Способ определения инсулиноподобных ростовых факторов I и II в сыворотке крови человека Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам определения ростовых факторов и может быть использовано в клинической эндокринологии.

Цель изобретения - сокращение времени определения гормона.

Указанная цель достигается тем, что используют планшет, который насыщают антителами к ИРФ I и II при рН 9,4, затем помещают на него испытуемую сыворотку и после инкубации и отмывки добавляют конъюгат антител к ИРФ I и II с пероксида- зой хрена, инкубируют при 37 , вновь отмывают, добавляют субстратную смесь, инкубируют в темноте, останавливают реакцию раствором серной кислоты и по интенсивности окрашивания определяют на спектрофотометре количество ИРФ I и II. Предлагаемый способ иммуноферментного определения ИРФ I и II позволяет безэкстракционным путем определять микроколичества и сократить время анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

Иммуноферментная тест-система для определения ИРФ I и II основана на методе двойных антител с использованием твердофазного носителя. Источником антигена И РФ I и 11 служит ткань опухоли из / -клеток островков Лангерганса - инсулинома. Для получения антигена из опухоли используют метод Васильевской И.В. Способ выделения и очистки ИРФ I и II включает получение ацетонового порошка из ткани опухоли, экстракцию этанолом-HCI, осаждение спирт- ацетоновой смесью и гельфильтрацию в кислых условиях с NaCI. Получают гомогенный, высокоочищенный препарат, содержащий инсулиноподобные ростовые факторы I и II. Чистоту и гомогенность контролируют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом по N-концевым аминоVI

Јь О СЛ

кислотам дансильным методом, а также аминокислотным автоматическим анализатором.

Инсулиноподобные ростовые факторы I и II представляют собой два низкомолеку- дярных пептида с М. в. 7500 Дальтон.

Источником антител к ИРФ I и II служит гаммаглобулиновая фракция моноспецифической сыворотки против человеческого препарата ИРФ I и II из инсулиномы, Фракцию получали двукратным осаждением сульфатом аммония до 33 и 50% насыщения. На весь цикл иммунизации берут на одного кролика 8 мг высокоочищенного гомогенного антигена в 4 мл физиологического раствора и 4 мл полного адьюванта Фрейда, четыре инъекции делают с интервалом в 14 дней. I, II и III инъекции проводят подкожно в 4 точки в области спины в нарастающих дозах: 0,25, 0,5 и 1,0 мл соответственно в каждую точку, а IV инъекцию - по 0,5 мл в подкожные лимфоузлы.

Для получения антител используют иммунную сыворотку с титром не менее 1:32, 1:64 в двойной радиальной иммунодиффу- зии по Оухтерлони. В иммуноферментном определении используют коньюгат антител к ИРФ HI с пероксидазой хрена в рабочем разведении 1:400. Субстратной смесью в тест-системе служит раствор 2,4-ортофени- лендиамина (основной раствор:10 мг орто- фенилендиамина в 1 мл метанола: рабочий раствор: 100 мкл основного раствора в 10 мл 0,05 М цитратного буфера, рН 4,7) с 33% перекисью водорода (2 мкл).

Для проведения иммуноферментного анализа в каждую лунку полистиролового планшета вносят по 0,2 мл антител к ИРФ I и II в 0,01 М в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,4, планшеты выдерживают 1 ч при 37°С, а затем 24 ч при 4°С. Далее планшеты обрабатывают 0,5%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина или ма- нитолла в течение суток при 4°С. Планшеты многократно отмывают отмывающим раствором, состоящим из 0,1 М фосфатно-соле- вого, рН 7,4, буфера, 0,05%-ного Твина-20 и 0,1 %-ного бычьего сывороточного альбумина, высушивают, плотно закрывают и хранят при 4°С.

