ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ БОЛИГОЛОВА ПЯТНИСТОГО (Conium maculatum L) Российский патент 2016 года по МПК C12N5/04 A01H5/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в медицине для получения сырья, содержащего биологически активные вещества, а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за выделения ядовитых соединений в питательную среду.

Область применения - медицинская (фармацевтическая) промышленность, получение нового вида сырья в качестве источника биологически активных веществ растительного происхождения (в частности, алкалоидов) для получения новых высокоэффективных лекарственных препаратов.

Питательная среда содержит KNO₃, NH₄NO₃, CaCl₂×2H₂O, MgSO₄×7H₂O, KH₂PO₄, FeSO₄×7H₂O, Na₂EDTA×2H₂O, Н₃ВО₃, MnSO₄×4H₂O, ZnSO₄×7H₂O, KI, Na₂MoO₄2H₂O, CuSO₄×5H₂O, CoCl₂×6H₂O, никотиновую кислоту, тиамин, пиридоксин, НУК, 6-БАП, сахарозу, агар-агар и воду при заданных соотношениях компонентов. Изобретение позволяет культивировать клеточную культуру Conium maculatum.

Болиголов пятнистый обладает широким спектром фармакологической активности. В народной медицине спиртовые настойки из болиголова применяются в качестве антибактериальных, гемостатических, общеукрепляющих средств, оказывают противовоспалительное, жаропонижающее и др. эффекты.

Известна питательная среда для культивирования каллусной ткани silene vulgaris (moench) garcke (Патент РФ 2169769, МПК C12N 5/04).

Питательная среда для культивирования каллусной ткани silene vulgaris (moench) garcke содержит макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: фолиевую кислоту 0,5; рибофлавин 0,5; биотин 1,0; Са-пантотенат 1,0; пиридоксин 1,0; тиамин хлорид 1,0; никотинамид 2,0; кобаламин 0,0015; кинетин 1,5 мг/л или 6-БАП 0,5 мг/л; 2,4-Д 1,5-2,0 мг/л; сахарозу 1,5%; глюкозу 1,5%; агар 8000 мг/л, воду до 1 л.

Известна питательная среда для культивирования каллусной культуры artemisia annua 1. (Патент РФ, 2393217, МПК C12N 5/04).

Питательная среда для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. содержит агаризованную среду с макро- и микросолями по Мурасиге и Скугу, витамины, сахарозу, в качестве гормонов добавляют 6-БАП (6-бензиламинопурин) и НУК (α-нафтилуксусную кислоту) в соотношении 6-БАП - 0,2/ НУК - 0,5-1,0.

Известна питательная среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов (Патент РФ 2081561, МПК C12N 5/02, C12N 5, А01Н 4).

среде следующего состава (мг/л): KH₂PO₄-300-500; K₂HPO₄3H₂O-300-500; (NH₄)₂SO₄-800-1000; NH₄NO₃ 2500-3800; MgSO₄7H₂O 1000-1500; Ca(NO₃)₂4H₂O - 1000-2000; NH₄Cl 100-200; FeSO₄4H₂O 60-80; NaEDTA - 100-200; Н₃ВО₃ 10-12; KJ 700-1000; CoCl₂6H₂O - 800-1000; NaMoO₄2H₂O 0,2-0,3; MnSO₄5H₂O - 0,22-0,23; CuSO₄5H₂O 0,015-0,025; ZnSO₄4H₂O - 1,7-8,6; тиамин 1-1,5; агар-агар 65000; сахароза 120000-130000.

Недостатками известных аналогов является их направленность на культивирование определенных видов растений: silene vulgaris, artemisia annua 1. раувольфии змеиной, следовательно, оптимизированная среда для выращивания этих видов не подойдет для выращивания Conium maculatum L.

Дополнительно в среду для культивирования silene vulgaris (moench) garcke добавляют фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Са-пантотенат, кобаламин и глюкозу, среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной содержит повышенное содержание сахарозы, это усложняет приготовление питательной среды и увеличивает ее стоимость.

