для специалиста в данной области техники, разнообразные антагонисты рецепторов ретиноевой кислоты (RAR), как синтетические, так и встречающиеся в природе, могут применяться в соответствии с настоящим изобретением.

В итоге, фармацевтические композиции и наборы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно могут включать следующие сочетания лекарственных средств:

(i) два различных моноклональных антитела (MAb), их фрагменты или иммуноконъюгаты (предпочтительно иммуноцитокины), направленные на различные эпитопы рецептора EGF;

(ii) MAb 425 и MAb 225 или их фрагменты или иммуноконъюгаты (предпочтительно иммуноцитокины), каждое из которых направлено на различные эпитопы рецептора EGF;

(iii) гуманизированное MAb 425 и химерное 225 или их фрагменты или иммуноконъюгаты (предпочтительно иммуноцитокины), каждое из которых направлено на различные эпитопы рецептора EGF;

(iv) (i)-(iii) в сочетании с одним или несколькими цитотоксическими средствами,

(v) (i)-(iii), в особенности MAb 425 и MAb 225 в мышиной, химерной или гуманизированной модификациях или их фрагменты или иммуноконъюгаты (предпочтительно иммуноцитокины), в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, предпочтительно цисплатином, гемцитабином или таксолом;

(vi) (i)-(iii), в особенности MAb 425 и MAb 225 в мышиной, химерной или гуманизированной модификациях или их фрагменты или иммуноконъюгаты (предпочтительно иммуноцитокины), в сочетании с другим антагонистом ErbB;

(vii) (i)-(iii), в особенности MAb 425 и MAb 225 в мышиной, химерной или гуманизированной модификациях или их фрагменты или иммуноконъюгаты (предпочтительно иммуноцитокины), в сочетании с антителом, направленным на ErbB-2, предпочтительно Herceptin®, или ErbB3, ErbB4;

(viii) (i)-(iii), в особенности MAb 425 и MAb 225 в мышиной, химерной или гуманизированной модификациях или их фрагменты или иммуноконъюгаты (предпочтительно иммуноцитокины), в сочетании с лекарственными средствами, выбранными из следующих групп:

- ингибиторов тирозинкиназы, таких как Iressa®;

- антиангиогенных средств, предпочтительно ингибиторов интегрина, более предпочтительно RGD пептидов, включая циклические пептиды, такие как цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (Cilengitide®, Merck KGaA);

- антител к рецептору VEGF, таких как DC-101, или VEGF антагонистов;

- ингибиторов COX-II;

- цитокинов, таких как TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2;

- ингибиторов протеинкиназы А типа I (PKAI), таких как смешанные антисмысловые основные олигонуклеотиды, такие как HYB 165 (см., например, Tortora и др., 1999, Clin. Cancer Res., 875-881);

- антигормональных средств, таких как гозерелин, бозерелин, лейпрорелин, тамоксифен.

