СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕЙ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/12 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к медицинской промышленности, и может быть использовано для получения солей гликозаминогликанов из соединительной ткани, применяемых в качестве лекарственных средств.

Ближайшим аналогом получения гликозаминогликанов является способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из роговиц сельскохозяйственных животных путем гидролиза раствором фермента-папаина с последующим кипячением, добавлением трихлоруксусной кислоты и диализом (патент РФ N 2056851).

Недостатком указанного способа является то, что в ткани обработанной одним ферментом, часть гликозаминогликанов остается в неразрушенной ткани, особенно если неразрушенная ткань плотная, что приводит к снижению выхода целевого продукта. С помощью данного способа могут быть получены только растворенные гликозаминогликаны.

Задачей изобретения является разработка универсального способа получения солей гликозаминогликанов, содержащихся в соединительных тканях.

Техническим результатом изобретения является получение целевого продукта с высоким содержанием солей гликозаминогликанов в виде твердого сухого препарата.

Технический результат достигается тем, что согласно изобретению в способе получения солей гликозаминогликанов соединительную ткань измельчают до гомогенного состояния и проводят последовательный гидролиз раствором коллагеназы и смесью протеолитических ферментов химотрипсина и папаина, кипятят, центрифугируют при 3-5 тыс. об/мин, диализируют в течение 5-6 дней, затем повторно центрифугируют, обрабатывают ионообменными смолами, осаждают гликозаминогликаны этанолом, насыщенными ацетатами металлов, промывают 80% и 96,6% этанолом и высушивают эфиром для наркоза.

Способ осуществляется следующим образом.

Измельчение соединительной ткани (роговиц, хрящей, плавников акул, стекловидного тела) проводят механическим способом на ультраразмельчителе до получения однородной массы.

Гидролиз ткани ведут ферментативным способом, при этом в начале используют фермент-коллагеназу, поскольку этот фермент специфически расщепляет молекулы коллагена - белка, с которыми гликозаминогликаны тесно связаны (расположены между фибрилл коллагеновых волокон). Оптимальная концентрация коллагеназы - 0,33%. Фермент эффективно расщепляет коллаген при температуре 37^oC. Гидролиз с коллагеназой ведут не более 6 часов, поскольку при более длительной обработке выход конечного продукта не увеличивается. Затем температура реакционной смеси повышают до 60-65^oC и добавляют в раствор смесь протеолитических ферментов химотрипсина и папаина в соотношении 1:1, поскольку эта смесь наиболее эффективно расщепляет все остальные компоненты соединительной ткани. Гидролиз осуществляют при температуре 65^oC, pH 6,5, в течение 4 часов, так как это оптимальные параметры фермент-субстратного взаимодействия. После гидролиза раствор кипятят в течение 15 минут, предварительно добавив в него трихлоруксусную кислоту (до конечной концентрации 5%). После гидролиза полученный гомогенат центрифугируют при 3-5 тыс. об/мин. При центрифугировании менее 3 тыс. об/мин осаждается менее 50% гидролизата, а при скорости более 5 тыс. об/мин часть основного продукта уходит в осадок.

Диализ надосадка гидролизата проводят в течение 5-6 дней. При диализе менее 5 дней в растворе обнаруживаются примеси в виде солей и белка, а при диализе более 6 дней состав гликозаминогликанов остается постоянным, что делает продолжение диализа нецелесообразным.

Центрифугирование диализата позволяет удалить из раствора примеси.

Следующим существенным моментом в способе является обработка раствора диализата ионообменными смолами. Эта обработка позволяет переводить гликозаминагликана в кислую, кисло-солевую и основно-солевую формы. Для этого после центрифугирования в зависимости от потребности диализат обрабатывают кислой формой (H⁺-формой катионита с pH 2,0-3,0) ионообменной смолы, для перевода гликозаминогликанов в кислую форму, затем солевой формой для получения кисло-солевой формы целевого продукта (Na⁺-форма ионообменной смолы), которую осаждают этанолом, насыщенным ацетатом металла и получают основно-солевую форму гликозаминогликанов. В качестве ионообменных смол наиболее приемлемыми являются амберлиты марок IR 40-120 с pH 2,0-7,0.

