СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЙ ТКАНЕЙ ОРГАНИЗМА Российский патент 2003 года по МПК A61K35/32 A61K35/36 A61K38/17 A61K38/39 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, а именно к способам получения лекарственных средств, и клеточной биологии и может быть использовано при лечении различных патологий тканей организма, в том числе восстановления тканей и пр.

Коллаген - основной белок соединительной ткани, составляющий у млекопитающих 50-60% всех белков организма. Он содержится во всех его тканях, особенно много его в шкуре и сухожилиях.

Коллаген доступен в достаточно больших количествах. Он биосовместим, имеет очень слабую иммуногенность и является хорошим субстратом для всех типов клеток. Это обусловило его широкое применение в медицине (Chvapil M.W. , van Wrinkle W., "Medical and surgical application of collagen", International Reviews of Connective Tissue Research, v.6, p. 1-60, 1973) и в клеточном культивировании ( Ehrmann R.L., Gey G.O, "The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen", J. of National Cancer Institute, V. 16, p. 1375-1403, 1956 г. ; Bell E., Ivarson В., Merrill C. "Production of a tissuelike structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro". Proceedings of National Academy of Sciences of USA, v.76, p. 1274-1278, 1979 г.).

Структура коллагена в настоящее время хорошо известна. Он является фибриллярным белком; основная часть его молекулы представляет собой жесткую спираль из трех полипептидных цепей с неспиральными участками на концах. Нативный коллаген, т. е. коллаген с неповрежденной тройной спиралью, в физиологических условиях - при ионной силе 0,15 М хлористого натрия NaCl, рН 7-7,5 и температуре 37^oC дает гели, являющиеся по структуре аналогом соединительной ткани. Все типы клеток при включении в такие гели или нанесении на их поверхность живут и размножаются.

Нативный коллаген получают экстракцией коллагенсодержащих тканей, главным образом кожи или сухожилий, кислыми растворами или путем их обработки ферментами, чаще всего пепсином. При этом ферментативная обработка удаляет неспиральные участки молекулы, обеспечивающие в гелях межмолекулярную сшивку, и прочность гелей значительно понижается. Полученный без ферментативной обработки коллаген дает более прочные гели, что позволяет снизить его концентрацию, но требует очень тщательной очистки, т.к. сам коллаген является очень слабым иммуногеном, и по большей части его иммуногенность объясняется наличием примесей (Chvapil M., van Wrinkle W., Internal. Rev. Connect. Tis. Res., v. 6, p. 1-60, 1973 ). Очистку коллагена производят обычно путем осаждения, чаще всего хлористым натрием, из кислого или нейтрального раствора; возможна также очистка осаждением при диализе против щелочного раствора, обычно 0,02 М двузамещенного фосфата натрия Na₂HPО₄. Такое осаждение идет медленно и требует многократной смены диализного раствора. При этом сочетание осаждения из кислой и из нейтральной или щелочной среды дает более высокую степень очистки, т. к. удаляет различные примеси (E.J. Miller, B. Wray, "Preparation and characterization ofcollagens", Methods in enzymology, v.82, p. 33-64, 1982).

В патенте США 3949073, МПК: A 61 K 37/00, опубл. 6.04.1976, предложен способ укрепления соединительной ткани различных типов у млекопитающих при помощи введения в место укрепления полимеризующегося in situ раствора нативного коллагена, полученного с применением пепсина, т.е. лишенного неспиральных концов молекулы. Такие растворы коллагена могут быть введены в организм путем инъекции или нанесены на поверхность раны; при температуре тела эти растворы превращаются в гель. В них могут быть включены любые клетки, возможна также добавка к таким растворам других компонентов внеклеточного матрикса или лекарственных веществ. Это обусловило применение нативного коллагена, полученного с применением пепсина, с добавлением клеток и лекарственных препаратов или без них, для репарации различных тканевых патологий.