Понятия "рак" и "опухоль" относятся или описывают физиологические состояния у млекопитающих, которые обычно характеризуются нерегулируемым клеточным ростом. При помощи фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением можно лечить опухоли, такие как опухоли молочной железы, сердца, легких, тонкой кишки, толстой кишки, селезенки, почек, мочевого пузыря, головы и шеи, яичников, предстательной железы, головного мозга, поджелудочной железы, кожи, костей, костного мозга, крови, тимуса, матки, яичек, шейки матки и печени. Более специфично опухоль выбирают из группы, включающей аденому, ангиосаркому, астроцитому, эпителиальную карциному, герминому, глиобластому, глиому, гамартому, гемангиоэндотелиому, гемангиосаркому, гематому, гепатобластому, лейкоз, лимфому, медуллобластому, меланому, нейробластому, остеосаркому, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому и тератому. Более подробно, опухоль выбирают из группы, включающей акральную лентигинозную меланому, старческий кератоз, аденокарциному, аденокистозную карциному, аденомы, аденосаркому, аденосквамозную карциному, опухоли астроцитов, карциному бартолиновых желез, базально-клеточный рак, альвеолярно-клеточный рак, капиллярную, карциноидную опухоль, карциному, карциносаркому, кавернозную, холангио-карциному, хондросаркому, папиллому/карциному хориоидного сплетения, почечно-клеточный рак, цистаденому, опухоль ентодермальной полости, гиперплазию эндометрия, эндометриальную саркому, аденокарциному эндометрия, эпендимальную, эпителиоидную, саркому Эвинга, фибропластинчатую, фокальную узелковую гиперплазию, ульцерогенную аденому поджелудочной железы, опухоли половых клеток, глиобластому, глюкагоному, гемангибластому, гемангиоэндотелиому, гемангиому, аденому печени, аденоматоз печени, печеночно-клеточный рак, инсулиному, интаэпителиальную неоплазию, преинвазионную сквамозно-клеточную неоплазию, инвазивную сквамозно-клеточную карциному, крупноклеточную карциному, лейомиосаркому, ограниченную злокачественную меланому, злокачественную меланому, злокачественные мезотелиальные опухоли, медуллобластому, медуллоэпителимоу, меланому, менингеальную, мезотелиальную, метастатическую карциному, слизеобразующий плоскоклеточный рак, нейробластому, нейроэпителиальную аденокарциному узелковую меланому, овсяновидно-клеточную карциному, олигодендроглиальную, остеосаркому, полипептид поджелудочной железы, папиллярную серозную аденокарциному, пинеалоцитные, гипофизарные опухоли, плазмацитому, ложную саркому, бластому легких, рак почки, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому, серозную карциному, мелкоклеточный рак, мягкотканевые карциномы, опухоль, секретирующую соматостатин, сквамозную карциному, плоскоклеточный рак, субмезотелиальную, поверхностную распространяющуюся меланому, недифференцированную карциному, увеальную меланому, сосочковую карциному, випому, хорошо дифференцированную карциному и аденосаркому почки (опухоль Вильмса).

Опухоли, которые предпочтительно могут поддаваться лечению при помощи молекул антител в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой солидные опухоли или опухолевые метастазы, которые экспрессируют рецепторы ErbB, в особенности рецепторы ErbB1, в больших количествах, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы, рак головы и шеи, SCLC, рак поджелудочной железы.

Понятие "биологически/функционально эффективное" или "терапевтически эффективное (количество)" относится к лекарственному средству/молекуле, которое вызывает биологическую функцию или изменяет биологическую функцию в условиях in vivo или in vitro и которое эффективно в специфическом количестве для лечения заболевания или расстройства у млекопитающего, предпочтительно у человека. В случае злокачественного заболевания терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать количество раковых клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (то есть несколько замедлять распространение и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (то есть несколько замедлять распространение и предпочтительно останавливать) метастазирование опухолей; ингибировать, несколько замедлять, рост опухоли; и/или ослаблять распространение одного или более симптомов, связанных с раком. В этом отношении лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. При терапии рака эффективность, например, может определяться путем измерения времени прогрессирования заболевания (ТТР) и/или измерения ответной реакции (RR).

Понятие "иммунотерапевтически эффективное" относится к биологическим молекулам, которые вызывают иммунный ответ у млекопитающего. Более конкретно, понятие относится к молекулам, которые могут распознавать и связывать антиген. Типично, антитела, фрагменты антител и слитые белки антитела, которые включают их антигенсвязывающие участки (комплементарные определяющие участки, CDR), являются иммунотерапевтически эффективными.

