СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОКЛЮШНОГО ЭНДОТОКСИНА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к прикладной и к экспериментальной микробиологии. Способ применяется для контроля содержания эндотоксина в моно- и ассоциированных препаратах коклюшной вакцины.

Существует несколько способов определения коклюшного эндотоксина.

Аналогом является способ определения эндотоксина на животных, обработанных дактиномицином (актиномицином d) (1). Способ включает в себя следующие этапы: 1) введение мышам внутрибрюшинно раствора, содержащего 30 мкг/мл дактиномицина; 2) введение через один час мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл разведений контролируемого препарата; 3) учет гибели животных через 48 ч.

Недостатками этого способа является трудоемкость, длительное время определения, неспецифичность.

Прототипом способа является способ определения коклюшного эндотоксина методом иммуноферментного анализа, использованный ВОЗ при контроле бесклеточной коклюшной вакцины (2). Способ состоит в следующем: на твердую фазу адсорбируют сыворотку к B. pertussis, полученную путем иммунизации животных предварительно прогретым при 100^oC штаммом N 509, после инкубации и промывки планшета вносят контролируемый препарат, снова инкубируют и добавляют ту же сыворотку, меченную пероксидазой, после чего вносят субстратно-индикаторный раствор.

Недостатками способа является низкая специфичность и невысокая чувствительность. Это связано с тем, что сыворотка имеет антитела и к другим антигенам коклюшного микроба и используется прямой вариант иммуноферментного анализа.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа.

Для достижения поставленной цели определение коклюшного эндотоксина методом иммуноферментного анализа проводят с использованием для адсорбции на твердой фазе полимиксина B в концентрации 5 15 мкг/мл, а в качестве специфических антител сыворотку к авирулентному штамму B. pertussis N 347 (4 фаза роста).

Сравнительный анализ существенных признаков заявляемого способа с прототипом свидетельствует, что общим признаком у них является использование иммуноферментного анализа для определения коклюшного эндотоксина.

Отличительными признаками заявленного решения являются:
применение для адсорбции на твердой фазе полимиксина B в концентрации 5 15 мкг/мл;
использование в качестве специфических антител сыворотки к авирулентному штамму B. pertussis N 347 (4 фаза роста).

Полимиксин B является антибиотиком узкого спектра действия применяется в основном для лечения заболеваний, вызванных клебсиеллами. В литературе имеются немногочисленные сведения о попытках использования полимиксина, ковалентно сшитого с сефарозой, для удаления эндотоксинов грам-отрицательных бактерий из биологических препаратов (3, 4). При адсорбции полимиксина на твердую фазу он ориентируется на полистироле таким образом, что активными остаются центры, вступающие в связь с липидом A молекулы эндотоксина. В свою очередь, блок липида A приводит к тому, что реакционно-способной в молекуле эндотоксина остается углеводная цепь, с которой связана, как известно, специфичность эндотоксинов большинства грам-отрицательных бактерий.

Специфичность предлагаемого способа кроме этого механизма основана на применении сыворотки к авирулентному штамму B. pertussis 4 фазы роста, утратившего поверхностные сероспецифические антигены, но сохранившего эндотоксин (5).

Чувствительность способа по сравнению с прототипом увеличивается за счет применения полимиксина. Имея меньшую молекулярную массу (смесь пептидов), чем антитела, полимиксин на единицу площади полистирола адсорбирует больше активных молекул, при взаимодействии с эндотоксином не создает стерических препятствий для последующего взаимодействия с антителами. Полимиксин, взаимодействуя с липидом A молекулы эндотоксина, оставляет свободным полисахаридный участок, что обеспечивает оптимальные условия для сорбции специфических антител.

