Способ диагностики коклюшной инфекции Советский патент 1986 года по МПК G01N33/53 

1

Изобретение относится к медицине, в частности к способам серологическо диагностики инфекционных заболеваний

Цель изобретения - повышение специфичности иммуноферментного коклюшного теста для диагностики заболевания .

Способ осуществляют следующим образом.

Очищенный препарат белковой коклюшной фракции коклюша сорбируется на полистироловом планшете в дозе 8-10 мкг при рН 7,2-7,4 в 0,1 М трис-соляно-кислом буфере, а дезин- теграты коклюшного и паракоклюшного микроба и липополисахарид коклюша в доз.е 10-15 мгк при рН 9,6-9,8 в 0,1 карбонат-бикарбонатном буфере. При ЭТОМ на одном планшете в стандартных

условиях получают ответ (учет визуаль- О условиях,

яый и инстрзт ентальный) о наличии ан- Дезинтеграт коклюшный и паракок.тител ко всем используемым анти- гбнам, который позволяет судить о наличии инфекционного заболевания. При исследовании антительного ответа у иммунизированных детей, переболевших и больных, установлено что характер иммунного ответа различен . У привитых детей сохраняются титры антител к протективной белковой фракции, а у больных и недавно переболевших основные антитела образуются к липополисахариду. На этом и основывается диагностика коклюша помощью ИФА.

Пример. Микробную массу В.pertussis штамм 305 (100 мл 1000 млрд суспензии) дезинтегрируют 10 мин с микробусами в баллистическом гомогенизаторе (Л-17), очиш;ают от неразбившихся клеток центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин.

Дезинтеграт содержит 64.,3%- белка 7,1% углеводов и 10,65% нуклеиновых кислот,- 7,6(2,23 12,97) мкг белка.

Получение белковой протективной фракции коклюшных микробов проводят по известному способу.

Диагностический титр ИФА при за- 45 болевании коклюшем 1:1600 при реакци на ЛПС. У больных людей титр к ЛПС 1:1600 и выше при более низком или равном титре к белковому компоненту. У привитых детей наблюдают высокие 50 титры к белковой фракции и снижение к липополисахариду. При заболевании паракоклюшем титр антител к дезинтег рату паракоклюша вьше не менее, чем на три разведения, чем к коклюшному

В качестве носителя используют планшеты для иммунологических реакций.. Затем получают белковую протек- тивную фракцию коклюшных микробов, липосахариды. конюгат известными спо- 55 дезинтеграту и его компонентам, собами. Сенсибилизацию планшетов проводят следующим образом, нанося вер- При массовом обследовании возмож- тикально в 1 и 5 ряды дезинтегра г но использовать всего 2-3 разведения

5929J

коклюшных микробов, в 2 и 6 ряды - дезинтеграт паракоклюшных микробов, в 3 и 7 ряды - белковую коклюшную фракцию, в 4 и 8 ряды - липополиса- 5 харид коклюша, в 9 ряд (контрольный) - бычий сывороточный альбумин, в 10 ряд (контрольный) - раствор желатина, в 11 и 12 ряды (контрольный) - дези1Гтеграт коклюшного мик- 0 роба.

В 1-10 рядах раститровывают сыворотки обследуемых. В 11 ряду заведомо положительный контроль (сыворотка от больного с бактериологическим 15 подтверждением, проверенная другими серологическими методами). В 12-м ряду раститровывают сыворотку здоровых доноров.

Антигены сорбируют при следующих

люшных бактерий и липополисахарид используют в дозе 10-15 мкг/мл в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 при 37-38 С 2-4 ч, а белковую фракцию коклюша - в дозе 8-10 мкг/мл в 0,1 М трис-соляно-кислом буфере рН 7,2-7,ft 2-4 ч при 38-37°С.

Исходное разведение сыворотки обследуемых 1:200, шаг разведения .., двукратный.

Постановка ИФА осуществляется известным способом (EL)SA. Учет реак- ции ведется визуально или-инструментально при длине 449 нм. Реакция считается положительной, если разница между контролем и опытным образцом равна или более 0,1. При визуальном учете положительной реакции считается . та, которая по окраске отличается от контроля на два разведения (лунки).

Диагностический титр ИФА при за- болевании коклюшем 1:1600 при реакции на ЛПС. У больных людей титр к ЛПС 1:1600 и выше при более низком или равном титре к белковому компоненту. У привитых детей наблюдают высокие титры к белковой фракции и снижение к липополисахариду. При заболевании паракоклюшем титр антител к дезинтег- рату паракоклюша вьше не менее, чем на три разведения, чем к коклюшному

езинтеграту и его компонентам, При массовом обследовании возмож- но использовать всего 2-3 разведения

сыворотки, начиная с титра 1:1600 Все значения реакции с ЛПС коклюша

вьппе 1:1600 при более низких или рав- чых титрах к белковой фракции коклюша

и его дезинтеграту свидетельствуют о

.наличии коклюшной инфекции.

Тест рекомендован для диагностики коклюша и оценки поствакцинального иммунитета.

Предлагаемьй способ позволяет с помощью ИФА-коклюша (теста) различать привитых детей от больных и переболевших, отдифференцировать коклюш от паракоклюша, ставить диагноз даже при слабом антительном ответе (по разнице титров к ЛПС и-белку) паци- ента, а также для выявления стертых .форм заболевания, носительства. Кроме того, тест подтверждает наличие заболевания в 95% случаев (при подтверждении бактериологическом) и 80-85% при клиническом диагнозе (больные с подозрением на коклюш без бактери- ологического подтверждения).

г едактор Н. Рогулич Заказ 4816/44

Составитель Н. Кузенкова

Техред Л. Сердюков а Корректорам. Демчик

Тираж 778

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

Способ диагностики коклюшной инфекции путем иммобилизации на планшете дезинтегратора коклюшных микробов сыворотки больного, кроличьих антител к гамма-глобулину человека, меченных пероксидазой хрена, с последующей оценкой реакции по интенсивности окраски, субстратной смеси, отличающийся тем, что, с целью повьш ения специфичности способа, в качестве антигенов дополнительно используют липополисахарид коклюшных микробов, дезинтеграт паракоклюшных микробов в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6-9,8 и белковую фракцию коклюшных микробов в 0,1 М трис- соляно-кислом буферном растворе, и при наличии в исследуемой сыворотке титра антител к липополисахариду 1:1600 и вьше, а к белковой фракции коклюшных микробов и дезинтеграту паракоклюшны;с микробов ниже, чем к липополисахариду, диагностируют коклюшную инфекцию.

Подписное

Изобретение относится к способам серологической диагностики инфекционных заболеваний. Цель изобретения - повьшение специфичности способа. Очи- Тценный препарат белковой коклюшной ф ракции сорбируют на полистироловом планшете при рН 7,2-7,4 в 0,1-М трис-соляно-кислом буфере. Дезинтег- раты коклюшного и паракоклюшного мик- -роба липополисахарид коклюша сорбируют в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе при рН 9,6-9,8. При наличии в исследуемой сыворотке титра антител к липополисахариду 1:1600 и вьше, а к белковой фракции коклюшных; микробов и дезинтеграту паракоклюшных микробов ниже, чем к-,липополисахариду, диагностируют коклюшную инфекцию. § (Л