"Лучевая терапия". В соответствии с изобретением опухоли дополнительно могут подвергаться лечению при помощи облучения или радиоактивных лекарственных средств. Источник радиации может быть наружным или внутренним для пациента, который поддается лечению. Если источник является наружным для пациента, то это такое лечение известно как наружная лучевая терапия (EBRT). Если источник радиации является внутренним для пациента, то такое лечение называется брахитерапия (ВТ). Некоторые характерные радиоактивные атомы, которые могут применятся, включают радий, цезий-137, и иридий-192, америций-241 и золото-198, кобальт-57; медь-67; технеций-99; йодид-123; йодид-131; и индий-111. Также можно метить средства в соответствии с изобретением радиоактивными изотопами. В настоящее время лучевая терапия представляет собой стандартное лечение для контроля неудалимых или неоперабельных опухолей и/или метастаз опухолей. Улучшенные результаты наблюдаются при сочетании лучевой терапии с химиотерапией. Лучевая терапия основывается на принципе, что радиация в высоких дозах в зонах облучения вызывает гибель репродуктивных клеток как опухолевых, так и нормальных тканей. Полученная доза радиации в основном определяется на основе поглощенной дозы (рад), времени и фракционирования, и может быть тщательно определена онкологом. Количество ионизирующей радиации, полученной пациентом, зависит от разнообразных соображений, однако двумя наиболее важными соображениями являются локализация опухоли по отношению к другим критическим структурам или органам тела, и протяженность распространения опухоли. Предпочтительным курсом лечения для пациента, который подвергается лучевой терапии, является лечение на протяжении периода 5-6 недель в общей дозе 50-60 Гр, которой облучается пациент в виде единичных дневных фракций по 1,8-2,0 Гр, 5 дней в неделю. Гр представляет собой сокращение от Грей и относится к дозе в 100 рад. Если опухоли подвергают лечению при помощи антител к ErbB, как описано в настоящем изобретении, в условиях осуществления лучевой терапии, то обычно можно наблюдать положительное или даже синергетическое действие. Другими словами, ингибирование роста опухоли при воздействии указанными соединениями усиливается при комбинации с действием радиации и/или химиотерапевтических средств. Лучевая терапия необязательно может применяться в соответствии с изобретением. Это рекомендуется и является предпочтительным в случаях, в которых пациенту не может быть введено достаточного количества средств в соответствии с изобретением.

"Фармацевтическое лечение". Способ по изобретению включает разнообразные воздействия для практического воплощения изобретения поэтапно. Например, средства в соответствии с изобретением могут вводиться одновременно, последовательно или отдельно. Кроме того, средства могут вводиться раздельно в течение интервала времени приблизительно 3 недели между введениями, например, от в основном введения непосредственно после введения первого средства до приблизительно 3 недель после введения первого средства. Способ можно осуществлять после хирургического вмешательства. Альтернативно, хирургическое вмешательство можно осуществлять на протяжении интервала между введением первого активного средства и второго активного средства. Примером этого метода является комбинация способа согласно настоящему изобретению с хирургическим удалением опухоли. Лечение в соответствии со способом обычно включает введение терапевтических композиций путем одного или нескольких циклов введения. Например, если осуществляется одновременное введение, терапевтическая композиция, которая включает оба средства, вводится на протяжении периода от приблизительно двух дней до приблизительно трех недель за один цикл. После этого цикл лечения может повторятся, если в этом есть необходимость, учитывая решение лечащего врача. Подобным образом, если осуществляется последовательное введение, то время введения каждого индивидуального терапевтического вещества устанавливается на основании идентичного периода времени. Интервал между циклами может изменятся от 0 до 2 месяцев.

Средства по настоящему изобретению могут вводиться парентерально путем инъекции или постепенной инфузии на протяжении периода времени. Несмотря на то, что тканей, подвергающихся лечению, обычно можно достичь при системном для организма введении, и более того, наиболее часто при лечении используется внутривенное введение терапевтических препаратов, другие ткани и средства доставки также рассматриваются, при вероятности того, что ткани-мишени содержат целевые молекулы. Таким образом, средства по настоящему изобретению могут вводиться внутриглазно, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, внутриполостно, чрезкожно, путем ортотопической инъекции или инфузии, и также может доставляться при помощи перистальтики. Терапевтические композиции содержат, например, антагонист интегрина по данному изобретению и обычно вводятся внутривенно, например, в виде инъекции стандартной дозы. Терапевтические композиции по настоящему изобретению содержат физиологически переносимый носитель совместно с соответствующим средством, как описывается здесь, растворенным или диспергированым в нем в качестве активного компонента.

