ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ SILENE VULGARIS (MOENCH) GARCKE Российский патент 2001 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей. Область применения - медицинская промышленность (получение нового вида сырья биологически активных веществ растительного происхождения для получения новых высокоэффективных лекарственных препаратов).

Питательные среды для выращивания каллусной ткани Silene vulgaris (Moench) Garcke, из литературных источников нами не выявлены. Наиболее близкой к заявленному изобретению является питательная среда для культивирования каллусной ткани бегонии краснолистной (RU патент 1761799, МКИ C 12 N 5/04, A 01 H 4/00) следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: пиридоксин 0,1; тиамин 0,1; никотиновая кислота 0,5; инозитол 40; сахароза 3%; 6-БАП 0,2; 2,4-Д 1; агар 6000.

Задачей настоящего изобретения является ускорение роста каллусной ткани с высоким выходом биомассы.

В этом состоит новый технический результат, находящийся в причинно-следственной связи с существенными признаками изобретения.

Технический результат достигается тем, что питательная среда содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂ - 332
MgSO₄•7H₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
FeSO₄•7H₂O - 27,85
Na₂ЭДТА - 37,25
H₃BO₃ - 6,2
MnSO₄•5H₂O - 24,1
ZnSO₄•7H₂O - 8,6
Na₂MoO₄ - 0,25
KI - 0,83
CuSO₄•5H₂O - 0,025
CoCl₂•6H₂O - 0,025
Фолиевая кислота - 0,5
Рибофлавин - 0,5
Биотин - 1,0
Ca-пантотенат - 1,0
Пиридоксин - 1,0
Тиамин хлорид - 1,0
Никотинамид - 2,0
Кобаламин - 0,0015
6-БАП - 0,5
2,4-Д - 0,5-2,0
Сахароза - 15000
Глюкоза - 15000
Агар - 8000
Вода - До 1 л
Для получения в пересадочной культуре гомогенно растущей биомассы каллусной ткани Silene vulgaris (M.) G. использовали четыре модификации питательной среды предлагаемого нами состава с различным соотношением фитогормонов: 6-БАП 0,5 мг/л, 2,4-Д 0,5 мг/л; 6-БАП 0,5 мг/л, 2,4-Д 1,0 мг/л; 6-БАП 0,5 мг/л, 2,4-Д 1,5 мг/л; 6-БАП 0,5 мг/л, 2,4-Д 2,0 мг/л.

Для приготовления среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП, 2,4-Д, сахарозу, глюкозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 2 г агара, разливают среду по 250 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 10 мин при 1 атм. Чашки Петри стерилизуют в сухожаровом шкафу при 180^oC, завернутые в бумагу Крафт. Ткань высаживают в возрасте 21 суток, инокулюм - 200-300 мг. Культивирование каллусной ткани проводится в термостате при 26±1^oC в условиях непрерывной темноты.

Результаты исследований представлены в таблице.

Основное количество биомассы накапливается между 21 и 23 сутками культивирования, затем ткань переходит к фазе замедленного роста и к 30 суткам ее рост практически прекращается, появляются некрозы, ткань теряет способность к дальнейшему росту.

Применение предложенных нами четырех модификаций состава питательной среды позволяет получить быстро растущую каллусную ткань с периодом субкультивирования 21 сутки Silene vulgaris (Moench) Garcke и с высоким выходом биомассы 7,14-12,77 г/л.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей. Может быть использовано в медицинской промышленности для получения новых высокоэффективных лекарственных препаратов. Агаризованную среду, содержащую макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу, витамины и гормоны роста, модифицируют гормональным составом 6-БАП и 2,4-Д. Среда дополнительно содержит фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Са-пантотенат и никотинамид как источник PP. Установление концентраций используемых солей и витаминов позволяет получить каллусную ткань с периодом субкультивирования 21 сутки и с выходом биомассы 7,14 - 12,77 г/л. 1 табл.

Питательная среда для культивирования каллусной ткани Silene vulgaris (Moench) Garcke, характеризующаяся тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂ - 332
MgSO₄7H₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
FeSO₄7H₂O - 27,85
Na₂ЭДТА - 37,25
H₃BO₃ - 6,2
MnSO₄5H₂O - 24,1
ZnSO₄7H₂O - 8,6
Na₂MoO₄ - 0,25
KI - 0,83
CuSO₄5H₂O - 0,025
CoCl₂6H₂O - 0,025
Фолиевая кислота - 0,5
Рибофлавин - 0,5
Биотин - 1,0
Са-пантотенат - 1,0
Пиридоксин - 1,0
Тиамин хлорид - 1,0
Никотинамид - 2,0
Кобаламин - 0,0015
6-БАП - 0,5
2,4-Д - 0,5 - 2,0
Сахароза - 15000
Глюкоза - 15000
Агар - 8000
Вода - До 1 л