Способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий методом иммуноферментного анализа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится it биологии и медицине, а именно определению антител к экзотоксину коклюшных бактерий.

Известен твердофазный иммунофер- ментный метод определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий, включающий адсорбцию экзотоксина на поверхности полистирола, внесение исследуемых антител, коньюгата антивидовых антител с ферментом и субстрата.

Недостатками такого способа являются необходимость использования высокоочищенного препарата коклюшного экзотоксина, зависимость чувствительности и специфичности анализа от беспорядочной сорбции молекул токсина на полистироле и сорта полистирола.

Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности анализа.

Сущность изобретения заключается в том, что перед адсорбцией препарата коклюшного экзотоксина поверхность полистирола обрабатывают частично денатурированным церулоплазмином человека, в результате чего достигается упорядоченная пространственная ориентация молекул токсина, обеспечивающая повышение чувствительности и специфичность реакции, а также возможность использования дешевого неочищенного препарата.

Пример 1. Определение оптимальной дозы церулоплазмина для адсорбции на планшете.

Церулоплазмин человека частично денатурируют прогреванием при 60°С в течео о

00

VI 00 CJ

ние 16 ч и адсорбируют на полистироле в дозах 20, 10, 5, 2,5 мкг/мл при следующих условиях: карбонат-бикарбонатный буфер (рН 9,6),время инкубации 3 ч, температура 22 ±2°С, объем вносимого в лунку образца 0,1 мл. После адсорбции церулоплазмина планшеты промывают фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,05% твина-80. Затем в лунки планшета вносят коклюшный токсин в различных разведениях, раститрован- ный с двукратным шагом начиная с 500, нг/мл. В контрольные лунки токсин не вно-1 сят. Плашки инкубируют при в течение 1,5 ч, отмывают несвязавшийся токсин двухкратным буфером, содержащим дополнительно 0,5 М хлорида натрия, и вносят антисыворотку к коклюшному токсину. После инкубации при 37°С в течение 1,5 ч несвязавшиеся антитела отмывают фосфатным буфером, вносят антивидовой конъю- гат и инкубируют при 20°С 1 ч. Лунки вновь отмывают фосфатным буфером, вносят субстрат и через 15 мин останавливают реакцию 4 н,серной кислотой. Учет реакции проводят при 490 нм.

Оптимальной дозой церулоплазмина для адсорбции на полистироле является 10 мкг/мл, поскольку увеличение ее до 20 мкг/мл не оказывает влияния на характер кривой титрования, а уменьшение до 5 мкг/мл снижает чувствительность реакции.

Пример 2. Использование неочищенного препарата коклюшного токсина в ИФА.

Частично денатурированный церулоп- лазмин адсорбируют в лунках пояистироло- вых планшет, как описано в примере 1. После отмывки неадсорбированного церулоплазмина в одни лунки планшеты вносят очищенный токсин в концентрации 10 мкг/мл в объеме 100 мкл, а в другие - неочищенный в объеме, содержащем такое же количество токсина, как очищенный препарат. Далее анализ проводят, как описано в примере 1, используя рефернс-сыворотку, активность которой 5000 ЕД/мл, и тест-сыворотку с неизвестной активностью. Активность тест-сыворотки при использовании высокоочищенного токсина: 6,252,8; 6,182,6; 6,052,8; 6,202,8; 6,002,0; 6,346,0 ЕД/мл, а при использовании неочищенного токсина: 6,196,2; 5.986,4; 6,202,0: 6.642.6; 6,006,6; 6,240,0 ЕД/мл. Таким образом, независимо от использованного препарата данные об активности антитоксической сыворотки идентичны, высокий уровень кор- 1 рекции свидетельствует о возможности использования неочищенных препаратов коклюшного токсина.

Пример 3. Специфичность реакции в отношении антигенов коклюшного микроба.

Церулоплазмин адсорбируют в первых четырех рядах планшеты, как описано в примере 1. Затем адсорбируют очищенный токсин в четырех рядах лунок на церулоп- лазмин и в последующих непосредственно на полистирол. В лунки с адсорбированным токсином вносят антисыворотку к дефектному по продукции токсина штамму коклюшных бактерий и далее последующие этапы ИФА проводят, как описано в примере 1.

Результаты исследования приведены в табл. 1.

Использование церулоплазмина в качестве аффинной подложки обеспечивает полное отсутствие перекрестных реакций с антителами против других антигенов кок- люшного микроба в то время как при непосредственной сорбции коклюшного токсина они наблюдаются.

Пример 4. Межвидовая специфичность реакции.

В лунки полистироловой планшеты с ад- сорбированным на их поверхность церулоп- лазмином, а затем коклюшным токсином вносят антисыворотки к дифтерийному токсину, экзотоксину синегнойной палочки и токсину коклюшного микроба. Далее анализ проводят, как описано в примере 1.

Результаты испытаний приведены в табл. 2.

Отсутствие перекрестных реакций с ан- тисыворотками к дифтерийному и синегной- ному токсинам с-видетельствует о специфичности предлагаемого способа.

Пример 5. Чувствительность ИФА при различных вариантах сорбции коклюш- ного токсина.

В лунки планшеты с адсорбированным церулоплазмином и без него вносят коклюшный токсин в различных дозах и далее анализ проводят, как описано в примере 1. Результаты испытаний приведены в табл. 3.

Использование церулоплазмина в качестве аффинной подложки обеспечивает увеличение чувствительности ИФА в четыре раза. Последнее достоверное значение (прямолинейный участок кривой титрования) составляет при сорбции токсина на полистирол 0,52 ЕД оптической плотности, что соответствует 15,6 нг/мл, а при сорбции на церулоплазмин - 0,6 ЕД и, соответственно 33 нг/мл.

Приведенные данные свидетельствуют о возможности использования неочищенных препаратов коклюшного токсина в

предложенном способе ИФА, о его высокой чувствительности и специфичности.

Формула изобретения Способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий методом имму- ноферментного анализа, включающий адсорбцию экзотоксина на поверхности полистирола, внесение изучаемых антител, конъюгата антивидовых антител с ферментом и субстрата, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности анализа, поверхность полистирола предварительно обрабатывают частично денатурированным церулоплаз- мином человека.

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно определению антител к экзотоксину коклюшных бактерий. Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности анализа. Предложенный способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий методом иммуноферментного анализа включает адсорбцию экзотоксина на поверхности полистирола, внесение исследуемых антител, коньюгата антивидовых антител с ферментом и субстрата, отличается тем, что перед адсорбцией токсина поверхность полистирола обрабатывают частично денатурированным церулоплазмином человека. Применение церулоплазмина обеспечивает повышение чувствительности и специфичности анализа, позволяет снизить его стоимость за счет возможности использования неочищенных препаратов коклюшного экзотоксина. 3 табл. (Л С

10

Табл и ца1

Таблица 2

Таблица 3