Как применяется в данном изобретении, понятие "фармацевтически приемлемый" относится к композициям, носителям, разбавителям и реактивам, которые представляют вещества, допускающие их введение млекопитающему без проявления нежелательных физиологических действий, таких как тошнота, головокружение, желудочные расстройства и подобные. Приготовление фармацевтической композиции, которая содержит активные компоненты в растворенном или диспергированом виде, понятно в данной области техники и не должно ограничиваться на основании состава. Обычно такие композиции приготавливают в виде инъецируемых, жидких растворов или суспензий, однако, твердые формы, подходящие для растворов или суспензий, могут также быть приготовлены в виде раствора до использования. Составы также могут быть эмульгированы. Активный компонент может быть смешан с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимые с активным компонентом и в количествах, подходящих для применения в терапевтических методах, описанных в изобретении. Подходящие наполнители представляют собой, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин, этанол и подобные и их сочетания. Кроме того, при необходимости, композиция может включать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, буферные вещества и подобные, которые усиливают эффективность активного компонента. Терапевтические композиции согласно настоящему изобретению могут включать фармацевтически приемлемые соли компонентов, описанных в изобретении. Фармацевтически приемлемые соли включают кислото-аддитивные соли (образованные свободной аминогруппой полипептида), которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислота, или такими органическими кислотами, как уксусная, винная, миндальная и подобные. Соли, образованные свободной карбоксильной группой, также могут являться производными неорганических оснований, таких как, например, гидроокиси натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п. Более предпочтительными являются соли с HCl, если в составе применяются циклические пептидные антагонисты αv. Физиологически переносимые носители являются хорошо известными в данной области техники. Примерами жидких носителей являются стерильные водные растворы, которые не содержат других веществ, кроме активных компонентов и воды, или содержат буфер, такой как натрий-фосфатный при физиологическом значении рН, физиологический раствор или оба, такой как фосфатный буфер и физиологический раствор. Кроме того, дополнительно, водные носители могут включать более чем одну буферную соль, а также соли, такие как хлориды натрия и калия, декстрозу, полиэтиленгликоль и другие растворенные вещества. Жидкие композиции также могут включать жидкие фазы в дополнение к и исключая воду. Примерами таких дополнительных жидких фаз являются глицерин, растительные масла, такие как хлопковое масло, и водно-масляные эмульсии.

Обычно, терапевтически эффективное количество иммунотерапевтического средства, например, в виде антитела, блокирующего рецептор ErbB (ErbB1), антитела, блокирующего рецептор интегрина или фрагмента антитела или конъюгата антитела или антитела, блокирующего VEGF рецептор, фрагмента или конъюгата, представляет собой такое количество, которого при введении в физиологически переносимой композиции достаточно для достижения концентрации в плазме от приблизительно 0,01 микрограмма (мкг) на миллилитр (мл) до приблизительно 100 мкг/мл, предпочтительно от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл и обычно приблизительно 5 мкг/мл. Дозировка может быть назначена по-другому, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 300 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,2 мг/кг до приблизительно 200 мг/кг, более предпочтительно от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг, в виде одной или нескольких ежедневных доз на протяжении одного или нескольких дней. Если иммунотерапевтическое средство представлено в виде фрагмента моноклонального антитела или конъюгата, то количество может без труда устанавливаться на основании веса фрагмента/конъюгата относительно веса целого антитела. Предпочтительная молярная концентрация в плазме составляет от приблизительно 2 микромолей (мкМ) до приблизительно 5 миллимолей (мМ) и предпочтительно, приблизительно от 100 мкМ до 1 мМ антагониста антитела.