Нативный коллаген с сохраненными неспиральными концами молекулы также применялся для лечения ран (заявка 2000115816 на изобретение РФ, МКИ A 61 K 35/48, опубл. 13.06.2000) и в клеточном культивировании для получения различных тканевых эквивалентов (пат. США 4485096, МКИ A 61 K 35/12, опубл. 27.11.1984). В пат. США 4485096 нативный коллаген получали из сухожилий крысиного хвоста, в указанной выше заявке из сухожилий крысиного хвоста или из шкуры телят. Способ получения коллагена из шкуры телят в указанной выше заявке аналогичен методу П. М. Гэллопа, С. Зейферта (см. ниже) со всеми присущими последнему недостатками. Способ получения коллагена из сухожилий крысиного хвоста в обоих патентах не включает предварительной отмывки материала от неколлагеновых белков, что снижает чистоту коллагена (см. ниже).

Настоящее изобретение предлагает новый способ получения нативного коллагена с сохраненными неспиральными концами, пригодного для медицины и клеточного культивирования.

Известен способ получения коллагена по патенту США 5106949, МПК A 61 K 35/32, опубл. 21.04.1992 г. Согласно патенту коллаген получают из сухожилий (предпочтительно сухожилий сгибателя копыта телят). Далее производят следующие операции:
- удаляют оболочки сухожилий;
- измельчают материал;
- промывают измельченный материал физиологическим фосфатным буфером (PBS) (2 г хлористого калия КС1, 2 г однозамещенного фосфорнокислого калия KH₂РО₄, 80 г хлористого натрия и 79,3 г двузамещенного фосфата натрия на 1 л раствора), рН 6,5-8,5, разбавленным 1:3-1:1; наиболее эффективен разбавленный 1: 3 PBS с ионной силой 0,05 М (0,05 молярного) NaCl и 0,0022 М Na₂HPO₄ (6-кратная промывка по 2 ч);
- экстрагируют коллаген слабой кислотой (0,5-2 М уксусная кислота); предпочтительно 0,5 М уксусная кислота с добавкой 4 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА);
- осаждают коллаген с помощью NaCl (0,6-1,8 М);
- выделяют осадок и растворяют его в уксусной кислоте;
- переводят раствор диализом в 0,01 М уксусную кислоту.

Способ имеет следующие недостатки.

В качестве сырья используются сухожилия сгибателя копыт телят. Это недорогой материал, но его нужно специально собирать и обрабатывать (собирать и замораживать копыта сразу после забоя телят, затем перед получением коллагена размораживать их, извлекать сухожилия и очищать их от оболочек).

Использование в технологическом процессе всего одной стадии очистки коллагена осаждением хлористым натрием не может дать продукт нужной степени чистоты.

В способе по патенту США 5562946, МПК В 05 В 01/04, опубл. 08.10.95 г., коллаген получают из кожи зародышей свиней. Замораживают матки свиней вместе с зародышами, затем стерильно размораживают, извлекают зародыши и снимают с них кожу. Способ включает следующие операции:
- снимают кожу;
- измельчают материал;
- промывают измельченный материал разбавленным 1:2 физиологическим фосфатным буфером, как и в предыдущем патенте;
- экстрагируют коллаген 0,5 М уксусной кислотой;
- очищают коллаген осаждением 0,9 М хлористым натрием (операция производится последовательно дважды);
- растворяют осадок в уксусной кислоте;
- переводят раствор диализом в 0,01 М уксусную кислоту.

Как видно из описания, операции этого способа совпадают с операциями предыдущего способа, за исключением используемого сырья и введения повторной операции очистки осаждением хлористым натрием. В качестве предпочтительного сырья используется кожа зародышей свиней - материал трудно доступный. Кожа взрослых или молодых свиней, также упомянутая в патенте как источник получения коллагена, потребовала бы предварительного удаления щетины и жирового слоя, о чем в рецептуре не упомянуто. Двух последовательных осаждений хлористым натрием из кислой среды также недостаточно для получения нужного качества продукции.

В статье П. М.Гэллопа и С.Зейферта "Получение растворимого коллагена и его свойства" (P. M. Gallop and S. Seifter "Preparation and properties of soluble collagen", Methods in Enzymology, A. P., N.Y., v.6, 1963 г., р. 635-641) описан способ, в качестве сырья в котором использована телячья шкура, с которой срезают рыхлую соединительную ткань и сбривают волосы.

