СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК В СПЕРМАТОЗОИДЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N15/00 C12N15/06 

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для получения трансформированных сперматозоидов.

В настоящее время для получения трансгенных животных используют технику микроинъекции ДНК в пронуклеусы зигот, трансфекцию ES-клеток с пересадкой их в бластоцисту, а также инфицирование предъимплантационных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами. Эти процедуры отличаются ориентацией на конкретный вид животного, низкой эффективностью и большой трудоемкостью. Из сказанного следует, что в трансгении ощущается потребность в универсальном и эффективном векторе для доставки чужеродной ДНК в клетку-мишень. Таким вектором могут служить сперматозоиды, т.е. клетки, специализированные на доставке ДНК в ооцит. Использование сперматозоидов в качестве нативного вектора для переноса экзогенной ДНК в яйцеклетки характеризуется естественностью, универсальностью, технологичностью и высокой эффективностью. С помощью трансформированных сперматозоидов были получены трансгенные животные разных видов. Трансгены, привнесенные в зиготу спермием, экспрессировались и передавались потомству.

Известны следующие способы введения чужеродной ДНК /чДНК/ в сперматозоиды: самопроизвольное поглощение и принудительное пропитывание /импрегнация/ клеток чужеродной ДНК. Феномен спонтанного поглощения экзогенной ДНК в отсутствии семенной плазмы был описан для зрелых спермиев. Показано, что сперматозоиды способны переносить "захваченную" чДНК в яйцеклетку. Среди рожденных животных 30 особей содержали экзогенную ДНК. Однако, данный способ, несмотря на высокую результативность, отличается плохой воспроизводимостью. В основе другого подхода /импрегнация спермиев чДНК/ лежит применение различных химических и физических факторов на сперматозоиды с целью более эффективного проникновения чДНК в клетку. В качестве таких агентов используют диметилсульфоксид, электропорацию, а также предварительно заключают чДНК в липосомы /липофекация/. В результате применения указанных способов обработки сперматозоидов часто нарушаются физиологические функции спермиев: падает подвижность, разрушается цитоплазматическая мембрана, происходит спонтанная акросомальная реакция, теряется оплодотворяющая способность сперматозоидов. В связи с этим возникает проблема использования таких методов введения чДНК в мужские гаметы, которые бы не нарушали их биологических функций.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является способ, описанный Brackett. Согласно этому способу, сперматозоиды получают от половозрелых самцов кролика с помощью искусственной вагины. Клетки отмывают фосфатным раствором Кребса-Рингера и инкубируют с чДНК в синтетической среде для оплодотворения ин витро в течение 2 часов при 37-38^oC в атмосфере 5% CO₂ в присутствии 3 диметилсульфоксида /ДМСО/. После этого сперматозоиды отмывают раствором Кребса-Рингера и поддерживают в синтетической среде, содержащей 20% инактивированной кроличьей сыворотки, в атмосфере 5% CO₂ в течение 24-48 часов. Далее спермии вновь отмывают солевым раствором и используют для осеменения крольчих при помощи инъекции сперматозоидов в каждый из рогов матки.

Эффективность этого способа с точки зрения включения экзогенной ДНК в сперматозоиды составляет около 30% при частоте переноса чДНК в ооциты не более 40% а оплодотворяющая способность трансформированных спермиев достигает лишь 30-50% при плохой воспроизводимости результатов. Такой результат объясняется возможными повреждениями, которые накапливаются в клетках в результате продолжительного взаимодействия сперматозоидов с ДМСО и длительной инкубацией их в среде, поддерживающей метаболические процессы, что приводит к расходу энергетических ресурсов и утрате сперматозоидами биологических функций.

Технический эффект от использования предполагаемого изобретения заключается в увеличении количества сперматозоидов, содержащих чДНК при сохранении ими биологических функций, что позволит повысить частоту передачи чДНК в ооциты и достичь высокой оплодотворяемости яйцеклеток.

Технический эффект достигается за счет способа введения чужеродной ДНК в сперматозоиды, включающего получение сперматозоидов от донора, отмывку их от семенной жидкости солевым раствором и инкубирование суспензии сперматозоидов с вводимой ДНК в присутствии ДМСО при заданном температурном режиме, отличающегося тем, что перед отмывкой сперматозоиды подвергают флотации, а инкубирование суспензии сперматозоидов с вводимой ДНК осуществляют сначала при комнатной температуре в присутствии 1 ДМСО в течение 10 минут, затем концентрацию ДМСО доводят до 3 и смесь охлаждают до 0 -(+4^o) с последующим ее нагреванием до 42^oC.

Флотация позволяет отобрать клетки, обладающие высокой подвижностью и активно поглощающие чДНК. Дробное добавление ДМСО исключает возможные побочные эффекты действия этого реагента на клетки, а совместное применение ДМСО и теплового шока способствует увеличению продуктивности включения чДНК в сперматозоиды. Сокращение времени манипулирования со спермиями ин витро максимально сохраняет их биологические функции. Кроме того, использование солевого раствора Эрла, являющегося более бедной средой по сравнению со средой Кребса-Рингера, и низкой температуры инкубирования 0 (+4^o) вызывает временное замедление метаболических процессов, происходящих в сперматозоидах, а последующая тепловая обработка спермиев вновь активизирует метаболизм и восстанавливает подвижность их, что благоприятствует процессу оплодотворения.