Терапевтически эффективное количество средства в соответствии с настоящим изобретением, которое представляет собой неиммуный терапевтический пептид или протеинный полипептид или другую биологическую молекулу с подобными размерами, обычно представляет собой такое количество полипептида, которого при введении в физиологически толератной композиции достаточно для достижения концентрации в плазме от приблизительно 0,1 микрограмма (мкг) на миллилитр (мл) до приблизительно 200 мкг/мл, предпочтительно от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 150 мкг/мл. На основании полипептида, имеющего вес приблизительно 500 грамм на моль, предпочтительная молярная концентрация в плазме составляет от приблизительно 2 микромолей (мкМ) до приблизительно 5 микромолей (мкМ) и предпочтительно приблизительно 100 мкМ-1 мМ антагониста полипептида.

Обычно дозировка активного вещества, которое представляет собой предпочтительно химическое цитотоксическое или химиотерапевтическое средство в соответствии с изобретением (ни иммунотерапевтическое средство, ни неиммунотерапевтический пептид/протеин) составляет 10 мг-1000 мг, предпочтительно приблизительно 20-200 мг, и более предпочтительно 50-100 мг на килограмм веса тела в день.

Фармацевтические композиции по изобретению могут включать лечение особи средствами, которые уменьшают или дают возможность избежать побочных действий, связанных с комбинированной терапией в соответствии с настоящим изобретением ("вспомогательная терапия"), включая, но не ограничиваясь, такие средства, например, которые уменьшают токсическое действие противораковых лекарственных средств, например, ингибиторы резорбции кости, кардиопротекторные средства. Указанные дополнительные средства предотвращают или уменьшают степень тошноты и рвоты, обусловленных химиотерапией, лучевой терапией или операцией, или уменьшают процент инфекций, связанных с введением миелосупрессивных противораковых лекарственных средств. Дополнительные средства хорошо известны в данной области техники. иммунотерапевтические средства в соответствии с изобретением могут дополнительно вводиться со вспомогательными средствами, такими как BCG и стимуляторы иммунной системы. Кроме того, композиции могут включать Иммунотерапевтические средства или химиотерапевтические средства, содержащие цитотоксически эффективные радиоактивно меченные изотопы, или другие цитотоксические средства, такие как цитотоксические пептиды (например, цитокины) или цитотоксические лекарственные средства и подобные.

Понятие "фармацевтический набор" для лечения опухолей или метастаз опухолей относится к упаковке и, как правило, инструкциям для применения реагентов в способах лечения опухолей или метастаз опухолей. Реагент в наборе согласно данному изобретению обычно представлен терапевтической композицией, как указано в изобретении, и следовательно, может быть представлен разнообразными формами, приемлемыми для распределения в наборе. Такие формы могут включать жидкость, порошок, таблетки, суспензии и аналогичные составы для получения препаратов на основе фармацевтических молекул в соответствии с настоящим изобретением, преимущественно антител к ErbB1. Реагенты могут быть в отдельных контейнерах, подходящих для отдельного введения в соответствии с настоящими методами, или альтернативно могут находиться в единичном контейнере в упаковке. Упаковка может включать достаточное количество для одной или нескольких дозировок регентов в соответствии с способами лечения, описанными здесь. Набор по данному изобретению также включает "инструкции по применению" веществ, содержащихся в упаковке.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: описывает связывание MAb 425 (EMD 72000) и с225 (цетуксимаб) с различными раковыми клетками (А431, SK-OV3, НСТ 116, MiaPaca-2, KYSE-30, KYSE-70) отдельно и в комбинации, измеренное при помощи проточной цитометрии.

Фигура 2: показана агрегация клеток-мишеней в зависимости от концентрации антитела (MAb 425, MAb 225 или смесь обоих антител).

Фигура 3: показано ингибирование EGF связывания с А431 опухолевыми клетками при помощи MAb 425, MAb 225 или смеси обоих антител.