Способ включает следующие операции:
- измельчают материал;
- промывают измельченный материал 0,5 М раствором NaOOCCH₃ (ацетата натрия);
- осуществляют три последовательные экстракции с предварительной гомогенизацией ткани для выведения неколлагеновых белков и протеогликанов;
- экстрагируют коллаген 0,075 М цитратным буфером, рН 3,7 (смесь равных объемов растворов 0,05 М раствора трехзамещенного цитрата натрия Na₃C₈H₈O₇ и 0,1 М лимонной кислоты H₃C₈H₈O₇);
- отделяют экстракт центрифугированием;
- очищают коллаген осаждением экстракта при помощи диализа против 0,02 М двузамещенного фосфата натрия;
- отделяют осадок коллагена центрифугированием;
- промывают осадок коллагена водой, затем его сушат и растворяют в том же цитратном буфере.

Этот способ имеет следующие недостатки:
Удаление волос с телячьей шкуры производится механически - сбриванием. Подобная процедура трудоемка и не позволяет полностью удалить волосы, что затрудняет последующую промывку и гомогенизацию и таким образом снижает чистоту продукции и уменьшает ее выход.

Низкий выход продукта - около 1% в расчете на сырую ткань.

Всего одна ступень очистки коллагена - осаждением при диализе против 0,02 М двузамещенного фосфата натрия, т.е. из щелочной среды - снижает качество продукции.

В патенте США 4019956, МПК: С 112 В 001/00, опубл. 30.07.1977 г. "Процесс сохранения волоса шкуры путем растворения шкуры или кожи" предложен другой способ обработки шкуры. Шкуру обрабатывали бактериальной протеазой в растворе тетрабората натрия Na₂B₄O₇ с 1-10% мочевины CO(NH₂)₂, рН 8-10 при 50^oC и с содержанием фермента 0,5-5% от веса сухой шкуры. Шкура или кожа полностью растворялась, волосы оставались.

Наиболее близким решением к предлагаемому можно считать способ, предложенный в статье П.М.Гэллопа и С.Зейферта "Получение растворимого коллагена и его свойства" (см. выше).

Задача предлагаемого решения - получение коллагена улучшенного качества с наименьшими затратами, пригодного для медицины и клеточного культивирования.

Для решения поставленной задачи в способе получения коллагена для лечения патологий тканей организма, включающем операции очистки и размельчения коллагенсодержащего сырья, экстрагирования неколлагеновых белков, экстрагирования коллагена, его очистки и растворения, изменены некоторые операции. Способ отличается от известных тем, что экстрагирование неколлагеновых белков производят 0,30-0,02 М Na₂HPO₄, рН 8,7-9,1, экстрагирование коллагена производят органической кислотой, очистку коллагена производят последовательно осаждением NaCl из кислого раствора и диализом против 0,02 М Na₂HPО₄, растворение коллагена производят диализом против 1 М - 0,017 М уксусной кислоты.

Способ позволяет использовать различное сырье, в том числе кожу человека, любые сухожилия и шкуры животных, с поверхности которых удаляют волос с применением бактериальной протеазы в количестве 0,125-0,1% от веса сырой шкуры в 0,05 М трис-буфере, рН 8, при температуре до 12^oС в течение 48-72 ч.

В качестве бактериальной протеазы может быть использована протеаза из Bacillus licheniformis.

В качестве органической кислоты при экстракции коллагена может быть использована уксусная, лимонная или муравьиная кислота, в том числе 0,5-2 М уксусная кислота.

Осаждение коллагена производят 0,6-1,8 М NaCl, причем возможно повторение этой операции.

После первого осаждения осадок коллагена растворяется в 1 М уксусной кислоте.

В процессе растворения коллагена производят стерилизацию коллагена добавлением к диализному раствору 1 М уксусной кислоты 0,5% хлороформа.

Растворенный коллаген переводят в 0,017 М уксусную кислоту тремя последовательными диализами против указанной кислоты.