В лунки первого ряда вносят по 0,2 мл отмывающего раствора , а в лунки II и II рядов по 0,2 мл стандартного антигена в двукратных разведениях, в остальные лунки - в дублях исследуемые сыворотки. После инкубации в течение 24 ч при 37°С планшет вновь отмывают и в лунки вносят по 0,2 мл конъюгата в рабочем разведении. Планшеты выдерживают 24 ч при 37°С и после отмывки вносят раствор субстрата в объеме 0,2 мл, на 1 ч помещают в темноту, реакцию останавливают 0,05 мл 50%-ным раствором серной кислоты. Продукт реакции желтого 5 цвета, его интенсивность оценивают по оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Количество антигена в исследуемых образцах, пропорциональное количеству связанного конъюгата,

10 определяют по количеству гидролизованно- го субстрата. Содержание ИРФ I и II в образцах определяют по калибровочной кривой, полученной при исследовании двукратных разведений стандартного антиге15 на.

Таким образом, предлагаемый способ иммуноферментного определения ИРФ I и II в цельной сыворотке в течение 2 сут без предварительной трудоемкой обработки об0 разца, позволяет использовать для его массовых обследований больных и в исследовательских целях.

Способ иллюстрируется следующим примером.

5 Иммуноферментное определение инсу- линоподобных ростовых факторов I и II (ИРФ I и II) в сыворотке крови больной М. осуществляли следующим образом. Для определения ИРФ I и II использовали

0 полистироловый планшет, насыщенный антителами к ИРФ и II в концентрации 3 мкг/мл. В лунки первого ряда вносили по 0,2 мл отмывающего раствора, состоящего из 0,1 М фосфатно-солевого буфера, рН 7,4,

5 0,05%-ного Твина-20 и 0,1 %-ного бычьего сывороточного альбумина. В лунки второго и третьего рядов вносили по 0,2 мл стандартного антигена в двукратных разведениях (в дублях) для построения калибровочного гра0 фика. Разведение стандарта начинали с концентрации 100 мкг/мл, В лунки четвертого ряда - 0,2 мл цельной сыворотки больной М.(в дубле). Планшет инкубировали 24 ч при 37°С. После инкубации планшет много5 кратно отмывали отмывающим раствором. Затем во все лунки вносили по 0,2 мл конъюгата антител к ИРФ I и II с пероксидазой в разведении 1:400. Планшет выдерживали 24 ч при 37°С и отмывали аналогичным спосо0 бом. В каждую лунку планшета вносили 0,2 мл субстратной смеси и помещали на 1 ч в темноту, реакцию останавливали 0,05 мл 50%-ным раствором серной кислоты. Продукт реакции был желтого цвета, его интен5 сивность оценивали по оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Содержание ИРФ I и II в сыворотке

больной М определяли по калибровочному

графику, где по оси абсцисс - концентрация стандартного антигена, по оси ординат - оптическая плотность образцов (для удобства можно использовать полулогарифмические координатные оси, так как концентрация стандарта используется в достаточно широком диапазоне).

Величина ИРФ I и II в сыворотке больной М. составила 34,8 мгк/мл. Больная М. наблюдается у эндокринолога по поводу акромегалии.

Таким образом, в течение 2 сут без специальной обработки в цельной сыворотке больной М. было определено содержание инсулиноподобных ростовых факторов I и II.

Формула изобретения

Способ определения инсулиноподобных ростовых факторов I и II в сыворотке

крови человека с помощью специфической антисыворотки к инсулиноподобным ростовым факторам, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени проведения способа, используют иммунофермент- ный анализ путем нанесения специфических антител на полистироловый планшет при рН 9,4, инкубации в течение 1 ч при 37°С и в течение 18ч при 4°С, добавления исследуемой сыворотки и выдерживания смеси в течение суток при 37°С, внесения антител к инсулиноподобным ростовым факторам, меченых пероксидазой хрена, и после контакта в течение 24 ч при

37°С и добавления на 1 ч. раствора субстрата, пробу фотометрируют при длине волны 492 нм,

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам определения инсулиноподобных ростовых факторов, и может быть использовано в клинической эндокринологии. Цель изобретения - сокращение времени определения. Использован твердофазный иммунофер- ментный анализ, включающий сорбцию специфических антител на полистироловом планшете, добавление испытуемой сыворотки, инкубацию с конъюгатом специфических антител с пероксидазой, внесение субстратной смеси и определение концентрации инсулиноподобных ростовых факторов по интенсивности окрашивания при длине волны 492 нм. fe