Фигура 4: изображено вытеснение связанного EGF в А431 опухолевых клетках при помощи MAb 425, MAb 225 или смеси обоих антител.

Фигура 5: показана снижающая модуляция рецептора EGF на А431 клетки при помощи смеси гуманизированного MAb 425 (EMD 72000) и химерного MAb 225.

Примеры

Пример 1

Повышение связывания антитела на клетку вследствие комбинирования двух антител, блокирующих EGFR (цетуксимаб, EMD 72000), с различными эпитопными специфичностями.

Шесть EGER-положительных линий опухолевых клеток человека, полученных из плоскоклеточного рака влагалища (А431), аденокарциномы яичника (SK-OV-3), рака ободочной кишки (НСТ 116), рака поджелудочной железы (MiaPaca-2) и рака пищевода (KYSE-30, KYSE-70), которые экспрессируют различные уровни EGFR, инкубировали в течение 15 минут на льду с 10 мкг/мл цетуксимабом или EMD 72 000 соответственно или со смесью, содержащей в конечной концентрации 2,5 мкг/мл цетуксимаба и 2,5 мкг/мл EMD 72 000 (общая концентрация MAb: 5 мкг/мл). После этого клетки промывали и дополнительно инкубировали в течение 15 минут на льду с 20 мкг/мл FITC меченными козлиными античеловеческими IgG+IgM(H+L)-F(ab')2 в качестве реагента на второй стадии. После промывания клетки анализировали путем проточной цитометрии (FACScan, Becton Dickinson) для определения интенсивности флуоресценции, которая приблизительно эквивалентна количеству связанного антитела на клетку. Установлено, что независимо от уменьшенной концентрации красителя в применяемой смеси антител, интенсивность флуоресценции клеток, окрашенных смесью антител, была во всех случаях выше интенсивности флуоресценции клеток, которые окрашивали только одним из двух антител в высшей концентрации (фигура 1).

Пример 2

Аггрегация эффекторных клеток-мишеней как предварительное условие антитело-зависимой цитотоксичности, опосредованной клетками, и ее улучшение при помощи комбинации двух антител со специфичностями к различным эпитопам EGFR человека (цетуксимаб и EMD 72000).

В этой экспериментальной модели EGFR-положительные А431 клетки использовали в качестве клеток-мишеней. Использовали EGFR-отрицательные, Fc-гамма рецепторные (CD64 (FcγRI) и CD32 (FcγRII)) положительные U937 клетки гистиоцитарной лимфомы в качестве клеток, иммитирующих эффекторные клетки. А431 метили флуоресцирующей меткой зеленым РКН2, а клетки U937 - красным РКН26. После этого обе линии клеток смешивали с эффекторной клеткой-мишенью в соотношении 3:1 и инкубировали в течение 15 минут на льду в серийных разведениях (конечная концентрация: 4,74-0,0015 мкг/мл = 3,16×10^-8-1×10^-11 М, как рассчитано для обоих антител с MB 150 кДа) цетуксимаба и EMD 72000 соответственно, или в серийных разведениях смеси обоих антител, содержащей половину общей концентрации иммуноглобулина (2,37-0,00075 мкг/мл = 1,58×10^-8-5×10^-12 М; концентрация каждого MAb в этой смеси составляла половину этой концентрации). После центрифугирования в течение 5 минут при 50g и 4°С клетки дополнительно инкубировали в течение 60 минут на льду без разрушения осадка. В завершение осадок осторожно ресуспендировали и соотношение агрегатов определяли путем проточной цитометрии, используя прибор FACScan.

Как показано на фигуре 2, по сравнению с результатами инкубирования клеток только с единичным антителом в образцах, которые инкубировали со смесью обоих MAb при низкой общей концентрации белка, повышается максимальное количество агрегатов. Возрастающая часть кривой титрования для смеси антител существенно не сдвинута, несмотря на уменьшение концентрации белка в этих образцах по сравнению с образцами, которые инкубировали только с одним из MAb.