Питательные среды для выращивания каллусной ткани Conium maculatum L из литературных источников нами не выявлены.

Задачей настоящего изобретения является ускорение роста каллусной ткани с высоким выходом биомассы.

Поставленная задача решается следующим образо: культивирование ткани производится на питательной агаризованной среде MS с добавлением витаминов, фитогормонов, сахарозы.

Содержание компонентов в питательной среде Мурасиге-Скуга представлено в таблице 1.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, хлорида кальция, хелата железа, витаминов. Макро- и микросоли, хлорид кальция, хелат железа, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и бумагой стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. В простерилизованную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют стимуляторы роста 1-3 НУК и 0,1 - 16-БАП, перемешивают и разливают в стерильные культуральные сосуды по 15 мл в каждый.

Ткань пересаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Прирост каллусной ткани болиголова пятнистого оценивали в виде индекса прироста массы (таблица 2), который рассчитывается по формуле:

,

где m₀ - начальная масса, г; m - конечная масса, г.

Технический результат - культивирование каллусной ткани Conium maculatum L, а также получение высоких значений прироста биомассы.

Пример 1

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄×7H₂O 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄×4H₂O - 32,3 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O - 37,3 мг/л, Na₂EDTA×2H₂O - 27,8 мг/л), CaCl₂×2H₂O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂×2H₂O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (2 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Пример 2

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄×7H₂O 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄×4H₂O - 32,3 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O - 37,3 мг/л, Na₂EDTA×2H₂O - 27,8 мг/л), CaCl₂×2H₂O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl -0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂×2H₂O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Пример 3

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄×7H₂O 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄×4H₂O - 32,3 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O - 37,3 мг/л, Na₂EDTA×2H₂O - 27,8 мг/л), CaCl₂×2H₂O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂×2H₂O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (1 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для культивирования каллусной ткани болиголова пятнистого, содержащую компоненты в следующем количестве, мг/л: KNO₃ 1900; KH₂PO₄ 170; NH₄NO₃ 1650; MgSO₄×7H₂O 370; CaCl₂×2H₂O 440; FeSO₄×7H₂O 37,3; Na₂EDTA×2H₂O 27,8; KI 0,83; H₃BO₃ 6,2; MnSO₄×4H₂O 22,3; CoCl₂×6Н₂О 0,025; CuSO₄×5Н₂О 0,025; ZnSO₄×7H₂O 8,6; Na₂MoO₄×2Н₂О 0,25; тиамин-HCl 0,5-1,5; пиридоксин-HCl 0,4-0,6; никотиновая кислота 0,4-0,6; сахароза 30000; агар-агар 10000; НУК 1-3; 6-БАП 0,1-1; вода дистиллированная - остальное. Изобретение позволяет культивировать каллусную ткань, а также получить высокие значения прироста биомассы Conium maculatum. 2 табл., 3 пр.

Питательная среда для культивирования каллусной ткани болиголова пятнистого, характеризующаяся тем, что содержит компоненты в следующем количестве, мг/л:
KNO₃ 1900 KH₂PO₄ 170 NH₄NO₃ 1650 MgSO₄×7H₂O 370 CaCl₂×2H₂O 440 FeSO₄×7H₂O 37,3 Na₂EDTA×2H₂O 27,8 KI 0,83 H₃BO₃ 6,2 MnSO₄×4H₂O 22,3 CoCl₂×6Н₂О 0,025 CuSO₄×5Н₂О 0,025 ZnSO₄×7H₂O 8,6 Na₂MoO₄×2Н₂О 0,25 тиамин-HCl 0,5-1,5 пиридоксин-HCl 0,4-0,6 никотиновая кислота 0,4-0,6 сахароза 30000 агар-агар 10000 НУК 1-3 6-БАП 0,1-1 вода дистиллированная остальное