Предлагаемая операция подготовки сырья обеспечивает сохранение нативной структуры коллагена, а также расширяет номенклатуру используемого сырья, что упрощает организацию производственного процесса и снижает себестоимость продукции. Предлагаемый состав для предварительной отмывки исходного материала более эффективно растворяет неколлагеновые белки, разрыхляет структуру материала, способствует его набуханию в кислоте при последующих операциях и повышает выход коллагена. Применение при очистке осаждения коллагена как из кислой среды, так и при диализе против щелочного раствора, способствует повышению качества продукции.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве сырья используют шкуры животных (телят, коров, овец, кроликов и т.д.), возможно использование человеческой кожи, а также сухожилий. Далее приводится процесс изготовления коллагена из шкур животных.

Шкуру, свежую или размороженную (но замороженную сразу после забоя животного), отмывают от крови дистиллированной водой. Затем срезают рыхлую соединительную ткань.

Далее со шкуры удаляют волосы ферментативным методом с применением протеазы Bacillus licheniformis, которая используется в способе, описанном в патенте США 4019956, см. выше, однако предлагается иной режим проведения данной операции. Применяемая протеаза представляет собой концентрат культуральной жидкости Bacillus licheniformis, полученный в результате ее ультрафильтрации и лиофильной сушки (сушки при низкой температуре). Это щелочная протеаза с оптимумом активности при рН 8 и температуре 60^oC. Поскольку при температуре 60^oC происходит разрушение нативной структуры коллагена, была проведена работа по исследованию возможности применения этого фермента при температурах не выше 12^oC, с минимально возможным количеством фермента, и определено время проведения процесса. На основании этих исследований в предлагаемом способе применены менее жесткие условия - удаление волос производят при количестве фермента 0,125-0,1% от веса сырой шкуры в 0,05 М трис-буфере, рН 8, при температуре 4-10^oC течение 48-72 ч. Таким образом применяется более низкая температура, в растворе отсутствуют денатурирующие добавки (мочевина) и значительно более низкая концентрация фермента. При такой обработке разрушается только базальная мембрана, и волосы с эпидермой отделяются от неповрежденной дермы. Этим обеспечено сохранение нативной структуры коллагена.

Освобожденную от волос дерму отмывают от фермента водой, затем полученный материал измельчают.

Измельченный материал обрабатывают большими объемами 0,05-0,02 М Na₂HPО₄, pH 8,7-9,1 для выведения неколлагеновых белков. Операцию экстракции повторяют шестикратно. Двузамещенный фосфат натрия, как и другие реактивы, используемые при получении и очистке коллагена - хлористый натрий, уксусная кислота и хлороформ, изготовляются промышленно и имеются в торговой сети. Применялись реактивы квалификации чистоты не ниже х.ч. (химически чистый), и все растворы готовились на деионизованной или бидистиллированной воде (вода, специально очищенная для клеточного культивирования). Все операции производят при температуре не выше 12^oC.

Далее производят три последовательные экстракции коллагена 0,5-2 М уксусной кислотой (предпочтительно 0,5 М с добавкой 5 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА) с предварительной гомогенизацией ткани (не растворившуюся ткань отделяют от экстракта центрифугированием), а затем осуществляют осаждение коллагена из объединенных экстрактов 0,6-1,8 М NaCl, предпочтительно 0,9 М NaCl.

Осадок коллагена отделяют центрифугированием и растворяют его в уксусной кислоте (предпочтительно 1 М). Не растворившиеся агрегаты отделяют повторным центрифугированием и переосаждают коллаген NaCl, предпочтительно 0,9 М. Далее повторяют операции отделения осадка коллагена центрифугированием, растворения его в уксусной кислоте, отделения центрифугированием агрегатов, если они есть, и производят диализ раствора против большого количества (20-50 объемов) 0,02 М Na₂HPО₄ с 4-5 переменами раствора для третьего переосаждения коллагена. Диализ - замена растворителя в растворе высокомолекулярного соединения. Высокомолекулярное соединение, в данном случае, коллаген, помещают в мешок из пленки, чаще всего ацетилцеллюлозы, проницаемой только для низкомолекулярных соединений - солей и кислот, и непроницаемой для высокомолекулярных, и помещают мешок в сравнительно большое количество - 10-50-кратное по отношению к объему содержимого мешка - того растворителя, в который вещество нужно перенести. Выравнивание концентраций происходит путем диффузии; обычно требуется 3 перемены диализного (внешнего) раствора. При переосаждении коллагена путем диализа против 0,02 М двузамещенного фосфата натрия требуется, как указывалось выше, 3-4 перемены раствора.