Пример 3

Увеличение ингибирования связывания EGF с А431 опухолевыми клетками при помощи смеси двух антител, направленных к различным эпитопам лиганд-связывающего домена EGFR.

Клетки А431 предварительно инкубировали в течение 15 минут на льду с 0,5 мкг/мл EMD 72000, цетуксимабом или смесью обоих антител при такой же концентрации. После удаления несвязанного антитела путем промывания клетки инкубировали в течение 15 минут на льду с 0,01, 0,1, 1 или 10 мкг/мл EGF, меченного FITC, из подчелюстной железы мыши (Molecular Probes Europe, Лейден, Нидерланды), промывали и анализировали путем проточной цитометрии.

Оба антитела значительно ингибировали связывание EGF-FITC во всех концентрациях. Тем не менее, смесь обоих антител во всех случаях была более эффективна по сравнению с каждым антителом, применяемым отдельно (фигура 3).

Пример 4

Вытеснение связанного EGF из EGFR в А431 клетках.

А431 предварительно инкубировали в течение 15 минут на льду с 10 мкг/мл EGF, меченного FITC, из подчелюстной железы мыши (Molecular Probes Europe, Лейден, Нидерланды). После этого клетки промывали и инкубировали в течение 15 минут с 10, 1 или 0,1 мкг/мл EMD 72 000 или цетуксимабом соответственно, или со смесью 2,5; 0,25 или 0,025 мкг/мл обоих антител (общая концентрация иммуноглобулина: 5, 0,5 или 0,05 мкг/мл). Затем клетки промывали и анализировали путем проточной цитометрии для определения связанного EGF-FITC.

Оба антитела в качестве единичных средств в зависимости от концентрации вытесняют EGF из EGFR в А431 клетках. Смесь обоих антител, содержащая только одну четвертую концентрации антитела (1/2 общей концентрации иммуноглобулина) каждого MAb, также эффективна для вытеснения лиганда, меченного FITC, как каждое из двух антител в большей концентрации.

Пример 5:

Понижающая модуляция EGFR при помощи смеси по крайней мере двух антител к различным эпитопам рецептора, но без уменьшения или только с незначительным уменьшением уровня EGFR на поверхности клеток при использовании одного единичного антитела после инкубации А431 клеток с MAb в течение 24 часов.

2×10⁶ А431 клеток в 2,5 мл среды, содержащей 10% FCS (фетальной телячьей сыворотки), высевали в 6-луночные микропланшеты. К культурам добавляли антитела (цетуксимаб, EMD 72000) в конечной концентрации 10 мкг/мл. Использовали смеси обоих антител в конечных концентрациях для каждого антитела 10 мкг/мл (смесь 1) или 5 мкг/мл (смесь 2), что приводит к получению общей концентрации антитела 20 и 10 мкг/мл соответственно. Затем клетки инкубировали в присутствии антител в течение 24 часов при 37°С и 10% CO₂. После этого клетки собирали, обрабатывая трипсином/EDTA (0,05/0,02%), промывали и инкубировали в течение 15 минут на льду или с 20 мкг/мл античеловеческого козлиного IgG+IgM(H+L)-F(ab')2, меченного FITC, в качестве реагента второй стадии для определения связанных на поверхности антител к EGFR или с 10 мкл/мл MAb425, меченного FITC, (мышиного предшественника EMD 72000) для определения свободных, незанятых участков связывания для EMD 72000. В завершение клетки анализировали путем проточной цитометрии. На фигуре 5 показано, что EMD 72000 и его мышиный предшественник Mab 425 конкурирует за связывание с их эпитопами на EGFR и что предварительно связанный EMD 72000 почти полностью может ингибировать связывание MAb 425 - FITC. В отличие от этого, предварительно связанный цетуксимаб только незначительно ингибирует связывание MAb 425 - FITC по сравнению с необработанными контрольными клетками. Это отчетливо свидетельствует о том, что оба антитела связываются с различными эпитопами EGFR. Кроме того, на этой фигуре показано, что после инкубирования клеток в течение 24 часов в присутствии смеси антител в обеих концентрациях интенсивность флуоресценции меченного FITC реагента второй стадии, который применяется для определения связанных на поверхности антител, очевидно уменьшается.