После обработки раствора ионообменной смолой гликозаминогликаны осаждают этанолом, насыщенным ацетатом металла, что позволяет получить кислую, кисло-солевую и основно-солевую формы конечного продукта.

После осаждения гликозаминогликаны промывают один раз 80% этанолом и не менее 3-х раз 96,6% этанолом, затем высушивают медицинским эфиром для наркоза. При необходимости окончательное высушивание проводят в эксикаторе с силикагелем в вакууме.

Количественный и качественный анализ полученного порошка гликозаминогликанов делают по Временной Фармакопейной Статье N 42-2678-96 на препарат "Сульфатированные гликозаминогликаны".

Выполнение способа получения гликозаминогликанов.

Пример 1. Из глаз свиней бритвой вырезают роговицы и помещают их в стеклянный сосуд до общей массы 1 кг, после чего их измельчают до получения гомогенной массы.

Гидролиз роговиц начинают при температуре 37^oC в 0,33% коллагеназе, которую добавляют в гомогенат. Через 6 часов гомогенат центрифугируют и надосадок сливают. В гомогенат добавляют смесь ферментов - 50 мл 0,01% раствора трипсина и 50 мл 0,125% папаина в соотношении 1:1. Температуру доводят до 65^oC в течение 4-5 часов. После этого в гидролизат добавляют трихлоруксусную кислоту (до 5%) и кипятят в течение 5-30 мин. После остывания смесь помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют при 3 тыс. об/мин.

Надосадок сливают и обрабатывают раствор гликозаминогликанов ионообменной смолой IR-120 (амберлит H⁺-форма), для перевода гликозаминогликанов в кислую форму, а затем Na⁺-формой для получения кисло-солевой формы конечного продукта.

Далее целевой продукт осаждают охлажденным 96,6% этанолом, насыщенным ацетатом натрия и получают основную форму гликозаминогликанов.

Смесь оставляют на 24-48 часов для концентрации осадка при температуре 2-4^oC, промывают один раз 80% и три раза 96,6% этанолом и высушивают эфиром для наркоза. Окончательно продукт высушивают в эксикаторе с силикагелем в вакууме.

Данный способ позволяет получать соли гликозаминогликанов в твердом сухом виде для использования в качестве лекарственных средств.

Изобретение относится к медицине, а конкретно к медицинской промышленности, и может быть использовано для получения солей гликозаминогликанов из соединительной ткани, применяемых в качестве лекарственных средств. Соединительную ткань измельчают, последовательно гидролизуют раствором коллагеназа и смесью химотрипсина и папаина, после кипячения центрифугируют при 3-5 тыс. об/мин, диализуют в течение 5-6 дней, центрифугируют, обрабатывают ионообменными смолами, осаждают гилкозаминогликаны этанолом, насыщенным ацетатом металлов, промывают 80 и 96,6% этанолом и высушивают эфиром для наркоза. Технический результат: получение целевого продукта с высоким содержанием соли гликозаминогликанов в виде твердого сухого препарата.

Способ получения солей гликозаминогликанов, включающий ферментативный гидролиз ткани, кипячение с добавлением трихлоруксусной кислоты и диализ, отличающийся тем, что ткань измельчают, последовательно гидролизуют раствором коллагеназы и смесью химотрипсина и папаина, после кипячения центрифугируют при 3-5 тыс. об/мин, диализуют в течение 5-6 дней, центрифугируют, обрабатывают ионообменными смолами, осаждают гликозаминогликаны этанолом, насыщенным ацетатом металлов, промывают 80 и 96,6% этанолом и высушивают эфиром для наркоза.