Далее производят обработку полученного коллагена - растворение и стерилизацию. Для этого отделяют осадок коллагена центрифугированием, добавляют к нему ледяную уксусную кислоту до концентрации 0,5-1 М, переносят осадок в диализный мешок и диализуют против 10-20 объемов 1 М уксусной кислоты с добавлением 0,5% хлороформа в течение 2 суток. Перенос в диализный мешок именно диспергированного с кислотой осадка, без предварительного его растворения позволяет получить на выходе достаточно концентрированный раствор коллагена.

Далее коллаген переводят диализом в 0,017 М уксусную кислоту, т.к. только такая или более низкая концентрация уксусной кислоты хорошо переносится клетками млекопитающих и человека, что необходимо для биологического и медицинского применения коллагена. Для этого производят три последовательных диализа раствора коллагена против 20-30 объемов указанной кислоты, каждый в течение суток.

Затем полученный вязкий раствор коллагена стерильно разливают по пенициллиновым флаконам. Полученный раствор имеет обычно концентрацию 7-10 мг/мл, выход 4-6% от веса сырой обезволошенной дермы.

Предлагаемый технологический процесс изготовления имеет следующие преимущества перед известными:
1. Ферментативное мягкое снятие волоса без повреждения дермы. Это способствует диспергированию ткани и повышению выхода коллагена. Полное предварительное снятие волоса также способствует получению более чистого продукта.

2. Предварительная отмывка неколлагеновых белков раствором двузамещенного фосфата натрия с рН 8,7-9,1, предпочтительно ионной силы 0,05-0,02 М. Такой раствор является осадителем коллагена, достаточно хорошо растворяет неколлагеновые белки и, по-видимому, из-за своей низкой ионной силы, разрыхляет структуру дермы, способствуя ее набуханию в кислоте и повышению выхода коллагена.

3. Три ступени очистки коллагена переосаждением, включающие осаждение как из кислой, так и из щелочной среды, позволяют получить продукт высокой степени чистоты.

Ниже в таблице 1 приведены результаты сравнительного анализа различных способов получения коллагена из телячьей шкуры с удаленными волосами.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить с высоким выходом коллаген высокого качества из дешевого и доступного сырья.

Лечение коллагеном, полученным по указанной методике, различных патологий тканей организма млекопитающих и человека производится следующим образом. Для усиления соединительной ткани применяли метод, аналогичный описанному в патенте США 3949073 - к стерильному раствору коллагена в 0,017 М уксусной кислоте при температуре 0^oC (на льду) стерильно добавляли 1/9 объема также охлажденного 10-кратного PBS с добавленным нетоксичным для клеток красителем феноловым красным (20 мг/л) или 10-кратной среды для культивирования клеток с тем же красителем, перемешивали и стерильно нейтрализовали смесь 1,5 М гидроокисью натрия NaOH. Все это перемешивали, помещали в охлажденный шприц и путем инъекции вводили в поврежденную ткань организма. В месте введения коллаген полимеризовывался (образовывал гель), и возникал аналог соединительной ткани, который в течение недели начинал заселяться фибробластами и васкуляризоваться.

Для разных тканей и патологий применяли различные концентрации коллагена, который, если необходимо, следует предварительно разбавить стерильной охлажденной водой до нужной концентрации. Например, для репарации мочевого сфинктера (лечение недержания мочи) применяют концентрацию коллагена 6-8 мг/мл, для закрытия кожных ран 23 мг/мл. К коллагену могут быть добавлены любые клетки, компоненты межклеточного матрикса или лекарственные препараты, как например в цитированной выше заявке 2000115816, где нативный коллаген с сохраненными неспиральными участками применялся для лечения кожных ран в сочетании с эмбриональными фибробластами человека и другими компонентами межклеточного матрикса, например хондроитинсульфатом, и лекарственными препаратами.