По данным авторов в литературе применение указанных отличительных признаков не описано.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о соответствии заявляемого технического решения критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ иммуноферментного определения коклюшного эндотоксина осуществляют следующим образом. Для постановки реакции используют планшеты для иммуноферментного анализа разового пользования с плоским дном. В лунки планшета вносят раствор полимиксина в концентрации (10± мкг/мл. Данная концентрация является оптимальной для достижения более полной сорбции эндотоксина при наименьшем фоновом уровне фиг.3. При внесении пробы, содержащей эндотоксин, он реагирует с "подложкой". Затем в лунки добавляют сыворотки к авирулентному штамму B. pertussis. Проявление связавшегося комплекса проводят с помощью антивидового коньюгата в присутствии субстратно-индикаторной смеси (орто-фенилендиамин + перекись водорода).

Оптическая плотность
при длине волны 492 нм
Как видно из фиг.1 оптимальная концентрация полимиксина составляет 10±5 мкг/мл. Уменьшение количества полимиксина ведет к снижению чувствительности, а увеличение количества, не приводят к увеличению чувствительности, вызывает повышение фоновой реакции.

Пример 1. Количественное определение коклюшного эндотоксина в пробах с процесса культивирования B. pertussis.

1-й этап адсорбция полимиксина B на полистироловый планшет.

С этой целью готовят 0,001% раствор полимиксина B на 0,1 М карбонатном буфере, pH 9,6. Во все лунки планшета вносят по 0,2 мл готового раствора. Инкубацию проводят при (5±3)^oC в течение 18 20 ч. После инкубации лунки планшета трехкратно промывают 0,01 М фосфатно-солевым буфером, pH 7,2 7,4, содержащим 0,05% Твина-20.

2-й этап внесение проб с процесса и отраслевого стандартного образца эндотоксина (ОСО 42-28-107-87), 18 проб с процесса культивирования раститровывают двухкратным шагом, начиная с исходного разведения в 12 пробирках каждую. В отдельном ряду пробирок (12) раститровывают также двухкратным шагом ОСО, начиная с 1 мкг/мл. Разведение готовят на 0,01 М фосфатно-солевом буфере, pH 7,2 7,4, содержащем 0,05% Твина-20 и 3% бычьего сывороточного альбумина. Содержимое пробирок с пробами и ОСО в той же последовательности переносят в лунки горизонтальных рядов планшета по 0,1 мл и ставят в термостат при 37^oC на один час. После инкубации лунки отмывают фосфатно-солевым буфером 3 раза.

3-й этап внесение сыворотки к авирулентному штамму B. pertussis. Для этого сыворотку разводят раствором для разведения до рабочего титра (1 6000) и вносят в лунки по 0,1 мл. Планшет помещают в термостат на 1 ч при 37^oC. После инкубации планшет трижды отмывают фосфатно-солевым буфером.

4-й этап внесение антивидового коньюгата. Для этого антитела против иммуноглобулинов кролика, меченые пероксидазой, разводят до рабочей концентрации раствором для разведения и вносят в лунки по 0,1 мл. Планшет помещают в термостат при 37^oC на один час. После инкубации планшет отмывают 4 раза фосфатно-солевым буфером.

5-й этап внесение субстратно-индикаторной смеси. Наличие образовавшегося специфического комплекса определяют путем внесения в лунки по 0,1 мл 0,02% раствора орто-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере, pH 5,0 с добавлением 0,15% перекиси водорода. Планшеты инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре.

6-й этап внесение 4н. H₂SO₄. Для остановки ферментативного окисления орто-фенилендиамина и фиксации значений экстинкции растворов субстратов исследуемых образцов во все лунки добавляют по 0,05 мл 4н. H₂SO₄. Результаты фотометрируют при длине волны 492 нм.

Количественное определение коклюшного эндотоксина в пробах проводят графо-аналитическим методом. Для этого строят кривую титрования ОСО (калибровочная кривая). Для расчетов используют прямолинейный участок кривой (фиг. 2). На прямолинейном участке определяют значение оптической плотности контролируемых проб. Количество ОСО в данной точке, умноженное на кратность разведения пробы, укажет количество эндотоксина, содержащегося в 1 мл пробы.