Это свидетельствует о том, что уровни EGFR на поверхности клеток, обработанных смесью антител, значительно уменьшаются по сравнению с клетками, которые культивировали только с одним из антител. Таким образом, очевидно, что большие комплексы рецептор - антитело, образованные при помощи смеси MAb, подвергаются интернализации и/или преобразуются при помощи других механизмов по сравнению с небольшими комплексами рецептор - антитело, состоящими только из двух рецепторов после поперечного связывания одной молекулой антитела.

Изобретение относится к фармацевтическим композициям, предназначенным для лечения опухолей. Композиция содержит две различные молекулы моноклональных антител MAb 425 и MAb 225 в мышиной, химерной или гуманизированной модификации, каждое из которых содержит эпитопы, одновременно связывающиеся с различными участками в пределах одного и того же связывающего лиганд домена рецептора ErbB1. Композиция может вызывать повышение поперечного связывания различных или одинаковых рецепторов ErbB и усиливать индукцию модуляции специфического пути передачи сигнала. Использование композиции позволяет снизить дозы композиций и средств, применяемые в терапии опухолей, и тем самым уменьшить количество побочных эффектов, связанных с введением высоких доз. 3 н. и 7 зав.п. ф-лы, 5 ил.

1. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения опухолей, содержащая первую и вторую молекулу антитела или ее часть, обладающую способностью связываться с эпитопами, расположенными на молекуле рецептора ErbB1, где указанная первая молекула антитела или ее часть содержит участки связывания, которые связываются с первым специфическим эпитопом на молекуле рецептора типа ErbB1 и указанная вторая молекула антитела содержит участки связывания, которые связываются со вторым специфическим отличающимся эпитопом на этой молекуле рецептора ErbB1, и указанные первый и второй эпитопы на молекуле рецептора типа ErbB1 расположены в пределах связывающего лиганд домена рецептора ErbB1, благодаря чему увеличивается количество антител, которое связывается с рецептором и с клеткой при той же дозе антитела и приводит к усилению блокирования и/или ингибирования, и индукции понижающей регуляции специфического пути передачи сигнала, опосредуемого рецептором ErbB1, по сравнению с композицией, содержащей только указанную первую или вторую молекулу антитела, причем указанное первое антитело представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное MAb 425, а указанное второе антитело представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное MAb 225.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанный связывающий домен рецептора представляет собой связывающий домен естественного лиганда молекулы рецептора указанного типа ErbB1.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где индукция поперечного связывания и/или димеризации молекул рецептора ErbB1 усиливается по сравнению с композицией, включающей единичную молекулу антитела, которая связывается с указанным первым или вторым эпитопом только на указанном типе молекулы рецептора ErbB1.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, которая дополнительно содержит цитотоксическое средство.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, в которой указанное цитотоксическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство.

6. Фармацевтическая композиция по п.4, применяемая в комбинации с облучением.

7. Фармацевтический набор, предназначенный для лечения опухоли и содержащий
(i) первую упаковку, которая включает мышиное, химерное или гуманизированное MAb 425 (h425) и
(ii) вторую упаковку, которая включает мышиное, химерное или гуманизированное MAb 225.

8. Фармацевтический набор по п.7, который дополнительно содержит третью упаковку, содержащую цитотоксическое средство.

9. Фармацевтический набор по п.8, в котором указанное цитотоксическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство.

10. Способ лечения опухолей у пациента, включающий введение этому пациенту эффективного количества композиции по п.1 или 4.