Как показали испытания, полученный по данному способу коллаген обладает низкой иммуногенной и аллергенной активностью. Он не способствует гиперцитокинообразованию. Макрофаги проявляют по отношению к введенному под кожу полученному по предлагаемому методу коллагену низкую адгезионную активность. При введении телячьего коллагена под кожу крысам по методу, указанному выше, имплантат также в течение недели колонизируется фибробластами и васкуляризуется.

Предлагаемый коллаген также пригоден для получения тканевых эквивалентов и коллагеновых конструкций. При добавлении к охлажденному нейтрализованному раствору коллагена, полученному, как указано выше, фибробластов легких эмбриона человека эти клетки после превращения коллагена с добавленными клетками в гель выдерживанием в течение 30 мин при температуре 37^oС хорошо себя в нем чувствуют и успешно его сокращают, так что он вполне пригоден для производства, в частности, дермального эквивалента по методу патента США 4485096.

Таким образом, данный коллаген можно считать пригодным для усиления соединительной ткани и лечения различных патологий как в сочетании с клетками или лекарствами, так и без них, т.е. полученный продукт может найти широкое применение в медицине.

Изобретение относится к медицине и биологии, точнее к способам получения коллагена, и может быть использовано при лечении различной тканевой патологии, для клеточного культивирования. Способ включает очистку и размельчение коллагенсодержащего сырья, неколлагеновые белки экстрагируют 0,3-0,02 М Na₂HPO₄, pH 8,7-9,1, коллаген экстрагируют органической кислотой, затем коллаген последовательно осаждают NaCl из кислого раствора, диализуют против 0,02 М Na₂HPO₄ и растворяют диализом против 1 М - 0,017 М уксусной кислоты. В качестве сырья используют кожу человека, любые сухожилия, шкуры животных, с поверхности которых удаляют волос с применением бактериальной протеазы группы Bacillus или Bacillus licheniformis. В качестве органической кислоты при экстракции коллагена используют уксусную, лимонную или муравьиную кислоту. Технический результат: способ позволяет получить значительный выход коллагена высокого качества, который обладает низкой иммуногенной и аллергенной активностью, не способствует гиперцитокинообразованию и обеспечивает эффективное лечение различных патологий ткани организма. 16 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения коллагена для лечения патологий тканей организма, включающий операции очистки и размельчения коллагенсодержащего сырья, экстрагирования неколлагеновых белков, экстрагирования коллагена, его очистки и растворения, отличающийся тем, что экстрагирование неколлагеновых белков производят 0,3-0,02 М Na₂HPO₄ pH 8,7-9,1, экстрагирование коллагена производят органической кислотой, очистку коллагена производят последовательно осаждением NaCl из кислого раствора и диализом против 0,02 М Na₂HPO₄, растворение коллагена производят диализом против 1-0,017 М уксусной кислоты. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют кожу человека. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют любые сухожилия. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют шкуры животных, с поверхности которых удаляют волос с применением бактериальной протеазы. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве бактериальной протеазы используют протеазу бактерий группы Bacillus. 6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве бактериальной протеазы используют протеазу из Bacillus licheniformis. 7. Способ по любому из пп. 4-6, отличающийся тем, что бактериальную протеазу применяют в количестве 0,125-0,1% от веса шкуры. 8. Способ по любому из пп. 4-7, отличающийся тем, что удаление волоса производят в трис-буфере рН 8. 9. Способ по любому из пп. 4-8, отличающийся тем, что удаление волоса производят при температуре не выше 12^oС. 10. Способ по любому из пп. 4-9, отличающийся тем, что операцию по удалению волоса производят в течение 48-72 ч. 11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что в качестве органической кислоты при экстракции коллагена используют уксусную, лимонную или муравьиную кислоту. 12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что при экстракции коллагена применяют 0,5-2 М уксусную кислоту. 13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что осаждение коллагена производят 0,6-1,8 M NaCl. 14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что осаждение коллагена NaCl производят два раза подряд. 15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что после первого осаждения осадок коллагена растворяют в 1 М уксусной кислоте. 16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что в процессе растворения коллагена производят стерилизацию коллагена добавлением к диализному раствору 1 М уксусной кислоты 0,5% хлороформа. 17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что вслед за растворением коллагена производят перевод раствора в 0,017 М уксусную кислоту путем трех последовательных диализов против указанной кислоты.