Результаты определения:
через 2 ч от начала культивирования количество эндотоксина 0,4 мкг/мл
через 4 ч 0,5 мкг/мл
6 ч 0,8 мкг/мл
8 ч 3,3 мкг/мл
10 ч 2,2 мкг/мл
12 ч 3,5 мкг/мл
14 ч 5,8 мкг/мл
16 ч 12 мкг/мл
18 ч 18 мкг/мл
Пример 2. Количественное определение коклюшного эндотоксина в пробах с ультрацентрифугирования полуфабриката коклюшной вакцины в градиенте плотности сахарозы.

Условия и порядок постановки аналогичны, тем которые описаны в примере 1. Эндотоксин определяли в 8 зонах градиента плотности. 1 зона 5% сахарозы и далее плавное нарастание к низу и в 8 зоне 30% сахарозы.

Результаты определения:
1 зона 1,4 мкг/мл
2 зона 4,9 мкг/мл
3 зона 16,1 мкг/мл
4 зона 43 мкг/мл
5 зона 134,0 мкг/мл
6 зона 209,9 мкг/мл
7 зона 230,4 мкг/мл
8 зона 361,4 мкг/мл
Пример 3. Определение содержания эндотоксина в адсорбированной бесклеточной коклюшной вакцине.

Для определения содержания эндотоксина в бесклеточной коклюшной вакцине, абсорбированной на фосфате алюминия, к 0,1 мл препарата прибавляют в стерильных условиях 100 мг цитрата натрия и инкубируют при 37^oC 6 8 ч для растворения геля сорбента. Определение содержания эндотоксина в препарате проводят описанным нами методом. Результаты определения:
серия 12 0,07 мкг/мл
серия 17 0,1 мкг/мл
серия 21 0,06 мкг/мл
Пример 4. Определение содержания эндотоксина в ассоциированном препарате.

Предлагаемый способ может быть использован для определения эндотоксина в ассоциированном препарате (столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, бесклеточная коклюшная вакцина). Перед определением для растворения сорбента препарат обрабатывают цитратом натрия аналогично описанному в примере 3. Результаты определения:
Ассоциированная вакцина серия 1 0,1 мкг/мл
серий 2 0,08 мкг/мл
серия 3 0,12 мкг/мл
серия 4 0,18 мкг/мл
Специфичность системы определяли на панели штаммов грам-отрицательных бактерий содержащих эндотоксин (табл. 1).

Как видно из табл. 1 реакция в пробах с грам-отрицательными бактериями на уровне отрицательного контроля, положительный ответ наблюдается только в пробе со штаммом B. pertussis, что говорит о специфичности способа.

Приведенные в табл. 2 данные показывают преимущества предлагаемого способа.

Таким образом, заявляемый способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет вести количественное определение коклюшного эндотоксина в различных биологических объектах.

Использование: медицина экспериментальная и прикладная микробиология. Сущность изобретения: с целью повышения чувствительности и специфичности способа в лунки планшета предварительно адсорбируют полимиксин B в концентрации 5 - 15 мкг/мл и вносят пробы, содержащие эндотоксин. После инкубации лунки отмывают фосфатно-солевым буфером, вносят в лунки сыворотку к авирулентному штамму B. pertussis N 347 в 4 фазе роста. Проявление связывающегося комплекса проводят с помощью антивидового коньюгата в присутствии субстратно-индикаторной смеси. Количественное определение коклюшного эндотоксина проводят путем сопоставительного титрования испытуемого образца с отраслевым стандартным образцом (ОСО) эндотоксина B. 2 ил.

Способ количественного определения коклюшного эндотоксина методом иммуноферментного анализа, включающий сорбцию лиганда на твердой фазе, внесение анализируемого образца, инкубацию, добавление специфических антител, использование пероксидазной метки с последующим внесением субстратно-индикаторной смеси и учетом результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа, определение эндоксина ведут непрямым иммуноферментным анализом, причем в качестве лиганда используют полимиксин В в концентрации 5 15 мкг/мл, в качестве специфических антител сыворотку к авирулентному штамму B.pertussis N 347 в четвертой фазе роста.