В результате применения данного способа экзогенная ДНК включается не менее чем в 35% сперматозоидов, частота переноса составляет более 60% оплодотворяемость яйцеклеток не менее 80%
Таким образом, предлагаемый способ отличается от известного большей эффективностью и воспроизводимостью. Способ универсален и распространяется вне зависимости от клеток-мишеней на все типы сперматозоидов Metazoa, а также на все типы ДНК независимо от ее происхождения. Метод может найти широкое применение при изучении регуляции генов на ранних стадиях эмбриогенеза, в тератологии, в пренатальной генотерапии и при создании трансгенных животных.

Предлагаемый способ введения чужеродной ДНК в сперматозоиды сводится к следующей последовательности операций.

Сперму получают от половозрелых самцов с помощью искусственной вагины и подвергают флотации в 10-ти кратном объеме среды Эрла. Фракцию подвижных спермиев дважды отмывают средой и доводят до определенной концентрации. К суспензии клеток в среде Эрла добавляют ДМСО в количестве 1% и экзогенную ДНК. Через 10 минут инкубирования при комнатной температуре добавляют ДМСО до 3% и в течение 20 минут охлаждают до 0-(+4)^o, а затем помещают на 2 минуты в водяную баню с температурой 42^oC. Суспензию клеток разводят в три раза средой Эрла и используют для осеменения.

Для отработки данного способа, а также в виде примера использовали сперматозоиды кролика и репортерную ДНК pRK3lacZ. Плазмида pRK3lacZ кодирует фермент β-галактозидазу, который можно идентифицировать при помощи гистохимического окрашивания, используя хромогенный субстрат X-gal. Сине-зеленая окраска опытных зародышей свидетельствует об успешном выполнении спермиями векторных функций.

Эффективность предлагаемого способа оценивали по продуктивности включения чДНК в сперматозоиды с помощью иммунохимического метода обнаружения чДНК, меченной дигоксигенином. Частоту переноса чДНК спермиями в ооциты в результате оплодотворения и оплодотворяющую способность сперматозоидов, выражающуюся в доле оплодотворенных яйцеклеток, определяли после гистохимического окрашивания ранних эмбрионов.

Пример, иллюстрирующий предлагаемый способ.

Кроличью сперму получали от половозрелых самцов породы шиншилла с помощью искусственной вагины. В опыт брали эякулят от 2-3 самцов. Активные сперматозоиды отделяли от неподвижных флотацией в 10-ти кратном объеме среды Эрла. Суспензию подвижных клеток дважды центрифугировали при 200 g в течение 5 минут. Осадок ресуспендировали в среде Эрла до конечной концентрации 10⁷ кл/мл. К 500 мкл исходной суспензии сперматозоидов кролик добавляли ДМСО до 1% и в толщу суспензии вводили ДНК pRK3lacZ (10 мкг в 50 мкл буфера ТЕ). Смесь тщательно перемешивали и выдерживали 10 минут при комнатной температуре, после чего добавляли еще раз ДМСО до 3% Затем ее охлаждали в течение 20 минут до 0-(+4^o) и сразу помещали на 2 минуты в водяную баню с температурой 42^oC. Суспензию трансформированных сперматозоидов в три раза разводили средой Эрла и использовали для искусственного осеменения крольчих (500 мкл на одну самку). Перед осеменением определяли количество трансформированных сперматозоидов иммунохимическим методом обнаружения чДНК, меченной дигоксигенином. Через 46 часов после осеменения из яйцеводов крольчих вымывали эмбрионы, которые подвергали гистохимическому окрашиванию, используя хромогенный субстрат X-gal. После окрашивания определяли частоту переноса чДНК спермиями в ооциты и оплодотворяющую способность трансформированных сперматозоидов. Результаты представлены в таблице.

Использование: изобретение относится к области генетической инженерии и может быть использовано для получения трансформированных сперматозоидов. Сущность изобретения: технический эффект достигается за счет того, что перед отмывкой сперматозоидов от семенной жидкости их подвергают флотации, а инкубирование суспензии сперматозоидов с вводимой ДНК осуществляют сначала при комнатной температуре в присутствии 1% ДМСО, затем концентрацию ДМСО доводят до 3% и смесь охлаждают до 0-(+4)^o с последующим нагреванием ее до 42^oC. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ введения чужеродной ДНК в сперматозоиды, включающий получение сперматозоидов от донора, отмывку их от семенной жидкости солевым раствором и инкубирование суспензии сперматозоидов с вводимой ДНК в присутствии ДМСО при заданном температурном режиме, отличающийся тем, что перед отмывкой сперматозоиды подвергают флотации в солевом растворе, а инкубирование осуществляют сначала при комнатной температуре в присутствии 1% ДМСО, затем концентрацию доводят до 3% а смесь охлаждают до 0^oС с последующим нагреванием до 42^oС. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инкубирование сперматозоидов с вводимой ДНК в присутствии 1% ДМСО осуществляют в течение 10 мин, при охлаждении до 0^oС выдерживают 20 мин и нагревают до 42^oС в течение 2 мин.